甲型h1n1流感病毒(2009)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒的制作方法剂盒[0002]流感病毒根据核蛋白(NP)和基质蛋白(M)不同分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒基因组由8条负链RNA节段构成，根据表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同分为16个HA亚型和9个NA亚型。[0003]甲型流感病毒为常见流感病毒，易变异，最具攻击力。可引起人的流感并有时引起肺炎和其他并发症，主要是气管和支气管纤毛柱状上皮细胞的坏死和脱落，有些病毒株能自然感染禽类和哺乳类动物。具有突然暴发，迅速蔓延，广泛流行的特点。世界范围的流感大流行共发生4次，其中1918-1919年世界大流行导致2000万人死亡。中国近半个世纪以来流感流行共计发生18次，其中3次为大流行。[0004]甲型HlNl流感病毒(2009)属正粘液病毒科甲型流感病毒属，典型病毒呈球状。2009年3月，墨西哥爆发HlNl疫潮，导致百人感染。疫情迅速传播到全世界。世界卫生组织把全球流感大流行警告级别提高到第5级。该流感是由A型流感病毒引起的猪呼吸道传染病，毒株包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的脱氧核糖核酸基因片段，同时拥有亚洲猪流感和非洲猪流感病毒特征。虽然猪体内已发现甲型HlNl流感病毒(2009)，但目前尚无证据表明动物为传染源。少数病例病情进展迅速，出现呼吸衰竭、多脏器功能不全或衰竭，甚至死亡。甲型HlNl流感病毒可直接从猪传染给人，亦可出现人际间传播，引起世界性大流行，是危害人类健康的一种重大疾病。[0005]目前常用的甲型HlNl流感病毒的实验室检查方法包括:1)免疫学检测方法，如快速流感抗原检测、免疫荧光法(或装配的IFA)，此法对操作者要求较高；2)细胞生物学检测方法，常用有鸡胚接种法和细胞培养法。此法对病毒分离法较敏感，但需要2-3周时间，无法实现早起快速诊断。3)分子生物学检测方法。目前有逆转录酶-聚合酶链式反应(Reverse Transcriptase-PCR,简称RT-PCR)和实时突光定量聚合酶链式反应(Real TimeFluorescent Quantified PCR,简称FQ PCR)，RT-PCR采用“基因扩增+扩增子检测”的操作模式，易引起扩增物的污染，常造成实验结果的假阳性或假阴性现象。实时荧光定量PCR虽在技术上解决了上述问题，其灵敏度和准确度较高，但操作复杂，检测成本相对昂贵，阻碍了其在发展中国家的大规模推广使用。[0006]实时突光核酸恒温扩增检测技术(SimultaneousAmplification and Testing,简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，核酸扩增和检测使用M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶和优化探针技术来同时实现。反转录酶用于产生靶标核酸(RNA)的一个DNA拷贝，T7RNA聚合酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化探针和这些RNA拷贝特异结合，从而产生突光，该突光信号可由检测仪器捕获。与检测DNA的实时突光PCR相比,不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42°C )，无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7 RNA多聚酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。此SAT技术前期已由 申请人:申请专利并授权(ZL 200810111479.0)，结合利用磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA的方法(ZL200810111478.6)，发明人制备了甲型HlNl流感病毒(2009)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。

[0007]本发明提供了一种检测周期短、高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定以及易于推广应用的甲型HlNl流感病毒(2009)的实时荧光核酸恒温扩增检测技术，包括专用引物、探针、试剂盒及其使用。
[0008]本发明所提供的甲型HlNl流感病毒(2009)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条捕获探针，一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生HlNl (2009)靶标核酸(H1N1 (2009)RNA)的DNA拷贝的HlNl (2009)检测引物T7和nT7，和一条用于与在Τ7 RNA聚合酶作用下根据所述HlNl (2009)靶标核酸(Η1Ν1 (2009) RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的HlNl (2009)检测探针。
[0009]所述捕获探针可与如序列表中序列I所示的甲型HlNl流感病毒(2009)的靶标核酸(Η1Ν1 (2009) RNA)序列特异结合，在有HlNl (2009)内标(Η1Ν1 (2009) IC RNA)时，其最好还可与该HlNl (2009)内标序列特异结合，所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述HlNl (2009)检测引物由Τ7引物和ηΤ7引物组成，Τ7引物序列如序列表中序列3所示，ηΤ7引物序列如序列表中序列4所示；所述HlNl (2009)检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。
[0010]进一步，所述试剂盒还 包含有M-MLV反转录酶和Τ7 RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和Τ7 RNA聚合酶存在于一 SAT酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述Τ7引物、ηΤ7引物和HlNl (2009)检测探针存在于一 HlNl (2009)检测液中。
[0011]再进一步所述试剂盒还包含有HlNl (2009)内标和内标检测探针；所述HlNl (2009)内标为竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并与HlNl (2009)靶标核苷酸(Η1Ν1 (2009)RNA)使用同一对引物(Τ7和nT7)，HlNl (2009)内标由序列表中序列7所示的HlNl (2009) IC RNA ;所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，且所述内标检测探针存在于HlNl (2009)检测液中。
[0012]更进一步，所述试剂盒包含裂解液、核酸提取液、洗涤液、HlNl (2009)反应液、HlNl (2009)检测液、SAT 酶液、HlNl (2009)阳性对照、HlNl (2009)阴性对照和 HlNl (2009)内标，其中:
[0013]裂解液:含硫酸铵((NH4) 2S04)和HEPES ；
[0014]核酸提取液:含捕获探针和磁珠；
[0015]洗涤液:含NaCl和SDS ;
[0016]HlNl (2009)反应液:含 dNTP 和 NTP ；
[0017]HlNl (2009)检测液:含T7引物、nT7引物、HlNl (2009)检测探针和内标检测探针；[0018]SAT酶液:含M-MLV反转录酶、T7 RNA聚合酶；
[0019]HlNl (2009)阳性对照；含甲型HlNl流感病毒(2009)HA基因的体外转录RNA稀释物；
[0020]HlNl (2009)阴性对照:不含有甲型HlNl流感病毒(2009)靶标核酸(H1N1 (2009)RNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液，如生理盐水；
[0021]HlNl (2009)内标:含HlNl (2009)内标RNA (序列如序列表中序列7所示)稀释物。
[0022]具体的，所述试剂盒中一个反应单位中上述各种试剂组成如下:
[0023](I)裂解液:HEPES 25_250mM，(NH4)2SO4 5-50mM ；
[0024](2)核酸提取液:HEPES 50-400mM, EDTA 40-200mM, LiCl 400_2000mM，捕获探针1-50 μ M (优选为 5-25 μ Μ)，磁珠 50-500mg/L (优选为 50-250mg/L)；[0025](3)洗涤液:HEPES 5_50mM，NaCl 50-500Mm, 1% SDS，EDTA 1-1OmM ；
[0026](4)H1N1(2009)反应液:Tris 10_50mM, MgCl2 10_40mM，dNTP 0.优选为0.5-5mM), NTP l_20mM(优选为 1-lOmM)，PVP40 1-10%, KCl 5-40mM ；
[0027](5) HlNl (2009)检测液:将HlNl (2009)检测引物和HlNl (2009)检测探针溶解在TE溶液(IOmM Tris和ImM EDTA的混合液)中配制而成，各引物和探针浓度在5_15pmol/反应均可；其中T7引物浓度优选为IOpmol/反应，nT7引物浓度优选为IOpmol/反应，HlNl (2009)检测探针浓度优选为7pmol/反应，内标检测探针浓度优选为7pmol/反应；
[0028](6) SAT 酶液:M-MLV 反转录酶 400-4000U/ 反应(优选为 500-1500U/ 反应)、T7RNA 聚合酶 200-2000U/ 反应(优选为 500-1000U/ 反应)、2_10mM HEPES pH7.5、10_100mMN-acetyl-L-cysteine>0.04-0.4mM zinc acetate、IO-1OOmM trehalose>40-200mMTris-HCl pH8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1% (v/v)Triton X-100和20-50%(v/v)glycerol ；
[0029](7) HlNl (2009)阳性对照；含IO2-1O5拷贝/mL甲型HlNl流感病毒(2009) HA基因的体外转录RNA稀释物；
[0030](8) HlNl (2009)阴性对照:不含有甲型HlNl流感病毒(2009)靶标核酸(H1N1 (2009)RNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液；
[0031](9) HlNl (2009)内标:含 IO2-1O5 拷贝/mL HlNl (2009) IC RNA (序列如序列表中序列7所示)体外转录RNA稀释物。
[0032]另一种更具体形式，所述试剂盒由A盒即标本处理单元和B盒即核酸扩增检测单元组成，其中A盒包装所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗涤液，B盒包装所述HlNl (2009)反应液、HlNl (2009)检测液、SAT 酶液、HlNl (2009)阳性对照、HlNl (2009)阴性对照及HlNl (2009)内标。
[0033]所述HlNl (2009)阳性对照中的体外转录的HlNl (2009) RNA以下述方法制备:
[0034]I)用化学合成法合成HlNl (2009)HA基因中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域(其核苷酸序列如序列表中序列8所示)；
[0035]2)将片段克隆到pGEM?-T载体中，构建HlNl (2009)阳性对照质粒；
[0036]3) HlNl (2009)阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5 α中，命名为pGEM?-T-HlNl (2009)菌株，贮存于 _70°C ；
[0037]4)从pGEM? -T-HlNl (2009)菌株中提取pGEM? -T-HlNl (2009)质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。
[0038]所述HlNl (2009)内标中的体外转录的HlNl (2009) IC RNA以下述方法制备:[0039]I)用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同HlNl (2009)靶标序列区域(其核苷酸序列如序列表中序列9所示)；
[0040]2)将片段克隆到pGEM?-T载体中，构建HlNl(2009)内标质粒；
[0041]3)HlNl (2009)内标质粒转化到大肠杆菌DH5 α中，命名为pGEM?-T-HlNl (2009) IC 菌株，贮存于 _70°C ；
[0042]4)从pGEM? -T-HlNl (2009) IC 菌株中提取pGEM? -T-HlNl (2009) IC 质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA。
[0043]所述甲型HlNl流感病毒(2009)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒中的专用试剂，为以下表示的物质之一:
[0044](I)可与序列表中序列I所示的甲型HlNl流感病毒(2009)的靶标核酸(H1N1 (2009)RNA)序列特异结合的捕获探针(TCO, Target Capture Oligo),所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；
[0045](2)用于在M-MLV反转录酶作用下产生HlNl (2009)靶标核酸(H1N1 (2009) RNA)的DNA拷贝的HlNl (2009)检测引物T7和nT7，Τ7引物序列如序列表中序列3所示，ηΤ7引物序列如序列表中序列4所示；
[0046](3)用于与在Τ7 RNA聚合酶作用下根据所述HlNl (2009)靶标核酸(Η1Ν1 (2009)RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的HlNl (2009)检测探针，所述HlNl (2009)检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭
基团；
[0047](4)内标和内标检测探针，内标为HlNl (2009)核苷酸序列(Η1Ν1 (2009) RNA)的竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并使用同一对引物(Τ7和ηΤ7引物)，内标的核苷酸序列如序列表中序列7所示HlNl (2009) IC RNA,内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。
[0048]所述试剂盒的使用方法，用于甲型HlNl流感病毒(2009)的实时荧光核酸恒温扩增检测，包括以下操作:
[0049]I)用裂解液裂解待测样品中的甲型HlNl流感病毒(2009)，得到含有甲型HlNl流感病毒(2009)核酸的裂解液；
[0050]2)向步骤I)的裂解液中加入核酸提取液，试剂盒内存在HlNl (2009)内标时，同时加入HlNl (2009) IC RNA,使捕获探针与靶标或内标核酸特异结合后再与磁珠结合，用洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到甲型HlNl流感病毒(2009)的核酸(RNA)和HlNl(2009)IC RNA ；
[0051]3)将步骤2)提取的甲型HlNl流感病毒(2009)的核酸(RNA)和HlNl (2009) ICRNA加入由HlNl (2009)反应液和HlNl (2009)检测液组成的第一阶段反应物中，在60°C下温育10分钟后，再在42°C下温育5分钟，然后加入第二阶段酶反应物SAT酶液，由此开始在42°C下继续温育50分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比为3:1;
[0052]4)根据荧光信号产生的时间和强度参照HlNl (2009)阳性对照、HlNl (2009)阴性对照和HlNl (2009)内标检测结果对待测样品进行定性检测。
[0053]本发明提供了一种甲型HlNl流感病毒(2009)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，使用该试剂盒进行检测，与现有的HlNl (2009)检测相比，具有以下优点:
[0054](I)高特异性、高纯度、低污染:针对HlNl (2009)靶核酸设计的优选捕获探针，可高效、特异性捕获HlNl (2009)的RNA。同时，由于采取封闭式的恒温放大检测系统，整个过程中无需打开反应体系，因而避免了扩增子的污染。
[0055](2)快速检测:将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，而且整个过程中没有温度的升降及循环，因而所需时间大大缩短，扩增检测只需要50分钟。
[0056](3)污染易控:与实时荧光PCR相比，本发明的扩增产物是RNA，RNA在自然界中极易降解，所以污染控制较容易。
[0057](4)设备简单，成本低:与实时荧光定量PCR相比，本发明所用的仪器无需升降温循环，因而设计和生产成本大幅降低。
[0058]综上所述，本发明试剂盒能够检测拭子中的HlNl (2009) RNA，具有特异性高、灵敏度高(可达lOOcopies/反应)、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)及快速检测(50分钟完成扩增检测)的特点，将在甲型HlNl流感病毒早期感染的临床诊断中发挥重要作用。
[0059]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。


[0060]图1灵敏度的荧光检测结果
[0061]图2特异性荧光检测结果
[0062]图3临床咽拭子样本的靶标荧光检测结果
[0063]图4临床咽拭子样本的内标荧光检测结果
[0064]图5甲型HlNl流感病毒(2009) RNA检测试剂盒(荧光PCR法)的检测结果
[0065]本发明甲型HlNl流感病毒(2009)检测技术，将特异性靶标捕获技术与实时荧光核酸恒温扩增(SAT)技术结合而形成。
[0066]本发明选取甲型流感病毒HlNlHA基因保守区段，通过设计专用的捕获探针，高效、特异性捕获HlNl (2009)的RNA ;核酸扩增使用M-MLV反转录酶和T7 RNA多聚酶来同时实现，反转录酶用于产生靶标核酸RNA的一个DNA拷贝，T7 RNA多聚酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化检测探针和扩增后产生的RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。
[0067]本发明中的专用引物和探针包括:
[0068](I)捕获探针:一条可与序列表中序列I所示的甲型HlNl流感病毒(2009)的靶标核酸(H1N1 (2009)RNA)序列特异结合的捕获探针(TCO，Target Capture Oligo)，在有HlNl (2009)内标(H1N1 (2009) IC RNA)时，其还可与该HlNl (2009)内标序列特异结合；所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
[0069](2) HlNl (2009)检测引物:一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生HlNl (2009)靶标核酸(H1N1 (2009) RNA)的DNA拷贝的HlNl (2009)检测引物，所述HlNl (2009)检测引物由T7引物和nT7引物组成，Τ7引物序列如序列表中序列3所示，ηΤ7引物序列如序列表中序列4所示；
[0070](3) HlNl (2009)检测探针:一条用于与在Τ7 RNA聚合酶作用下根据所述HlNl (2009)靶标核酸(Η1Ν1 (2009) RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的HlNl (2009)检测探针，所述HlNl (2009)检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。
[0071]为便于进行结果分析，还包括:⑷一条内标检测探针和HlNl (2009)内标，内标检测探针为在使用HlNl (2009)内标时与该内标配合使用的内标检测探针，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；Η1Ν1 (2009)内标为HlNl (2009)核苷酸序列(Η1Ν1 (2009) RNA)的竞争性内标，同时与所述捕获探针特异性结合，并使用同一对引物(Τ7和ηΤ7引物)。HlNl (2009)内标的核苷酸序列如序列表中序列7所示，命名为HlNl (2009) IC RNA (IC含义为内标)。
[0072]基于以上设计，本发明进一步提供一种甲型HlNl流感病毒(2009)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。
[0073]该试剂盒，至少包含所述捕获探针(序列2)，一对所述Τ7引物(序列3)和ηΤ7引物(序列4)，以及一条所述HlNl (2009)检测探针(序列5)。
[0074]进一步，所述试剂盒还可包含有M-MLV反转录酶和Τ7 RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和Τ7 RNA聚合酶存在于SAT酶液中，所述捕获探针存在于核酸提取液中，所述Τ7弓丨物、ηΤ7引物和HlNl (2009)检测探针存在于HlNl (2009)检测液中。
[0075]再进一步，所述试剂 盒还可包含竞争性HlNl (2009)内标(序列7)和内标检测探针(序列6)，所述的内标检测探针存在于HlNl (2009)检测液中。
[0076]更具体来讲，所述试剂盒包含裂解液、核酸提取液、洗涤液、HlNl (2009)反应液、HlNl (2009)检测液、SAT 酶液、HlNl (2009)阳性对照、HlNl (2009)阴性对照和 HlNl (2009)内标，各组分说明如下:
[0077](I)裂解液:用于裂解和保存待测样品中的甲型流感病毒(Η1Ν1 (2009))，为含有去垢剂和HEPES缓冲液的溶液，去垢剂主要为硫酸铵((NH4)2SO4，优选为5_50mM)；
[0078](2)核酸提取液:用于提取和纯化HlNl (2009)病毒RNA，为含捕获探针1-50 μ M(优选为5-25 μ Μ)和磁珠50_500mg/L(优选为50_250mg/L)的水溶液；
[0079](3)洗涤液:用于磁珠清洗，为含Iwt % SDS的水溶液。
[0080](4) HlNl (2009)反应液:SAT 扩增所需组分，含 dNTP 0.l_10mM(优选为 0.5_5mM)和NTPl-20mM(优选为1-1OmM)的水溶液；
[0081](5)HlNl (2009)检测液:含SAT扩增所需引物和探针的水溶液，各引物或探针的浓度在5-15pmol/反应均可，其中T7引物浓度优选为IOpmol/反应，nT7引物浓度优选为IOpmol/反应，HlNl (2009)检测探针浓度优选为7pmol/反应，内标检测探针浓度优选为7pmol/ 反应；
[0082](6) SAT酶液:SAT扩增所需多酶反应体系，主要含M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)、T7 RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应)；[0083](7) HlNl (2009)阳性对照；含IO2-1O5拷贝/mL甲型HlNl流感病毒(2009) HA基因的体外转录RNA稀释物；
[0084](8) HlNl (2009)阴性对照:不含有甲型HlNl流感病毒(2009)靶标核酸(H1N1 (2009)RNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液，如生理盐水；
[0085](9) HlNl (2009)内标:含 IO2-1O5 拷贝 /mL HlNl (2009)内标 RNA (序列 7)，是HlNl (2009)核苷酸序列(H1N1 (2009)RNA)的竞争性内标，为体外转录RNA(H1N1 (2009) ICRNA)稀释物。
[0086]以上所述试剂盒中各组成的进一步说明如下:
[0087]裂解液的主要有效成分是去垢剂，高浓度去垢剂的存在能够使RNase迅速失活，有效保存RNA。核酸提取液是利用了磁珠分离法进行核酸提取，其主要成分为磁性颗粒和捕获探针。捕获探针一端与靶标互补，一端与磁性颗粒互补连接，在核酸提取过程中，细菌裂解释放出的核酸与核酸提取液中的磁性颗粒特异结合，在不需要传统的离心操作的情况下，通过洗涤液清洗磁性颗粒而获得纯净的病毒靶标核酸(RNA)。病毒RNA的提取通过特异性吸附原理来实现。
[0088]HlNl (2009)检测液中HlNl (2009)检测探针为分子信标，是一类高特异性、高敏感性的分子探针，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型或茎环结构，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎，分子信标探针与线性的TaqMan探针相比，因其发夹结构的打开需要一定的力，因而特异性要好于线性探针。
[0089]由于SAT扩增易受多种因素影响而使扩增失败，使试剂盒使用人员判断失误得出错误的结论，本发明的试剂盒中设置了 HlNl (2009)阳性对照、HlNl (2009)阴性对照和HlNl (2009)内标。其中，H lNl (2009)阳性对照和HlNl (2009)内标为体外转录的RNA，不具有生物学活性。
[0090]通过检测阳性对照，可证明试剂盒检测方法及材料无误，保证检测的准确性，同时可以监测每次检测的重复性和稳定性及试剂盒批次间的差异。此外，通过阳性对照品可制备临界弱阳对照(以生理盐水和裂解液按1:1混合成为稀释液，稀释阳性对照1000倍作为临界弱阳对照)，可以提示处于临界值状态时的检验操作情况，通过临界弱阳对照定期检测SAT实验室，可进行室内质量控制，以防止检测过程出现漏检(假阴性)的情况。HlNl (2009)内标作为HlNl (2009)RNA的竞争性内标，其最主要的作用就是控制假阴性结果的发生，通过检测加入有内标的样本，可了解整个扩增反应体系是否受抑制，更好的提示假阴性。阴性对照可排除假阳性，在正确使用试剂盒检测方法和材料情况下，可保证检测的特异性。
[0091]利用以上试剂盒对甲型HlNl流感病毒(2009)进行实时荧光核酸恒温扩增检测，包括以下步骤:
[0092]I)用裂解液裂解待测样品中的甲型HlNl流感病毒(2009)，得到含有甲型HlNl流感病毒(2009)核酸的裂解液；
[0093]2)向步骤I)的裂解液中加入核酸提取液，试剂盒内存在HlNl (2009)内标时，同时加入HlNl (2009) IC RNA,使捕获探针与靶标或内标核酸特异结合后再与磁珠结合，用洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到甲型HlNl流感病毒(2009)的核酸(RNA)和HlNl(2009)IC RNA ；[0094]3)将步骤2)提取的甲型HlNl流感病毒(2009)的核酸(RNA)和HlNl (2009) ICRNA加入由HlNl (2009)反应液和HlNl (2009)检测液组成的第一阶段反应物中，在60°C下温育10分钟后，再在42°C下温育5分钟，然后加入第二阶段酶反应物SAT酶液，由此开始在42°C下继续温育50分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比为3:1;
[0095]4)根据荧光信号产生的时间和强度参照HlNl (2009)阳性对照、HlNl (2009)阴性对照和HlNl (2009)内标检测结果对待测样品进行定性检测。
[0096]在上述检测操作中，所述步骤I)中的待测样品为咽拭子或鼻拭子。
[0097]所述步骤4)中的HlNl (2009)阳性对照为含IO2-1O5拷贝/mL甲型HlNl流感病毒(2009) HA基因的体外转录RNA稀释物；H1N1 (2009)阴性对照为不含有甲型HlNl流感病毒(2009)靶标核酸(H1N1 (2009)RNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液；H1N1 (2009)内标为含IO2-1O5拷贝/mL HlNl (2009)内标RNA (序列7)稀释物。
[0098]实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0099]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例中所用主要原料SAT酶液、阳性对照及内标的体外转录RNA由美国RD Biosciences公司提供，7500型PCR仪为美国ABI公司产品，NTPs, dNTPs等试剂和其他仪器均为常规可商购产品。
[0100]实施例1、用于实时荧光核酸恒温扩增检测甲型Η1Ν1流感病毒(2009)的专用引物和探针的设计
[0101]本发明选择HlNl (2009)病毒HA基因中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域(其核苷酸序列如序列表中序列I所示)，根据引物探针设计原理，使用DNAATAR、DNAman软件和人工设计用于实时荧光核酸恒温扩增检测甲型HlNl流感病毒(2009)的专用引物和探针序列，得到如下具体序列:
[0102](I) 一条可与如序列表中序列I所示的甲型HlNl流感病毒(2009)的靶标核酸(H1N1 (2009)RNA)序列特异结合的捕获探针(TCO, Target Capture Oligo),所述捕获探针的核苷酸序列为 5，-CCAU腳⑶GAA⑶AGA腳UAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3，(序列表中序列2)；
[0103](2) 一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生HlNl (2009)靶标核酸(H1N1 (2009)RNA)的DNA拷贝的HlNl (2009)检测引物，所述HlNl (2009)检测引物由T7引物和nT7引物组成，17 引物序列为 5，-aatttaatacgactcactatagggagaACCAGATCCAGCATTTCTTTCCATTG-3，(序列表中序列3), nT7引物序列为5’ -AATAACATTCGAAGCAACTGG-3’ (序列表中序列4)；
[0104](3) —条用于与在Τ7 RNA聚合酶作用下根据所述HlNl (2009)靶标核酸(Η1Ν1 (2009) RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的HlNl (2009)检测探针，所述HlNl (2009)检测探针的核苷酸序列为5’ -cacGGUACCGAGAUAUGCccgug-3’(序列表中序列
5)，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。
[0105](4)为便于进行结果分析，还配合试剂盒中增加的竞争性H1N1(2009)内标(序列7)，设计了竞争性内标检测探针，HlNl (2009)内标与HlNl (2009)靶标核苷酸(H1N1 (2009) RNA)拥有相同的引物结合区，两引物之间的核酸序列或排列不同，使其不能与检测探针结合，但能与内标探针结合，所述HlNl (2009)内标可通过HlNl (2009)靶标模板定点突变构建获得，可与捕获探针特异性结合，所述内标检测探针为与HlNl (2009)检测探针序列、荧光标记不同，但碱基数一致的探针，所述的内标检测探针的核苷酸序列为5’ -CCAGGGUAAUUCGGCACGUCCUGG-3’ (序列表中序列6)，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。
[0106]实施例2、制备甲型HlNl流感病毒(2009)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒
[0107]利用实施例1所提供的专用引物和探针，得到本发明甲型HlNl流感病毒(2009)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。该试剂盒包含有捕获探针(TCO，Target CaptureOligo)、T7引物、nT7引物、HlNl (2009)检测探针、M-MLV反转录酶和Τ7 RNA聚合酶；试剂盒存在内标时，还包括内标检测探针。
[0108]所述捕获探针存在于核酸提取液中，所述Τ7引物、ηΤ7引物和HlNl (2009)检测探针、内标检测探针存在于HlNl (2009)检测液中，所述M-MLV反转录酶和Τ7 RNA聚合酶存在于SAT酶液中，具体来讲，所述试剂盒分为2-30°C储存的A盒(标本处理单元)和-15~_35°C储存的B盒(核酸扩增检测单元)，A盒包括裂解液、核酸提取液和洗涤液，B盒包括HlNl (2009)反应液、HlNl (2009)检测液、SAT酶液、HlNl (2009)阳性对照、HlNl (2009)阴性对照，如果存在内标，B盒还包括HlNl (2009)内标，主要成分如下:
[0109]A盒(标本处理单元)组成为:[0110]裂解液；含硫酸铵((NH4) 2S04)和HEPES ；
[0111]核酸提取液:含捕获探针1-50 μ M(优选为5-25 μ Μ)和磁珠50_500mg/L(优选为50-250mg/L)；
[0112]洗涤液:主要含Iwt % SDS。
[0113]B盒(核酸扩增检测单元)组成为:
[0114]HlNl (2009)反应液:含 dNTP 0.1-1OmM(优选为 0.5_5mM)，NTP l-20mM(优选为1-1OmM)；
[0115]HlNl (2009)检测液:含引物和探针，各引物和探针的浓度在5_15pmol/反应均可，其中T7引物浓度优选为IOpmol/反应，nT7引物浓度优选为IOpmol/反应，HlNl (2009)检测探针浓度优选为7pmol/反应，内标检测探针浓度优选为7pmol/反应；
[0116]SAT 酶液:含 M-MLV 反转录酶 400-4000U/ 反应(优选为 500-1500U/ 反应)，T7 RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应);
[0117]HlNl (2009)阳性对照；含IO2-1O5拷贝/mL甲型HlNl流感病毒(2009) HA基因的体外转录RNA稀释物；
[0118]HlNl (2009)阴性对照:不含有甲型HlNl流感病毒(2009)靶标核酸(H1N1 (2009)RNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液，如生理盐水；
[0119]HlNl (2009)内标:含 IO2-1O5 拷贝 /mL HlNl (2009) IC RNA 稀释物(序列表中序列7)。
[0120]试剂盒中所包含的所有试剂均可按提示以常规方法制备取得或商业购买得到。
[0121]具体来讲，每一反应单位中，所述试剂盒各种试剂的具体组配如下:
[0122](I)裂解液:为裂解和保存人咽拭子和鼻拭子中的甲型HlNl流感病毒(2009)(H1N1 (2009))，含有硫酸铵和HEPES缓冲液的溶液，具体包含HEPES25_250mM，(NH4)2SO45-50mM ；[0123](2)核酸提取液:为提取甲型HlNl流感病毒(2009) (H1N1 (2009)) RNA的含有oligo (dT)包被的磁珠和特异结合靶标核酸(H1N1 (2009) RNA)的一段RNA序列的溶液，具体包含 HEPES 50-400mM, EDTA 40-200mM, LiCl 400-2000mM，捕获探针 1-50 μ M(优选为5-25 μ Μ)，磁珠 50-500mg/L (优选为 50_250mg/L)；
[0124](3)洗涤液:为含 SDS、NaCl 的溶液，具体包含 HEPES 5_50mM，NaCl 50-500Mm, 1%SDS 1-lOmM, EDTA 1-1OmM ；
[0125](4) HlNl (2009)反应液:为含dNTPs和NTPs扩增所需组份，具体包含Trisl0-50mM, MgCl2 10-40mM, dNTP 0.l-10mM(优选为 0.5_5mM)，NTP l-20mM(优选为
1-lOmM), PVP40 1-10%, KCl 5-40mM ；
[0126](5) HlNl (2009)检测液:将恒温扩增时必需的HlNl (2009)检测引物和HlNl (2009)检测探针溶解在TE溶液(IOmM Tris和ImM EDTA的混合液)中配制而成，引物和探针浓度在5-15pmol/反应均可，其中T7引物浓度优选为IOpmol/反应，nT7引物浓度优选为IOpmol/反应，HlNl (2009)检测探针浓度优选为7pmol/反应，内标检测探针浓度优选为7pmol/ 反应；
[0127](6) SAT酶液:为恒温扩增时必需的多酶组分体系，含M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)、T7 RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应)、2_10mM HEPES ρΗ7.5、IO-1OOmM N-acetyl-L-cysteine>0.04-0.4mMzinc acetate、IO-1OOmM trehalose,40-200mM Tris-HCl pH8.0、40-200mM KCU0.01-0.5mM EDTA、0.1-1 % (v/v) Triton X-100 和 20-50% (v/v) glycerol ；
[0128](7) HlNl (2009)阳性对照；含IO2-1O5拷贝/mL甲型HlNl流感病毒(2009) HA基因的体外转录RNA稀释物；
[0129](8) HlNl (2009)阴性对照:不含有甲型HlNl流感病毒(2009)靶标核酸(H1N1 (2009)RNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液，如生理盐水；
[0130](9)如果存在内标，HlNl (2009)内标:含 IO2-1O5拷贝/mL HlNl (2009)内标RNA(序列表中序列7)。
[0131]HlNl (2009)阳性对照中的体外转录的HlNl (2009) RNA，可以通过多种方法制备所得，其中一种制备方法如下:
[0132]I)用化学合成法合成HlNl (2009)HA基因中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域(其核苷酸序列如序列表中序列8所示)；
[0133]2)将片段克隆到pGEM?-T载体中，构建HlNl (2009)阳性对照质粒；
[0134]3) HlNl (2009)阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5 α中，命名为pGEM?-T-HlNl (2009)菌株，贮存于 _70°C ；
[0135]4)从pGEM? -T-HlNl (2009)菌株中提取pGEM? -T-HlNl (2009)质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。
[0136]HlNl (2009)内标中的体外转录的HlNl (2009) IC RNA，可以通过多种方法制备所得，其中一种制备方法如下:
[0137]I)用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同HlNl (2009)靶标序列区域(其核苷酸序列如序列表中序列9所示)；
[0138]2)将片段克隆到口0￡1^?-丁载体中，构建!1謂1(2009)内标质粒；[0139]3)HlNl (2009)内标质粒转化到大肠杆菌DH5 α中，命名为pGEM?-T-HlNl (2009) IC 菌株，贮存于 _70°C ；[0140]4)从pGEM? -T-HlNl (2009) IC 菌株中提取pGEM? -T-HlNl (2009) IC 质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA。
[0141]实施例3、甲型HlNl流感病毒(2009)的实时荧光核酸恒温扩增检测灵敏度
[0142]用本发明试剂盒(组成见实施例2，试剂盒内不存在HlNl (2009)内标，检测液中也不存在内标检测探针)测定浓度为I X IO4COpies/反应、I X IO3COpies/反应、I X IO2Copies/反应、IOcopies/反应的甲型HlNl流感病毒(2009)阳性对照RNA，确定灵敏度下限。具体步骤如下:
[0143](I)稀释
[0144]将I X IO4Copies/反应的甲型HlNl流感病毒(2009)阳性参考品RNA，10倍梯度稀释至 I X IO3Copies/ 反应、I X IO2Copies/ 反应、IOcopies/ 反应。
[0145](2)核酸提取
[0146]2.1在每个样品处理管(1.5mL离心管)中加入200 μ I裂解液(含HEPES 35mM,(NH4)2SO4 20mM), 200 μ I流感病毒阳性参考品稀释液，用裂解液裂解甲型HlNl流感病毒(2009)(模拟样本处理)，得到含有甲型HlNl流感病毒(2009)核酸的裂解液。
[0147]2.2在样品处理管(1.5mL离心管)中加入100 μ I核酸提取液(含HEPES IOOmM,EDTA 50mM, LiCl 500mM,捕获探针20 μ Μ，磁珠200mg/L)混匀，60°C保温5分钟，室温放置10分钟。
[0148]2.3将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置5-10分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。加入ImL洗涤液(含HEPES50mM，NaCl IOOmM, I % SDSjEDTA 5mM)振荡均匀后静置5_10分钟，弃液体，保留磁珠，反复2次。
[0149]2.4将样品处理管移离磁珠分离装置，管中为磁珠-核酸复合物，备用(此步应清晰可见磁珠)。
[0150](3) SAT核酸扩增检测
[0151]3.1向样品处理管中加入40 μ I反应检测液(40 μ I HlNl (2009)反应液+2.5 μ IHlNl (2009)检测液)洗涤磁珠。HlNl (2009)反应液具体包含Tris 30mM, MgCl220mM, dNTP 5mM, NTP 8mM, PVP40 5%, KCl 25mM ；H1N1 (2009)检测液中 T7 引物浓度为IOpmol, ηΤ7引物浓度为lOpmol，HlNl (2009)检测探针浓度为7pmol，内标检测探针浓度为7pmolο
[0152]3.2取振荡混匀的上述反应检测液30 μ I加至洁净微量反应管，用7500型PCR仪(美国ABI公司产品)60°C保温10分钟，42°C保温5分钟；向微量反应管中加入10 μ I已预热至42°C的SAT酶液，1200rpm振荡15秒钟混匀。SAT酶液中含M-MLV反转录酶1200U，T7RNA 聚合酶 800U/ 反应，IOmM HEPES pH7.5，20mMN-acetyl-L-cysteine (N-乙酰-L-半胱氨酸)，0.25mM zinc acetate (乙酸锋)、30mMtrehalose (海藻糖)、IOOmM Tris-HCl ρΗ8.0,200mM KCl，0.ImM EDTA,0.8% (v/v) Triton X-100 和 40% (v/v) glycerol (丙三醇)；
[0153]3.3将微量反应管快速转至恒温荧光检测仪器，42 0C反应50分钟，设定每I分钟检测一次荧光，共检测50次。
[0154](4)结果判定[0155]根据PCR扩增结果得到的曲线，设定阀值线，读取dt值，判定结果。
[0156]阈值设定:以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数(与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似)
[0157]①阳性结果判定:
[0158]FAX通道:dt < 45的样本为阳性；45 < dt < 50的样本建议重新检测，检测结果:dt < 50的样本为阳性。
[0159]②阴性结果判定:
[0160]阴性结果判定:FAX通道:dt无数值或为50，则为阴性。
[0161](5)结果
[0162]图1显示灵敏度的检测图，为保证检测结果的可重复性，每个阳性参考品都重复检测2次，结果显示:当阳性参考品的浓度在lOcopies/反应时，不可同时检出。而浓度在lOOcopies/反应以上是，均可重复检出。甲型HlNl流感病毒(2009)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒的灵敏度可达lOOcopies/反应。
[0163]实施例4、甲型HlNl流感病毒(2009)的实时荧光核酸恒温扩增检测特异性
[0164]本检测模式为本发明的另一个应用:试剂盒组成同实施例2，选取HlNl (2009)样本和3例阴性样本:柯萨奇16型病毒(CA16)、肠道病毒71型(EV71)、肺炎支原体(MP)，另设阴性对照、阳性对照各一个进行检测。检测方法及具体步骤同实施例3。
[0165]检测结果如图2，阳性对照和HlNl (2009)样本dt值分别为10.2，13.8，并出现扩增曲线，可判定为阳性；而3个阴性样本和阴性对照的扩增曲线平直且与基线无交叉，可明确判定为阴性；3个阴性样本为柯萨奇16型病毒(CA16)、肠道病毒71型(EV71)、肺炎支原体(MP)。
[0166]实施例5、临床样本咽拭子的实时突光核酸恒温扩增检测
[0167]本检测模式为本发明的另一个应用:试剂盒组成同实施例2 (试剂盒含有IXlO5拷贝/mL HlNl (2009)内标，检测液内含有7pmol/反应的内标探针)，对编号1_5甲型HlNl流感病毒(2009)咽拭子标本，以及各设一个阴性对照和阳性对照进行检测，具体包括以下检测步骤:
[0168](I)样本采集
[0169]由临床医师根据实际情况进行标本采集，检测标本为咽拭子，采集方法为:专用采样棉签擦拭咽后壁及两侧咽扁桃体部分，将拭子侵入3-5mL生理盐水中，密封送检。样本采集后48小时内4°C保存送至流感监测网络实验室(或者_70°C保存待测，一周内送达)。
[0170](2)核酸提取
[0171]试剂盒内包含HlNl (2009)内标，故在核酸处理中，在每个样品处理管中加入100 μ I核酸提取液，需同时加入10 μ I内标溶液，再混匀。其他具体操作步骤同实施例2。
[0172](3) SAT扩增检测[0173]同实施例3。
[0174](4)结果判定:
[0175]根据PCR扩增结果得到的曲线，设定阀值线，读取dt值，判定结果。
[0176]阈值设定:以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数(与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似)[0177]③阳性结果判定:
[0178]Fl通道(FAX通道):dt≤45的样本为阳性；45 < dt < 50的样本建议重新检测，
[0179]检测结果Fl通道:dt < 50的样本为阳性。
[0180]④阴性结果判定:F1通道dt无数值或为50，同时F2通道(VIC通道，ABI仪器只可选VIC通道，但VIC与HEX波长相近):dt ≤ 45，则为阴性。
[0181]质量控制:每次检测均设置阳性对照和阴性对照，且结果应同时满足阳性对照Fl通道:dt < 45 ;阴性对照Fl通道:dt无数值或为50，同时F2通道:dt < 45，否则此次检测结果视为无效。
[0182]另同步进行对照检测:
[0183]用上海之江生物科技有限公司生产的甲型HlNl流感病毒(2009) RNA检测试剂盒(荧光PCR法)(国食药监械(准)字2009第3401022号)并参照试剂盒说明书对咽拭子中的甲型HlNl流感病毒(2009)RNA进行检测，其具体方法包括以下步骤(咽拭子样本采集同上):
[0184](I)标本的核酸裂解处理
[0185]取100 μ I标本置于1.5ml离心管中，加入300 μ I裂解液(Trizol)，再加入100 μ I氯仿，混匀器上振荡混匀5sec或颠倒混匀15次。13，OOOrpm离心，15min吸取上层液体,加入等体积异丙醇.颠倒混匀。13，OOOmm离心15min,轻轻倒去上清:加入700ul 75%乙醇，颠倒洗漆。13，OOOrpm离心IOmin,倒置于吸水纸上,弃尽液体。4，OOOrpm离心5sec,将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量吸干液体，加入20 μ 1DEPC-H20溶解RNA。
[0186](2) PCR 检测
[0187]2.1试剂配制:取ηΧ 19 μ I HlNl (2009)核酸荧光PCR检测混合液与ηΧ I μ IRT-PCR酶(η为反应管数)，振荡裩匀数秒，3000rpm离心数秒。
[0188]2.2加样:取上述混合液20 μ I置于PCR管中，然后将标本RNA、DEPC_H20 (阴性对照)、阳性对照品各5 μ I分别加入PCR管中，盖好管盖，立即进行PCR扩增反应。
[0189]2.3PCR扩增:反应管置于定量荧光PCR仪上，荧光通道检测选用:FAM通道，推荐循环参数设置:45°C X IOmin ；95°C X 15min ;再按 95°C X15sec-60°C X60sec，循环 40 次；单点突光检测在60°C,反应体系为25 μ I。
[0190](3)判定结果
[0191]基线和阈值设定基线调整取6-15个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过DEPC-H20检测荧光曲线的最高点。应结合Ct值和典型S型曲线的形态对结果进行判断。
[0192]①扩增曲线呈S型，且Cycle threshold栏显示≤38 (ABI7500)，则判定为阳性；
[0193]②若Ct值较高而又出现不规则曲线时，判断为阴性；
[0194]若仪器的结果显示栏显示在38~40之间，则需重复测定:若结果仍在38~40之间，则判为甲型流感HlNl病毒(2009)阴性。
[0195]使用本发明试剂盒的检测结果如图3(F1荧光通道)和图4(F2荧光通道)所示，荧光素通道Fl为FAM，F2为VIC，42°C反应50分钟，设定每I分钟检测一次荧光，共检测50次。根据Fl通道和F2通道的dt值情况，判定样本2，4检测为阴性，样本1，3，5为阳性(样本2，4图3显示为阴性，图4显示有信号，正说明内标可检测出，反应体系没有受环境影响，排除假阴性)，其结果与目前已上市试剂盒检测结果(见图5，Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，在之江试剂盒中的Ct，指在95°C15sec,60°C 60sec的过程中循环了 40次，采集了 40次荧光。这个过程中涉及升温和降温，I个循环约2~3分钟，因此整个PCR扩增反应至少100分钟)完全相同。
[0196]本发明试剂盒用于检测临床样本咽拭子中的甲型HlNl流感病毒(2009)(H1N1 (2009))准确性高，扩增检测时间仅需50分钟，且本试剂盒扩增产物为RNA，在环境中易降解，低污染。故本试剂盒具有周期短、高灵敏度、高特异性、低污染和反应稳定的特点。
[0197]根据本发明的公开内容，本领域的熟练技术人员无须过多实验即可对本发明所要求保护的甲型HlNl流感病毒(2009)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对本发明进行详细描述，但并不足构成对本发明限制。本领域的熟练技术人员用显而易见的相似替代物或改造，或用某些在化学上或生物上结构功能相关的制剂替代在此描述的制剂，或对本发明相关内容进行变动，但不超出本发明的精神、范围和思想，均 落入本发明要求保护的范围。