专利名称：粮食与甘蔗汁发酵的非蒸馏酒及其工艺的制作方法以果品为原料发酵酿酒，会带来浓郁的果香等各种私人有好感的香气。例如，本发明人的中国专利200910114150公开了以桂圆和甘蔗汁为原料生产白酒的方法，该酒可以带有桂圆和甘蔗的清香。又如，本发明人的中国专利200910114151公开了以桂圆和甘蔗汁为原料生产白兰地酒的方法，该酒也可以带有桂圆和甘蔗的清香。然而，这些酒使用的原料较粮食昂贵，造成成本较高。尽管有些酿酒酵母本身能够给酒带来一些独特的风味，但是这类酵母往往却失酿酒产业中所需的一些优良工艺特性， 如絮凝性。以这些酵母出发进行诱变筛选，尽管可以改善工艺特性，但是风味特性往往会在诱变中失去。为此，本发明人经过长期而艰苦的研究，开发了新的用粮食和甘蔗汁为原料发酵非蒸馏酒的工艺。该工艺制备的酒不但能够保持酿酒酵母所带来的独特风味，从而减少甚至无需较为昂贵的原料的使用，而且具有优良的工艺特性，方便酿造过程，进一步节约了成本。更为令人意外的是，该工艺中所使用的酵母的絮凝性随着发酵酒液中含糖量的变化而变化，而且在含糖量高的时候絮凝率低，有益于充分发酵，而在含糖量低的时候絮凝率高， 便于发酵结束后酒液的分离。
本发明要解决的技术问题在于提供新的用粮食和甘蔗汁为原料发酵非蒸馏酒的工艺。另外，本发明还提供了用该工艺生产的非蒸馏酒以及该工艺中所使用的酵母和基因。具体而言，在第一方面，本发明提供了用粮食和甘蔗汁为原料发酵制备非蒸馏酒的方法，其包括(1)取大米粉碎后，加水浸泡并煮熟，然后加入α淀粉酶进行液化，得到液化料；(2)将步骤(I)获得的液化料调节成酸性，加入糖化酶进行糖化，得到糖化液；(3)向步骤(2)获得的糖化液加入具有絮凝优化特性的酵母和发酵助剂，于23 35°C 密封发酵12 60小时，得到初步发酵液；(4)向步骤(3)获得的初步发酵液加入甘蔗汁，密封发酵至残糖含量<4克/L时，得到酒液；和(5)过滤步骤(4)获得的酒液的上清液，任选进一步对所述上清液进行灭菌和/或勾兑所述上清液，得到非蒸馏酒。在本文中，絮凝优化特性指的是酵母在含糖环境下絮凝率低，而在无糖环境下絮凝率高。这种特性对于酿酒过程是尤其有益的。因为，在发酵初期，发酵液中含糖量高，此时不具有絮凝性质或絮凝率低的酵母，将尽量使其在发酵液中保持悬浮状态，从而使得发酵更为充分，提高发酵效率；在发酵结束时，发酵液中含糖量低，此时具有絮凝性质或絮凝率高的酵母，将容易沉淀到发酵罐底部，便于发酵终止后收集酒体。优选在本发明第一方面的方法中，大米和甘蔗汁的重量体积比(kg/L)为I 10 I 10，优选为3 8 3 8，更优选为I : I。在本发明中，大米和甘蔗汁分别在不同的步骤加入。优选在本发明第一方面的方法中，甘蔗汁的糖度为5 20° Bx，优选为10 18° Bx，更优选为15° Bx。甘蔗汁的糖度可以通过新鲜榨出的甘蔗汁加水稀释调节。在本发明中，液化和糖化可以按照本领域常规的粮食液化和糖化过程进行。其中所用的试剂，如淀粉酶和糖化酶都已经是很成熟的商品了。优选在本发明第一方面的方法中，液化的条件是α淀粉酶用量为5 15U/克大米原料，于50 60°C搅拌15 60分钟，然后升温至85 97°C继续搅拌20 60分钟。也优选在本发明第一方面的方法中，糖化的条件是于50 65°C加入糖化酶100 300U/克大米原料，保温45 120分钟。 优选在本发明第一方面的方法中，调节成酸性是乳酸调节pH至4. O 4. 8，优选调节pH至4. I 4. 5,更优选调节pH至4. 2。优选在本发明第一方面的方法中，具有絮凝优化特性的酵母是包含絮凝蛋白变体基因的酵母，所述絮凝蛋白变体基因的核苷酸序列如SEQ ID No:l所示。野生型絮凝蛋白的氨基酸序列如GenBank登录号CAA55024. I所示，其能赋予不具有絮凝性质的酵母以絮凝性质。尽管野生型絮凝蛋白给酵母赋予的絮凝性质较强，但是这种性质在含糖环境下也很强，这样造成了发酵过程中酵母也容易沉淀在发酵罐底部，造成发酵效率低下，因此实践中并没有得到推广。本发明人经过长期研究，偶然在我们的发酵中发现了一株具有絮凝优化特性的酵母，经过委托研究，发现其是絮凝蛋白相对于野生型絮凝蛋白发生了至少三处氨基酸位点的突变。将该絮凝蛋白变体基因导入其他现有酵母，如不具有絮凝性质的酵母，能够赋予该酵母絮凝优化特性，而且不改变该酵母原有发酵风味。因此，使得具有发酵风味但不具有絮凝优化特性的现有酵母能够得以重新利用。优选在本发明第一方面的方法中，发酵助剂是Fermaid K。这是对酵母发酵很有益的发酵助剂，目前已经商品化。在本发明第一方面的方法中，密封发酵至残糖含量< 4克/L，通常需要在18 22°C，密封发酵9 12天。在第二方面，本发明提供了本发明第一方面的方法制备的非蒸馏酒。这种酒能够保留原有酵母的发酵风味，而且便于酒液的后期纯化，由于酵母主要沉积在发酵罐底部，只需要取酒液的上清，经过简单的过滤即可获得澄清的酒体。在第三方面，本发明提供了絮凝蛋白变体，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。本领域技术人员可以根据絮凝蛋白变体的氨基酸序列推导出其编码核苷酸序列，优选是密码子优化的核苷酸序列，如针对发酵所用的菌密码子使用情况优化的。在第四方面，本发明提供了编码本发明第三方面的絮凝蛋白变体的基因。该基因通过常规的DNA重组技术，可以导入质粒和菌体(如，酵母)，表达本发明第三方面的絮凝蛋白变体。优选本发明第四方面的基因的核苷酸序列如SEQ ID No:l所示。该优选的基因核苷酸序列的密码子针对酿酒酵母宿主优化，而且密码子优化表不是根据现有公开的优化表进行的，而是根据我们长期研究发现的，在除了对单个密码子优化之外，还兼顾了 CG含量的优化。在第五方面，本发明提供了本发明第四方面的基因在发酵制备非蒸馏酒的方法中的应用。该基因可以赋予酵母以絮凝优化特性，因而对发酵制备非蒸馏酒而言是非常有益的。优选在本发明第五方面的应用中，所述方法是本发明第一方面的方法。本发明具有下列优点和效果在发酵初期发酵液中含糖量高时，酵母将尽量使其在发酵液中保持悬浮状态，从而使得发酵更为充分，提高发酵效率；在发酵结束发酵液中含糖量低时，酵母将容易沉淀到发酵罐底部，便于发酵终止后收集酒体；能够赋予酵母以絮凝优化特性，从而可以利用原有发酵特性优良而絮凝性质不佳的酵母，充分利用目前发酵厂和酒厂的酵母资源；本发明的酒带有甘蔗清香并能继承原有发酵特性优良的酵母的特性， 香味吸引人，能够达到与加入唱本昂贵的原料相似的效果；本发明的酒使用了粮食作为发酵原料，降低了生产成本。为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了公开文献，这些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明进行参考，就好像它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。

根据我们设计的基因序列(SEQ ID No :1，其编码的蛋白变体的氨基酸序列为SEQ IDNo :2)，通过商业途径委托广东暨大基因药物工程研究中心有限公司合成我们发现的絮凝蛋白变体基因并构建入酿酒酵母中。克隆过程参照《分子克隆实验指南》以及所用商品化试剂的操作指南进行，简要过程如下
通过DNA自动合成仪，合成絮凝蛋白变体基因的核酸片段，用T4多核苷酸激酶(购自 TaKaRa公司)将这些核酸片段的5’端进行磷酸化，然后等摩尔比混合这些核酸片段后于 75°C变性5分钟，然后退火降温至12°C，加入T4DNA连接酶(购自TaKaRa公司)连接12小时。然后，取I μ L上述连接产物在50 μ L反应体积中进行PCR扩增，其中正向引物如序列表的SEQID No 3所示(引入了 EcoR I内切酶位点)、反向引物如序列表的SEQ ID No 4所示(引入了 Xba I内切酶位点)，反应条件为以94°C变性2分钟，然后以94°C变性30秒、 63°C退火60秒并72°C延伸90秒进行30个循环，最后以72°C延伸12分钟并降温至4°C。琼脂糖凝胶电泳上述PCR产物，回收约4. 5kb大小的片段，用EcoR I和Xba I双酶切该片段，并与经这两个内切酶酶切的PYESS2/CT质粒(可购自Invitrogen公司)用T4DNA 连接酶进行连接，电转化法将pYESS-fIn质粒转入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) QN732株(购自广西易多收生物科技有限公司，其为非凝絮性酵母，但是发酵产生的酒中有淡淡巧克力香味)中，涂布在选择性培养基上培养，取生长出的酵母提取总DNA后，用上述正向引物和反向引物PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳发现有约4. 5kb大小的片段，表明已经将如序列表的SEQ ID No :1所示的基因导入了酿酒酵母中了。同时，将pYESS2/CT空质粒和克隆有野生型絮凝蛋白基因的PYESS2/CT质粒电转化入该非凝絮性酵母，分别作为阴性对照和阳性对照。我们将20mL 絮凝检测液(50mmol/L 柠檬酸钠，5mmol/LEDTA，20mmol/L CaCl2, pH 4. 5 ;并分别加入以下终浓度的物质不加入(无糖)，1M葡萄糖)置于50mL摇瓶中，分别加入上述各酵母细胞I克(湿重)，以30°C、100r/min振荡培养2小时。然后，取5mL细胞悬浮液至IOmL试管中，立刻在液面取样200 μ L，垂直静置5分钟，然后在液面取样200 μ L，分别测定垂直静置前后的0D600值，计算絮凝率(絮凝率=(I-垂直静置后的0D600值/垂直静置前的0D600值)*100% )。结果如表I所示，酿酒酵母QN732基本不具有絮凝性质；克隆了野生型絮凝蛋白基因后，无论在无糖还是在含糖环境下，酵母都将具有絮凝性质；本发明的絮凝蛋白变体基因转入的酵母在含糖环境下不具有絮凝性质，将保持悬浮状态发酵， 而在无糖环境下将具有絮凝性质，容易沉淀到发酵罐底部，便于发酵终止后收集。表I各酵母在含糖或不含糖条件下的絮凝率
絮凝检测液酵母的基因空载体絮凝蛋白变体基因野生型絮凝蛋白基因无糖7%66%73%含葡萄糖6%12%58%
实施例2非蒸馏酒的制备
将500克大米磨碎，加700克水浸泡I小时，然后煮熟，加2公斤水和α淀粉酶(可购自南宁赛华发酵制品有限公司)IOU/克大米原料，于55°C搅拌30分钟，然后升温至95°C继续搅拌30分钟，使大米液化。然后加入乳酸调节pH至4. 2，于58°C加入糖化酶(可购自南宁赛华发酵制品有限公司)150U/克大米原料，保温90分钟，去除糟渣后得到糖化液。将上述糖化液装入灭菌的发酵罐，加入实施例I的克隆有絮凝蛋白变体基因的酵母2克(干重)和发酵助剂Fermaid K(可购自上海杰兔工贸有限公司)5克，于28°C发酵 48小时，然后加入O. 5L 15° Bx的甘蔗汁(新榨甘蔗汁用水稀释到15° Bx，然后高温灭菌， 即成)，温度控制在18 22°C，密封发酵9 12天。当残糖< 4克/L时，发酵结束，由于此时酵母基本沉积在罐底，因此将上清液部分简单过滤即可取得澄清的酒体，经巴氏灭菌， 加水稀释至含酒精12% (体积比)即可装瓶。多批次酿造后，经检测，各批次酒理化指标稳定(见表2)，符合国家酒类的标准；该酒香味中带有甘蔗汁的清香和巧克力的清香，口感丰满。表2理化指标
项目酒精含量％ (vol)甲醇含量/(g/L)铜含量(mg/L)指标12^ I. 5^ 5. O
序列表
〈110〉长东，叶
〈120〉粮食与甘蔗汁发酵的非蒸馏酒及其工艺
<130>CN
<160>4
<170>PatentIn version 3. 3<210>1 <211>4614 <212>DNA 〈213〉酿酒酵母 <400>1
atgaccatgccgcatcgctatatgtttctggcggtgtttaccctgctggcgctgaccagc60gtggcgagcggcgcgaccgaagcgtgcctgCCggCgggCCagcgcaaaagcggcatgaac120attaacttttatcagtatagcctgaaagatagcagcacctatagcaacgcggcgtatatg180gcgtatggctatgcgagcaaaaccaaactgggcaacgtgggcggccagaccgatattagc240attgattataacattccgtgcgtgagcagcagcggcacctttccgtgcccgcaggaagat300agctatggcaactggggctgcaaaggcatgggcgcgtgcagcaacagccagggcattgcg360tattggagcaccgatctgtttggcttttataccaccccgaccaacgtgaccctggaaatg420accggctattttctgccgccgcagaccggcagctatacctttaaatttgcgaccgtggat480gatagcgcgattctgagtgtgggcggcgcgaccgcgtttaactgctgcgcgcagcagcag540ccgccgattaccagcaccaactttaccattgatggcattaaaccgtggggcggcagcctg600ccgccgaacattgaaggcaccgtgtatatgtatgcgggctattattatccgatgaaagtg660gtgtatagcaacgcggtgagctggggcaccctgccgattagcgtgaccctgccggatggc720accaccgtgagcgatgattttgaaggctatgtgtatagctttgatgatgatctgagccag780agcaactgcaccgtgccggatccgagcaaccatgcggtgagcaccaccaccaccaccacc840gaaccgtggaccggcacctttaccagcaccagcaccgaaatgaccaccgtgaccggcacc900aacggcgtgccgaccgatgaaaccgtgattgtgattcgcaccccgaccaccgcgagcacc960attattaccaccaccgaaccgtggaacagcaccttgaccagcaccagcaccgaactgacc1020accgtgaccggcaccaacggcgtgcgcaccgatgaaaccattattgtgattcgcaccccg1080accaccgcgaccaccgcgattaccaccaccgaaccgtggaacagcacctttaccagcacc1140agcaccgaactgaccaccgtgaccggcaccaacggcctgccgaccgatgaaaccattatt1200gtgattcgcaccccgaccaccgcgaccaccgcgatgaccaccacccagccgtggaacgat1260acctttaccagcaccagcaccgaaatgaccaccgtgaccggcaccaacggcctgccgacc1320gatgaaaccattattgtgattcgcaccccgaccaccgcgaccaccgcgatgaccaccacc1380cagccgtgggatgatacctttaccagcaccagcaccgaaatgaccaccgtgaccggcacc1440aacggcctgccgaccgatgaaaccattattgtgattcgcaccccgaccaccgcgaccacc1500gcgatgaccaccacccagccgtggaacgatacctttaccagcaccagcaccgaaatgacc1560accgtgaccggcaccaacggcctgccgaccgatgaaaccattattgtgattcgcaccccg1620accaccgcgaccaccgcgatgaccaccacccagccgtggaacgatacctttaccagcacc1680agcaccgaaatgaccaccgtgaccggcaccaacggcctgccgaccgatgaaaccattatt1740gtgattcgcaccccgaccaccgcgaccaccgcgattaccaccaccgaaccgtggaacagc1800acctttaccagcaccagcaccgaactgaccaccgtgaccggcaccaacggcctgccgacc1860gatgaaaccattattgtgattcgcaccccgaccaccgcgaccaccgcgatgaccaccacc1920cagccgtggaacgatacctttaccagcaccagcaccgaaatgaccaccgtgaccggcacc1980aacggcctgccgaccgatgaaaccattattgtgattcgcaccccgaccaccgcgaccacc2040gcgatgaccaccacccagccgtggaacgatacctttaccagcaccagcaccgaaatgacc2100accgtgaccggcaccaacggcctgccgaccgatgaaaccattattgtgattcgcaccccg2160accaccgcgaccaccgcgatgaccaccacccagccgtggaacgatacctttaccagcacc2220agcaccgaaatgaccaccgtgaccggcaccaacggcgtgccgaccgatgaaaccgtgatt2280gtgattcgcaccccgaccagcgaaggcctgattagcaccaccaccgaaccgtggaccggc2340acctttaccagcaccagcaccgaaatgaccaccgtgaccggcaccaacggccagccgacc2400gatgaaaccgtgattgtgattcgcaccccgaccagcgaaggcctggtgaccaccaccacc2460gaaccgtggaccggcacctttaccagcaccagcaccgaaatgaccaccattaccggcacc2520aacggcgtgccgaccgatgaaaccgtgattgtgattcgcaccccgaccagcgaaggcctg2580attagcaccaccaccgaaccgtggaccggcacctttaccagcaccagcaccgaaatgacc2640accattaccggcaccaacggccagccgaccgatgaaaccgtgattgtgattcgcaccccg2700accagcgaaggcctgattagcaccaccaccgaaccgtggaccggcacctttaccagcacc2760agcaccgaaatgaccaccgtgaccggcaccaacggcgtgccgaccgatgaaaccgtgatt2820gtgattcgcaccccgaccagcgaaggcctgattagcaccaccaccgaaccgtggaccggc2880acctttaccagcaccagcaccgaagtgaccaccattaccggcaccaacggccagccgacc2940gatgaaaccgtgattgtgattcgcaccccgaccagcgaaggcctgattagcaccaccacc3000gaaccgtggaccggcacctttaccagcaccagcaccgaaatgaccaccgtgaccggcacc3060aacggccagccgaccgatgaaaccgtgattgtgattcgcaccccgaccagcgaaggcctg3120gtgaccaccaccaccgaaccgtggaccggcacctttaccagcaccagcaccgaaatgagc3180accgtgaccggcaccaacggcctgccgaccgatgaaaccgtgattgtggtgaaaaccccg3240accaccgcgattagcagcagcctgagcagcagcagcagcggccagattaccagcagcatt3300accagcagccgcccgattattaccccgttttatccgagcaacggcaccagcgtgattagc3360agcagcgtgattagcagcagcgtgaccagcagcctgtttaccagcagcccggtgattagc3420agcagcgtgattagcagcagcaccaccaccagcaccagcatttttagcgaaagcagcaaa3480agcagcgtgattccgaccagcagcagcaccagcggcagcagcgaaagcgaaaccagcagc3540gcgggcagcgtgagcagcagcagctttattagcagcgaaagcagcaaaagcccgacctat3600agcagcagcagcctgccgctggtgaccagcgcgaccaccagccaggaaaccgcgagcagc3660CtgCCgCCggcgaccaccaccaaaaccagcgaacagaccaccctggtgaccgtgaccagc3720tgcgaaagccatgtgtgcaccgaaagcattagcccggcgattgtgagcaccgcgaccgtg3780accgtgagcggcgtgaccaccgaatataccacctggtgcccgattagcaccaccgaaacc3840accaaacagaccaaaggcaccaccgaacagaccaccgaaaCCBCCBBBCBgaccaccgtg3900gtgaccattagcagctgcgaaagcgatgtgtgcagcaaaaccgcgagcccggcgattgtg3960agcaccagcaccgcgaccattaacggcgtgaccaccgaatataccacctggtgcccgatt4020agcaccaccgaaagccgccagcagaccaccctggtgaccgtgaccagctgcgaaagcggc4080gtgtgcagcgaaaccgcgagcccggcgattgtgagcaccgcgaccgcgaccgtgaacgat4140gtggtgaccgtgtatccgacCtggCgCCCgcagaccgcgaacgaagaaagcgtgagcagc4200aaaatgaacagcgcgaccggcgaaaccaccaccaacaccctggcggcggaaaccaccacc4260aacaccgtggcggcggaaaccattaccaacaccggcgcggcggaaaccaaaaccgtggtg4320accagcagcctgagccgcagcaaccatgcggaaacccagaccgcgagcgcgaccgatgtg4380Met
I
Ala
Gly
Lys
Ala
65
80
Ile
Pro
Cys
Phe
attggccata gcagcagcgt
agcagcggcc tgagcaccat
ggctatagca ccgcgagcct
gcgggcagcg gcctgagcgt
<210>2
<211>1537
<212>PRT
〈213〉酿酒酵母
<400>2
Met
ggtgagcgtg
gagccagcag
ggaaattagc
gtttattgcg
agcgaaaccg
ccgcgcagca
acctatgcgg
agcctgctgc
Thr Leu Thr
Gln
Asp
50
Ser
Asp
Gln
Ser
Arg Tyr Met Ala Ser Gly Gly Met Ser Thr Tyr Ser Lys Thr Lys Leu Gly
Arg
35
Ser
Pro His 5
Ser Val 20 Lys Ser
Tyr
Glu
Leu 145
160
Asp Ser
Ala Gln
He Lys
Tyr Met 210
Tyr 130 Pro Pro
Asn 115 Thr Thr
Asn Ile
Asp Ser 100 Ser Gln
Gln
Pro
Thr
Ala
Gln
He Leu
Gln Pro 180 Trp Gly 195
Tyr Ala Gly
Pro
Pro
85
Tyr
Gly
Thr
Gly
Ser
165
Pro
Gly
Tyr
Asn
Asn
55
Asn
Cys
Gly
Ile
Asn
Ser
Val
Ile
Val
Asn
Ala
Val
135
Tyr
Gly
Thr
Phe
Ala
Ile
40
Ala
Val
Ser
Trp
Ala
Gly
70
Tyr 120 Thr Leu
Thr Phe 150
Ser Leu
Tyr
Tyr
215
Gly
Ser
Pro
200
Pro
gcaacaccaa aagcctgacc ccccggcgag cagcatggtg gcagcgcgaa cagcctgctg tggcgattat ttaa
Leu Ala 10
Thr Glu 25 Asn Phe
Tyr
Gly
Ser Ser
Gly Cys 105 Trp Ser
Glu
Lys
Thr
Ala
Thr Asn 185 Pro Asn
Met Lys
Val
Ala
Tyr
Met
Gln
Gly
90
Lys
Thr
Met
Phe
Ala
170
Phe
Ile
Val
Phe
Cys
Gln
Ala
Thr
Thr
Gly
Asp
Thr
Ala
Phe
Thr
Glu
Val
Thr Leu Leu
Leu Pro
Tyr
Tyr
60
Asp
Phe
Met
Leu
Gly
140
Thr
Asn
Ile
Gly
Tyr
220
Ser
45
Gly
Tyr He Ser
Pro
Gly
Cys
Ala 110 Phe Gly 125 Tyr Phe
Val Asp
Cys
Asp
Thr
205
Ser
Ala
30
Leu
Cys
Gly
190
Val
Asn
4440
4500
4560
4614
75
95
155
17

本发明提供了用粮食和甘蔗汁为原料发酵制备非蒸馏酒的方法，其包括取大米加入α淀粉酶进行液化，加入糖化酶进行糖化，加入具有絮凝优化特性的酵母和发酵助剂进行初步发酵，加入甘蔗汁，密封发酵，得到非蒸馏酒。另外本发明还提供了制备得到的非蒸馏酒和酵母以及絮凝蛋白变体和基因。