专利名称：一种用于启动子分析的慢病毒t载体及其构建方法和应用的制作方法基因的表达调控首先由转录因子结合到基因的启动子区从而起始转录，许多疾病都与启动子的活性相关，如遗传性地中海贫血病和(M. De Gobbi等，Science 2006,312 1215-1217)亨丁顿舞蹈症等(K. Tanaka 等，J Biol Chem，2004，279 :7275_7沘6)。因此， 在体内和体外进行启动子的活性分析对于深入探索基因的表达调控及其功能具有重要的意义。启动子的活性研究，目前，常用的方法是将PCR等获得的基因启动子区通过一系列的亚克隆等插入表达载体PGL4.0或pEGFP-Ι中，通过测定荧光素酶的活性或绿色荧光蛋白的表达在体外检测启动子的活性或在体内检测启动子的活性及组织特异性。慢病毒广泛应用于基因治疗，细胞功能研究及转基因动物的制备研究，且被认为是制备转基因动物最为有效的一种工具(Robl JM等，Theriogenology 2007, 67(1) :127-133.)。通过制备含有绿色荧光蛋白及特异性启动子的慢病毒载体，包装慢病毒制备转基因动物，可在体内进行启动子的活性和组织特异性分析。因此，如果较为全面的完成启动子的活性分析，需经过构建含有荧光素酶报告基因(Luc2)的载体和构建慢病毒载体制备转基因动物来完成体外和体内启动子的活性分析。
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种可用于启动子分析用的慢病毒T载体及其构建方法的技术方案，该载体可直接通过TA克隆策略将基因5’调控区 PCR扩增产物连接入载体中，进行启动子的活性分析，具有操作简单、制备成本低等特点。所述的一种用于启动子分析的慢病毒T载体，其特征在于该T载体基于慢病毒穿梭载体设计而成，将荧光素酶报告基因与绿色荧光蛋白报告基因通过内部核糖体进入位点相连接，可在同一顺反子中，表达两种不同的报告基因。所述的一种用于启动子分析的慢病毒T载体，其特征在于所述的慢病毒穿梭载体为慢病毒穿梭载体CS II -EF-MCS-IRES2-Venuso所述的一种用于启动子分析的慢病毒T载体，其特征在于所述的荧光素酶报告基因插入去除启动子后载体中的多克隆位点区。所述的一种用于启动子分析的慢病毒T载体的构建方法，其特征在于包括以下工艺步骤1)慢病毒穿梭载体CSII -EF-MCS-IRES2-Venus中酶切去除EF启动子；2)将步骤1)得到的酶切产物转入感受态细胞中，构建无启动子载体 CS II -MCS-IRES2-Venus ；3)应用PCR从载体pGL4.0中扩增荧光素酶报告基因，并连接入T载体pMD19_T Simple中，得到质粒 pMD19-Luc2 Simple ；4)通过步骤3)得到的质粒pMD19-Luc2Simple将荧光素酶报告基因克隆至步骤2)得到的载体CS II -MCS-IRES2-Venus的酶切、去磷处理产物中，得到质粒CS II -MCS-Luc2-IRES2-Venus ；5)质粒CSII - MCS-Luc2-IRES2-Venus酶切后，加入dTTP和Taq聚合酶反应得到慢病毒 T 载体 pLenti-T。所述的一种用于启动子分析的慢病毒T载体的构建方法，其特征在于所述的步骤 1)中使用限制性内切酶Age I去除载体多克隆位点前的EF启动子。所述的一种用于启动子分析的慢病毒T载体的构建方法，其特征在于所述的步骤
3)中PCR扩增在基因5’端引物中引入酶切位点NheI ,Swa I和BamH I酶切位点，在基因的3’端引物中引入酶切位点Bgl II。所述的一种用于启动子分析的慢病毒T载体的构建方法，其特征在于所述的步骤
4)中载体CS II -MCS-IRES2-Venus 使用 BamH I 酶切，载体 CS II -MCS-IRES2_Venus 使用 CIAP试剂进行去磷处理。所述的一种用于启动子分析的慢病毒T载体的构建方法，其特征在于所述的步骤
5)中质粒CS II - MCS-Luc2-IRES2-Venus 使用 Swa I 酶切。所述的一种用于启动子分析的慢病毒T载体的构建方法，其特征在于所述的步骤 5)中质粒CS II - MCS-Luc2-IRES2-Venus酶切后，加入dTTP和Taq聚合酶在72°C反应2 小时。所述的一种用于启动子分析的慢病毒T载体在体内或体外进行真核生物启动子活性分析的应用。上述的一种可用于真核生物启动子活性分析的慢病毒T载体，可同时表达荧光素酶和绿色荧光蛋白两种报告基因，并且通过改造成T载体，可直接将PCR扩增产物，使用TA 克隆策略连接到这一载体中，用于在体外细胞水平上进行启动子活性的定量分析；也可包装成慢病毒，制备转基因动物，在机体水平上进行启动子的组织特异性及定量或定性分析。本发明与现有的技术相比具有以下特点1)在同一载体中可同时表达两种不同的报告基因，可进行酶活性检测和荧光检测，实现实验手段的多样化。2)既可在体外培养的细胞水平上进行启动子活性分析，也可包装成慢病毒，生产转基因动物，在体内进行启动子活性及特异性分析，适用范围广。3)通过制备成T载体，可直接应用TA克隆策略将PCR产物连接入该载体中，简化实验步骤。4)在体外进行启动子分析时，可在荧光镜下观测绿色荧光蛋白的表达，从而确定质粒的转染效率，简便易行。5)在慢病毒载体中增加了新的酶切位点Nhe I ,Swa I和BamH I，对于一些较长片段，难以进行TA克隆时，可通过在PCR克隆基因时加入相应的酶切位点连接入载体中，具有良好的可扩展性。6)制备的T载体，T的前端含有Not I和新加入的Nhe I酶切位点，3’端则通过同尾酶的特性保留了原载体中的 BamH I酶切位点，可通过相应的酶将所得的启动子区从载体中回收，便于进行后续研究。


图1慢病毒T载体的制备流程；
图2构建含有启动子的载体转染效果及荧光强度检测；图3两种启动子活性的分析。

1)慢病毒穿梭载体CS II -EF-MCS-IRES2-Venus中EF启动子的切除在50 μ 反应体系中加入 30 μ 质粒 DNA，5 μ IOXNEBuffer 1，3μ1 限制性内切酶 Age I ,12 μ H2O0 37°C过夜酶切。琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒回收DNA片段。2)无启动子载体CS II - MCS-IRES2-Venus的构建在20 μ 反应体系中加入2 μ 步骤 1)中的酶切回收产物，2 μ 10ΧΤ4 DNA Ligase Buffer, 1 μ Τ4 DNA Ligase, 15 μ H2O0 16 °C过夜连接。取5 μ 上述的连接产物转入感受态细胞中，铺含有氨苄青霉素的琼脂糖平板，挑取单菌落进行培养。提取质粒，经酶切和测序鉴定，选取正确连接的克隆命名为质粒 CS II - MCS-IRES2-Venus。3)荧光素酶报告基因(Luc2)的克隆在基因5’端引物中引入酶切位点Nhe I、 Swa I和BamH I酶切位点，在基因的3’端引物中引入酶切位点Bgl II。应用PCR从载体 PGL4. 0中扩增荧光素酶报告基因，并连接入T载体pMD19-T Simple中。提取质粒进行PCR 及测序鉴定，选取鉴定正确的克隆命名为质粒pMD19-Luc2 Simple。4)含双报告基因载体的构建
慢病毒载体CS II - MCS-IRES2"Venus的酶切在50 μ 反应体系中加入30 μ 质粒 CS II - MCS-IRES2-Venus,6 μ IOXK Buffer, 2 μ BamH I，12μ1 H20。37°C过夜酶切。 酶切产物经电泳鉴定后，PCR产物回收试剂盒进行回收。酶切产物的去磷处理在60 μ 反应体系中加入40 μι上述回收产物，6 μ IOXAlkaline phosphatase Buffer, 3 μ CIAP, Ι μ H2O0 37°C孵育 3 小时后，PCR产物回收试剂盒进行回收。荧光素酶报告基因(Luc 2)的回收在60 μ 反应体系中加入30 μ 质粒 pMD19-Luc2 Simple, 6 μ IOXK Buffer, 2 μ BamH I，3 μ Bgl II，19μ1 H2O0 37°C酶切过夜，琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒回收DNA片段。载体的连接20 μ 反应体系中加入2 μ 去磷后回收的慢病毒载体CS II -MCS-IRES2-Venus,5 μ 荧光素酶报告基因(Luc 2),2 μ 10ΧΤ4 DNA Ligase Buffer, 2 μ T4 DNA Ligase,9 μ H2O0 16 °C过夜连接。取5 μ 上述的连接产物转入感受态细胞中，铺含有氨苄青霉素的琼脂糖平板，挑取单菌落进行培养。提取质粒，经PCR、酶切和测序鉴定，选取正确连接的克隆命名为质粒CS II - MCS-Luc2-IRES2-Venus。5) T载体的制备
载体CS II - MCS-Luc2-IRES2-Venus的酶切在50μ1反应体系中加入30μ1质粒CS II -MCS-Luc2-IRES2-Venus, 5μ1 IOXNEBuffer 4，3μ1 Swa I 和 12 μ Η20。37°C 酶切过夜，琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，PCR产物回收试剂盒进行回收。载体的加T 在50μ1反应体系中加入20μ1上述酶切质粒CS II -MCS-Luc2-IRES2-Venus, 5 μ 10XPCR Buffer, 1 μ 100 mM dTTP, 1 μ Taq 聚合酶和 23 μ H2O0 72°C反应2小时后，PCR产物回收试剂盒进行回收。所得产物即为慢病毒T载体。
试验例1 :EF1_ α和PGK启动子的活性分析引物合成和序列测定由上海生工生物工程有限公司完成
1)以载体pEF/myc/cyto及pQBI-pgk中EFl-α和PGK启动子基因设计引物进行启动子的克隆，引物序列如下
EF-F :GAATTCAAGCTTCGTGAGGC (SEQ ID NO 1) EF-R :CACGTGTTCACGACACCTGAAATGG (SEQ ID NO :2) PGK-F :TCGACGGTATCGATAAGCTTGATAT (SEQ ID NO :3) PGK-R :CTGCAGGTCGAAAGGCCCGGAGATG (SEQ ID NO :4)
2)以质粒pEF/myc/cyto及pQBI-pgk为模板，PCR扩增EF和PGK启动子基因，凝胶回收试剂盒(天根生化)纯化扩增的基因片段。3)在20 μ 反应体系中加入1 μ 慢病毒T载体pLenti-T，5 μ PCR产物，2 μ 10ΧΤ4 DNA Ligase Buffer, 1 μ Τ4 DNA Ligase, 11 μ Η20。16 °C反应 5 小时。4)将连接产物取5 μ 加入50μ1感受态细胞(全式金公司)中，冰浴30分钟，42°C 热激2分钟，加入500 μ LB培养基。37°C，200转培养1小时使抗性恢复，取200μ1铺含
有氨苄青霉素的琼脂糖平板，培养过夜。5)挑取单克隆，在含有氨苄青霉素的LB培养基中，37°C，200转/分钟培养10 小时，设计测序引物CS II :ATTCAAGCTTCGTGAGGCTC,与启动子相应的下游引物通过菌液PCR对挑取的单克隆进行鉴定。选取PCR扩增正确的克隆进行测序确定，分别命名为 pLenti-EFlα 和 pLenti-PGK。6)将构建好的载体使用质粒提取试剂盒进行质粒提取，并测定质粒的浓度。7)培养细胞，在M孔细胞培养板中每孔接种5X104个细胞。37 ° C，5% C02培养箱中培养20 小时后，取0. 8 μ g of CS II-EFl α-Iuc2-IRES2-Venus 和 0.76 μ g of CS II -PGK-luc2-IRES2-Venus 力口 0· 04 μ g pGL4. 0 转染 293T 细胞，取 0. 8 μ g pGL4. 0 作为空白对照，每孔加入80 ng pRL-TK共转染作为对照质粒。每一样品重复三孔。8)步骤7)中转染的细胞经两天培养后，在荧光显微镜下观测荧光蛋白的表达水平，绿色荧光蛋白激发波长下，在相同的曝光时间内，EFl-α启动子活性明显高于PGK启动子(见图2)。8)根据Dual-Luciferase双报告基因检测试剂盒(Promega公司)使用说明书配置荧火虫荧光素酶和海肾荧光素酶报告基因检测试剂磷酸盐缓冲液PBS，被动裂解缓冲液 1XPLB，LAR II试剂和 Mop & Glo 试剂。9)除去培养板中的细胞培养基，用IXPBS清洗培养细胞。去掉清洗液。10)每一细胞孔中加入100 μ 1被动裂解缓冲液1XPLB，在室温轻缓晃动培养板15 分钟，把裂解液转移到检测试管中。11)将荧光素酶报告基因检测仪器(SpectraMax Μ5)预热30分钟，在全白96孔测试板中加入20 μ 1步骤10)裂解液，加入100 μ 1溶液LARII，检测荧火虫荧光素酶活性。12)每孔加入100 μ 1 Stop & Glo试剂，检测海肾荧光素酶活。13)将获得的数据以荧火虫荧光素酶报告基因与海肾荧光素酶报告基因的比值定义为相对转录活性进行分析，从图3中可看出在细胞中，EFl-α转录子的活性明显高于PGK启动子活性(图3)。
本发明的活性分析方法适用于真核生物启动子的活性分析。


一种用于启动子分析的慢病毒T载体及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。该T载体基于慢病毒穿梭载体设计而成，将荧光素酶报告基因与绿色荧光蛋白报告基因通过内部核糖体进入位点相连接，可在同一顺反子中，表达两种不同的报告基因。该构建方法包括从慢病毒穿梭载体CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus，使用AgeⅠ进行酶切，去除本身的EF启动子序列，加入荧光素酶报告基因及酶切位点NheⅠ、SwaⅠ和BamHⅠ，使用SwaⅠ酶切后，使用Taq酶和dTTP加T即为慢病毒T载体。该载体可直接通过TA克隆策略将基因5’调控区PCR扩增产物连接入载体中，进行启动子的活性分析，具有操作简单、制备成本低等特点。