专利名称：一种荒漠化、沙漠化治理专用金银花的培育方法荒漠化、特别是沙漠化，与气候变化、生物多样性减少并称为全球三大生态环境问题。目前全球荒漠化面积已占陆地总面积的1/4，严重影响人类生存和可持续发展。我国是世界上荒漠化面积大、分布广、类型复杂、受害严重的国家之一，荒漠化面积占到国土面积的1/3，全国有4亿人口常年受到风沙危害。荒漠化是由不合理的人类活动与脆弱的生态环境相互作用所造成的，表现为土地 生产力下降，土地资源丧失、地表呈现类似沙漠景观的土地退化。中国沙漠化土地从东北经华北到西北形成一条不连续的弧形分布带，土地沙漠化速率不断加快。据监测，截至2009年底，全国荒漠化土地262. 37万平方公里，沙化土地173. 11万平方公里，分别占国土总面积的27. 33%和18. 03%。此外，全国还有约31万平方公里的土地呈现明显沙化趋势沙化危害突出，而且呈扩展态势。由于受超载放牧、滥采滥挖等人为因素及频发的极端自然灾害等共同影响，川西北高原、塔里木河下游等局部区域沙化土地处于扩展状态。包括甘肃民勤县在内的河西地区和内蒙古阿拉善盟已成为北方强度最大的沙尘暴策源地，民勤县生态的恶化，导致巴丹吉林沙漠和腾格里沙漠即将合拢。在北方地区尤其是内蒙古自治区八十八个旗县中，有六十七个旗县已经沙化。荒漠化地区草原植被趋于退化，生物资源锐减，草地生产力平均下降了 60%—70%。风沙侵蚀与水土流失加剧，耕地肥力消耗殆尽，湖泊干涸，滩川地盐碱化，固定与半固定沙地严重沙化，沙尘天气与沙尘暴频发，直接威胁着国土生态安全和群众生活，成为我国经济社会可持续发展的重要制约因素。长期以来，虽然党中央、国务院高度重视荒漠化防治，高度关注沙区经济社会发展，防沙治沙事业取得了显著成绩。但不容乐观的是，政府在荒漠化防治上投入巨大，如三北防护林工程(1978— 2050年)总投资578. 60亿元，京津风沙源治理工程(2001— 2010年)总投资558. 65亿元。由于资金投入大，工程效益低，使所投入的资金无法维持持续循环发展，单纯依靠国家对工程的直接投资来维系建设，致使国家及地方财政压力较大。目前虽然植被总体上处于初步恢复阶段，但自我调节能力弱，稳定性差，短期内难以形成稳定的生态系统，防治难度很大。土地荒漠化、沙化的严峻形势仍未得到根本改变，形势依然十分严峻。如离北京仅三百公里的浑善达克沙漠已严重威胁北京的整体生态，成为当前最为严重的生态问题。坚持“防沙、治沙、用沙”相结合的原则，培育和选择适宜的种苗，充分开发沙漠潜能，利用沙地价值，努力把那些“不毛之地”发展成为名符其实的绿洲、绿色能源开发的基地、风光壮美的自然旅游景区。因此，如何获得多倍体植物已成为农业技术中的焦点，同时也是难点。金银花，为忍冬科忍冬属植物，多年生落叶或半长绿藤本植物，首载于《名医别录》，名忍冬，因其凌冬不凋故名。宋代《履馋馋岩本草》始称金银花。别名有双花、二花、银花、忍冬。金银花为忍冬科忍冬属植物，全世界有金银花200多种，我国有98种，全国种植的金银花正品与地方性非正品品种多达45 50种之多。近年来，国家卫生部对金银花收藏的植物来源有较大改变，《中国药典》1963年收录只有I种，1977年版增加到3种，2005年版将金银花分为忍冬(Lonicera japonica Thunb)和山银花，S卩“正品”和“非正品”，和1963年一样，只收录了 I种，即忍冬(Lonicera japonica Thunb)也称作大毛花,作为正品金银花的原植物。本发明一种荒漠化、沙漠化治理专用金银花新品种的培育方法。用该方法所培育出来的染色体加倍后的多倍体金银花，与其亲本大毛花(Lonicera japonica Thunb)相比具有明显的改变，得到了亲本大毛花所没有的优良经济性状。如根系发达，抗逆性强，持续 时间长，抗干旱、耐贫瘠、抗盐碱、抗严寒，抗病虫害能力强；对地带性的生态条件适应性强，具有较强的繁殖能力和更新能力，可自行无限繁殖等生物学、生态学特性。在北纬40°以北地区种植，2年内根盘占地面积可达5平方米。一株可覆盖10 IIf以上沙滩或荒山。根盘覆盖土地锁含水份达200公斤左右。利用这一方法培育新苗种，可绿化沙漠、荒山，保持水土，防止山区石漠化和防风沙、抗尘瀑。让荒漠了的“不毛之地”产生自我造血功能，从根本上解决沙漠治理资金投入大、效益低、无法维持持循环发展的难题。该品种药食同源，枝节短、花蕾大、花壁厚、结花多、花期长、产量高，有效药物含量高，根、茎、叶、花、藤皆可用于药品、饮品、保健品。其经济价值极为可观。用该方法所培育出来的金银花干花与亲本外植体干花，经中国医药科学院药用植物研究所用[2000]版药典“高效液相色谱法”对比检验，有效药物含量吸收峰明显高于亲本大毛花，如图I所示，主要药物成分氯原酸含量为4. 17%，亲本正品大毛花为1.90%。红外光谱法对本发明方法所培育出来的染色体加倍后的四倍体金银花质量的整体评价为本发明培育得到的金银花品系较亲本大毛花的品质高，是一种产量、品质都有明显优势的金银花新品种。
本发明的目的是提供一种荒漠化、沙漠化治理专用金银花新品种的培育方法。本发明基本技术方案是采用外植体选择、脱毒、培养基制备、诱导及生根培养、假植、定植、鉴定等工序组培而成。其具体步骤如下本发明的目的是通过以下技术方案实现的。(I)选种选择传统大毛花植株的幼嫩芽、叶片、腋芽或花蕾作为外植体，放入消毒瓶中待用；(2)脱毒将消毒瓶中的外植体用自来水冲洗后，用酒精溶液浸泡，再用氯化汞溶液消毒，最后用无菌水冲洗；(3)诱导培养基、继代培养基以及生根培养基的制备所述的诱导培养基是按照以下方法制备得到的按配制IL计算，称取45_55ml大量元素母液，4-6ml微量元素母液，4-6mlpH值为5. 5 5. 8的铁盐母液以及4_6ml有机元素母液，25-35g蔗糖，加入蒸馏水中，搅拌混匀后加入适量的培养基凝固剂，调节pH值为5. 5 5. 8，定容至1L，灭菌待用；所述的继代培养基是按照以下方法制备得到的按配制IL计算，用量筒或移液管从未加入培养基凝固剂的诱导培养基中吸取130mL溶液放入烧杯中，加入蒸馏水搅拌混匀，然后再加入2. 4— D (二氯苯氧乙酸)以及NAA (萘已酸)，加入适量的培养基凝固剂，使2. 4—D (二氯苯氧乙酸)以及NAA (萘已酸)终浓度分别达到O. 5mg/L和O. lmg/L,调节pH值为5. 5 5. 8，定容为IOOOmL,灭菌待用；所述的生根培养基是按照以下方法制备得到的按配制IL计算，用量筒或移液管从未加入培养基凝固剂的诱导培养基中吸取65mL溶液放入烧杯中，加入IBA(吲哚丁酸)，加入适量的培养基凝固剂和蒸馏水，使IBA(喷哚丁酸)终浓度为100mg/L，调节pH值为5. 5 5. 8，定容为IOOOmL灭菌待用；优选的，分别向各所述的培养基溶液中加入活性炭，活性炭的加入量为培养基总 重量的 O. 5% -I. 5% ；其中所述的大量元素母液中含有以下成分NH4NO33 300 mg/LK2NO438 000 mg/LCaCl2. 2H208 800 mg/LMgSO4OH2O7 400 mg/LKH2PO43 400 mg/L其中所述的微量元素母液中含有以下成分
KI166 mg/L
H3BO3I 240 mg/L
MnSO4*4H204 460 mg/L
ZnSO4·5H2OI 720 mg/L
Na2MoO4*2H2050 mg/L
CuSO4*5H2O5 mg/L
CoCl2* 6H2O5 mg/L其中所述的铁盐母液中含有以下成分Na2EDTA · 2H207460mg/LFeSO4 · 7H205560mg/L其中所述的有机元素母液中含有以下成分肌醇20 000 mg/L
烟酸1_ mg/L
盐酸吡哆醇1_ mg/L
盐酸破胺素2 Q mg/L
甘氨酸4_ mg/L(4)诱导及生根培养①初代培养在无菌条件下，将灭菌后的外植体种入装有诱导培养基的培养瓶中培养30-35d ；
②继代培养
初代培养30-35d后，将诱导分化形成的带丛生芽的愈伤组织分割成小块，转接到继代培养基中培养25 30d ；③壮苗生根培养将继代培养25 30d后的小苗插入生根培养基中进行壮苗生根培养；优选的，在将小苗转入生根培养基前，将小苗的根部在O. lmg/L的6BA (6—苄基腺嘌呤)溶液中浸泡O. 5-lmin，再插入生根培养基中，以促进小苗生根；(5)移苗、驯化、假植及定植。在本发明中，优选的，上述步骤(I)中所述的外植体为选自I年龄生发育成熟，品种纯、花色好、无病虫害的健康大毛花植株上部的淡绿色幼嫩芽顶，将叶柄两侧叶片用消毒剪刀剪去,并将其叶柄剪成1-0. 5 cm的段，即得。在本发明中，优选的，上述步骤(2)中脱毒所用的酒精溶液为75%酒精溶液，浸泡的时间为30s ;所用的氯化汞溶液O. 1% L氯化汞消毒液，消毒的时间为12min，所用的水均为无菌水，冲洗的次数为4 5遍。在本发明中，优选的，上述步骤(3)中所述的培养基凝固剂包括琼脂、明胶及无机硅胶等。在本发明中，优选的，上述步骤(4)中初代培养是在无菌条件下，将灭菌后的外植体，种入装有诱导培养基的培养瓶中，置于温度为20°C 25°C，湿度为70% 80%，光照强度为2000 30001x，光照时间为14 16h/d的条件下培养。其中温度，光照强度、光照时间均是对无菌室内而言。在本发明中，优选的，上述步骤(4)中继代培养是在初代培养后，将诱导分化形成的带丛生芽的愈伤组织分割成小块，转接到继代培养基中，置于温度为20°C 25°C，湿度为70% 80%，光照强度为2000 30001x，光照时间为14 16h/d的条件下培养。其中温度，光照强度、光照时间均是对无菌室内而言。在本发明中，优选的，上述步骤(4)中生根培养是在继代培养后，增殖体I 2 Cm高时，切取增殖体上部O. 5至I厘米，转入生根培养基中进行壮苗生根培养，生根阶段培养温度应降至20°C，光照改为室内自然散射光。在本发明中，优选的，上述步骤(5)中驯化是在经15-25d的生根培养后，平均每个试瓶植株长出4 5条粗壮的侧根，根长I. 5 2 cm时,将长有健壮根系的小苗连瓶不开盖放在温室栽植处，3至5天后，开瓶放置3 4d进行驯化炼苗。
在本发明中，优选的，上述步骤(5)中假植是待瓶内苗驯化炼苗3_4d后，将幼苗移出，用自来水小心洗净根部培养基，并用O. I %的多菌灵洗根，栽于小苗假植床里，密度为3cm X5 Cm，移栽完毕，再浇适量的水。更优选的，假植后用微喷法浇透水，前10天湿度保持80%，温度 18°C 22°C。在本发明中，优选的，上述步骤(5)中假植床设置为下层为粗沙、中层为筛细的腐殖土、上层为细沙，并用O. 2 %高锰酸钾消毒。在本发明中，优选的，当花苗长出3 4片叶后，可按5 X 4 Cm将其移栽到土质疏松肥沃的假植床内。在本发明中，优选的，其特征在于上述步骤(5)中定植是指待苗高10 Cm时，按30X20 cm株行距定植，并进行正常管理。从组培到定植的时间，大约需7 8个月的时间。通过从亲本外植体、本方法组培的四倍体金银花植株上分别采集花粉观察比较花粉粒的大小，鉴定染色体基数证明按照本发明的方法培养得到的金银花品种为四倍体金银花，且该方法具有可重复性，即只要本领域技术人员按照本发明所述的方法进行大毛花的组织培养即可得到本发明所述的四倍体金银花(4n)。具体而言，上述鉴定方法包括如下步骤a、从亲本外植体、本方法组培的四倍体金银花植株上分别采集花粉。b、将采集到的花粉分别浸入45%冰醋酸。d、用滴管分别各取一滴花粉粒悬浮液，移到载玻片上。e、滴上碘化钾溶液，盖上盖玻片，制成花粉粒制片。f、镜检多倍体及亲本外植体花粉粒大小。g、用测微尺测定并记载其大小。h、鉴定染色体基数，绘制出细胞染色体核型图。用本发明方法组培的金银花新苗种产出的干花与亲本外植体干花，经中国医药科学院药用植物研究所用[2000]版药典“高效液相色谱法”对比检验，有效药物含量吸收峰明显高于传统正品，主要药物成分氯原酸含量为4. 17%，传统亲本大毛花为I. 90%。本发明还提供了上述所得金银花的用途，本发明的金银花品种一株可以覆盖10Hf以上石山或沙滩，根盘覆盖土地含水份达200公斤，利用这一特性，可绿化沙漠、荒山，保持水土，防止山区石漠化和防风沙、抗尘瀑。让荒漠了的“不毛之地”产生自我造血功能，从根本上解决沙漠治理资金投入大、工程效益低、无法维持持循环发展的难题。本发明还提供了上述所得金银花的药用价值，本发明的金银花品种药食同源，其有效药物含量吸收峰明显高于传统正品大毛花，根、茎、叶、花、藤皆可用于药品、饮品、保健品O本发明方法所得染色体加倍后的四倍体金银花(4n)的特征I、生根力强在根的生长习性方面，新品种金银花与亲本大毛花相比，具有明显的不同，表现为根系发达，主根深，细根多，生根力强。3年生主根系分布在15 30厘米深的表土层生长，须根在10 30厘米深的表土层生长，本发明方法培育的新品种金银花与亲本大毛花根系生长情况如实施例中表7所示。2、花茎生长旺盛分枝多茎的生长习性方面，新品种金银花在与亲本大毛花相比，具有明显的不同，表现在自然状态下，栽植三年龄可生长到3 5米的长度。叶枝色较亲本大毛花浓绿，中空，木质化枝条淡红竭色，枝条木质化程度高后，中空消失。花冠主干枝条与亲本大毛花不同，亲本大毛主干直立性较强，而新品种金银花分枝多，角度较开放，呈匍扑状直线贴地生长，落地生根，具有较强的繁殖能力和更新能力，可自行无限繁殖。本发明方法培育的新品种金银花与亲本大毛花不同分枝数和分枝长度如实施例中表10、11所示。3、抗逆性强，适宜不同土壤；在抗逆性方面，新品种金银花与亲本大毛花相比，具有明显的改变，表现为抗干旱、耐贫瘠、抗盐碱、抗严寒，抗病虫害的能力强；对地带性的生态条件适应性强，更易适应生存条件的变化。特别适宜在北纬40°以北地区种植。即使在石灰岩地区的黑色石灰土混杂的土壤环境状况下，植株生长发育旺盛、健壮、花产量高、花的品质好。4、根盘覆盖土地面积大，锁含水份多在保持水土流失方面，新品种金银花与亲本大毛花相比，具有更强的生物学、生态学特性。表现在北纬40°以北地区种植，3年内根盘占地面积可达5平方米。一株可覆盖10 IIf以上沙滩或荒山。根盘覆盖土地锁含水份达200公斤左右。利用这一方法培育新苗种，可绿化沙漠、荒山，保持水土，防止山区石漠化和防风 沙、抗尘瀑。黄河沙滩种植两种金银花根盘土壤锁水量对比如实施例中表13所示。5 :叶片大，光合作用好在叶的生长习性方面，新品种金银花与亲本大毛花相比，具有明显的改变。表现在叶片较大，光合作用好。其叶片长7. 4cm，宽5. 9cm，比亲本大毛花叶片长5. 09cm，宽322cm，分别提高45. 38%,83. 3%;叶片厚度172臟，比亲本大毛花088mm提高955%，叶片厚度增加近一倍。新品种金银花的上述叶部形态特性有利于形成较大的光合作用面积，增加光合产物与干物质的积累，这是新品种金银花的高产形态生理基础。新品种金银花的叶柄长O. 75cm，比大毛花叶柄长05cm，增加50%。这一特征有利于其叶片疏散分布，增加对光能的吸收利用。本发明方法培育的新品种金银花与亲本大毛花叶茎特征对比如实施例表8所示。6、花的分化期短，花期集中在花的生长习性方面，新品种金银花与亲本大毛花相t匕，具有明显的改变。表现在花的分化期短，花期集中在四期。一级分枝，以长、中枝的比例大，坐花的节位多，一般长枝为10节，中枝5 9节，花蕾的数量高于后三期花。7、产量高，经济性状好在经济性状方面，新品种金银花与亲本大毛花相比具有明显的改变。表现为具有较大的营养器官和生殖器官，叶大、茎粗、枝节短、结花枝多、徒长枝少、单株花蕾数多、蕾花大、花壁厚、花针长，二白花期测量，花针长5. 60cm，本发明新品种金银花与其亲本大毛花的花蕾比较如图3所示。本发明方法培育的新品种金银花与亲本大毛花花蕾特征与产量对比如实施例中表6、表9所示。8、抵御病虫害能力强在抵御病虫害能力方面，新品种金银花与亲本大毛花相比具有明显的提高。表现为幼茎及叶片绒毛浓密，粗硬而长，表现在抵御虫害入侵蚜虫和螨虫的能力强。可大大减少生长过程中农药的使用量，有利于按照GAP的标准进行金银花的绿色无公害栽培，少施或不施农药，增加金银花产品的药用安全性。9、有效药物含量高新品种金银花较亲本大毛花相比，在有效药物含量指标上较亲本大毛花相比，具有明显的提高。表现为用“高效液相色谱法”对比检验，有效药物成分氯原酸、皂苷含量吸收峰明显高于传统正品大毛花，如图2所示。


图I为本发明品系金银花TLC指纹图谱鉴定图及染色体核型分析图；图A为本发明品系金银花TLC指纹图谱鉴定图，图B为染色体核型分析2为本发明品系金银花与亲本大毛花的红外光谱图(A)及叠加后的红外光谱图(B)；a为本发明金银花品种；b为未本大毛花图3为本发明品系金银花与亲本大毛花的花蕾比较图。A为本发明金银花品种；B为未本大毛花


下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例I材料I、外植体金银花。2003年3月4日，从平邑县精诚苗木有限公司主栽I年龄传统正品大毛花优良单株。2、培养基药品等购自山东临沂化工市场。3、工具⑴解剖镜⑵显微镜⑶培养器皿⑷托架天平(5)电子分析天平(6)移液管(7)移液枪⑶容量瓶量筒烧杯⑶光照培养箱(10)冰箱(11)晾瓶架(1 酸度仪(1 刀、剪、镊(M)测微尺(15)染色体分析系统仪(16)无菌工作台肋高压灭菌锅4.方法I)外植体选择及消毒处理，选择I年龄生发育成熟，品种纯、花色好、无病虫害的健康植株,沿主轴剪取株体上部淡绿色幼嫩芽顶。将叶柄两侧叶片用消毒剪刀剪去，并将其叶柄剪成O. 5 cm的段，也可用叶片、茎或花蕾作外植体,用自来水冲洗干净,用70%乙醇溶液杀菌I. Omin,用无菌水冲洗2遍后,放入O. 1% L氯化萊溶液中消毒4min,用无菌水冲洗4 5遍后，放入消过毒的三角瓶中待用。2)培养基的 制备(I)NDT培养基母液的配制本发明提供了一种荒漠化、沙漠化治理专用金银花新品种的培育方法所使用的一种培养基，命名为NDT培养基，NDT培养基母液的配制包括以下步骤a、l号母液(大量元素)的配制步骤为，按表I中原量分别称取量，用蒸馏水将药品分别溶解，然后依次混合配成培养基母液，定容为1000mL。b、2号母液(微量元素)的配制步骤为，按表2中原量分别称取量，用蒸馏水将药品分别溶解，然后依次混合配成培养基母液，定容为1000mL。c、3号母液(铁盐元素)的配制步骤为，按表3中原量分别称取量，将Na2EDTA ·2Η20和FeSO4 · 7Η20放置右装有45mL蒸馏水的溶量瓶中，适当加热并不停搅拌，待全部溶解后，再将两种溶液合在一起，调整PH值，最后加蒸馏水定容到1000mL。3号母液的PH值5. 5 5. 8 ；d、4号母液(有机元素)的配制步骤为，按表4中原量分别称取量，用蒸馏水将药品分别溶解，然后依次混合配成培养基母液，定容为1000mL。表I. I号母液(大量元素)的配制


本发明提供了一种荒漠化、沙漠化治理专用金银花的培育方法。其特点是以传统正品为亲本，运用诱导组培方法，成功培育出染色体加倍后的4倍体新苗种。该苗种根系发达，抗逆性强，持续时间长，耐干旱、抗盐碱、抗严寒，贴地生根，自行无限繁殖。在北纬40°以北地区种植，2年内根盘占地面积可达5平方米。一株可覆盖10m2以上的沙滩，根盘覆盖土地锁含水份达200公斤左右。花蕾大，有效药物含量吸收峰高于传统正品，根、茎、叶、花、藤皆可用于药品、饮品、保健品等的生产，经济价值极为可观。利用这一方法育苗，可绿化沙漠、荒山，让荒漠了的“不毛之地”产生自我造血功能，从根本上解决沙漠治理投入大、效益低、无法维持持循环发展的难题。