结合人胶原ii的抗体的制作方法[0002]造成关节内软骨破坏的疾病和病症提出了一个重大的公共卫生问题，特别是考虑到老年人群的人口统计数据。在诸如类风湿性关节炎(RA)和骨关节炎(OA)等关节炎中，在关节软骨的退化中涉及多种机理。RA是炎症性关节炎的最常见形式，其影响3%的女性和1%的男性。OA(—种非炎症性关节炎)是关节病的最常见形式，并且是仅次于心血管疾病的提前退休和失能原因。[0003]大多数对关节疾病的治疗通常是全身性的。使药物局部地靶向关节将具有几个优点:增加的效力、减少的副作用、改善的定量给药方案和降低的货品成本。[0004]当前的局部治疗(包括糖皮质激素、可注射的透明质酸溶液、NSAID或其它小分子)在被注射进关节中以后具有相对较短的半衰期以及全身分布(Gerwin等人，Adv DrugDeliv Rev, 58:226_42，2006 ;Lindenhayn 等人，Eur J Clin Chem Biochem，35:355-63,1997)。通过使治疗剂与关节靶向剂偶联，可以实现治疗剂的关节保留(RothenfIuh等人，Nature Materials 7:248-54,2008 ；W005/097073 ;美国专利号 7，067，144)。但是，治疗可能需要用递送媒介物(诸如脂质体)进行关节内注射，从而增加复杂性程度和磨损关节表面的可能性。[0005]因而，需要开发另外的媒介物，用于有效地递送治疗剂并随后使其保留在关节中。[0006]图1.用于制备从头pIX文库的人骨架。根据Chothia进行残基编号。⑶R序列标有下划线。
[0007]图2.结合人胶原II的Fab的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的序列。指示了与野生型人骨架不同的残基。X表示与野生型相比在所述序列中缺失的残基。
[0008]图3.针对人和大鼠胶原I和II的Fab的交叉反应性。
[0009]图4.抗-胶原II Fab与人软骨的结合。
[0010]图5.抗-胶原II Fab在骨关节炎的关节中的保留。*P < 0.05，#P < 0.01 ;相对于对照CNTO 4234。在CNTO 3631注射后IOmin和I小时时的计数因为太高而不能读出。
[0011]图6.抗-胶原II Fab在骨关节炎的滑液中的保留。*P < 0.05 ;#P < 0.01 ;相对于对照CNTO 4234。

[0012]本发明的一个方面是一种分离的结合人胶原II的单克隆抗体或其片段，其包含重链可变区(VH区)和轻链可变区(VL区)，其中所述VH区包含如下所示的重链互补性决定区(CDR) 1、2 和 3 (HCDR1、HCDR2 和 HCDR3)序列
[0013]1.SEQ ID NO:8、14 和 20 ;
[0014]iiSEQ ID NO:9、15 和 21 ;
[0015]iii SEQ ID NO:9、15 和 22 ;
[0016]iv.SEQ ID NO:9、15 和 23 ;
[0017]V.SEQ ID NO:9、15 和 24 ;
[0018]v1.SEQ ID NO:9、15 和 25 ;
[0019]vi1.SEQ ID NO:9、15 和 26 ;
[0020]viii SEQ ID NO:9、15 和 27 ;
[0021]ix.SEQ ID NO:9、15 和 28 ;
[0022]X.SEQ ID NO: 10、16 和 29 ;
[0023]x1.SEQ ID NO:11、17 和 30 ;
[0024]xii SEQ ID NO:12 、18 和 31 ;或
[0025]xiii SEQ ID NO: 13、19 和 32 ;并且
[0026]所述VL区包含如下所示的轻链⑶R1、2和3 (IXDR1、IXDR2和IXDR3)序列
[0027]xiv.SEQ ID NO:33,42 和 46 ；
[0028]XV.SEQ ID NO:34、42 和 47 ；
[0029]xv1.SEQ ID NO:35,43 和 48 ；
[0030]xvii SEQ ID NO:36、44 和 49 ;
[0031]xviii SEQ ID NO:37、42 和 50 ;
[0032]xix.SEQ ID NO:38、42 和 51 ;
[0033]XX.SEQ ID NO:35、44 和 52 ；
[0034]xx1.SEQ ID NO:39,42 和 53 ；
[0035]xxii SEQ ID NO:40、45 和 54 ;或
[0036]xxii1.SEQ ID NO:41、42 和 55。
[0037]本发明的另一个方面是一种分离的结合人胶原II的单克隆抗体或其片段，其包含 VH 区和 VL 区，其中所述 VH 区包含具有 SEQ ID NO:56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67或68中所示的序列的氨基酸序列，并且所述VL区包含具有SEQ ID NO:69、70、71、72、73、74、75、76、5或7中所示的序列的氨基酸序列。
[0038]本发明的另一个方面是一种分离的结合人胶原II的抗体，其包含VH区和VL区，其中所述VH区包含如SEQ ID NO:9、15和28中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，并且所述VL区包含如SEQ ID NO:39,42和53中所示的LCDRl、LCDR2和LCDR3序列。
[0039]本发明的另一个方面是一种分离的结合人胶原II的单克隆抗体或其片段，其包含VH区和VL区，其中所述VH区包含如SEQ ID NO:11、17和30中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，并且所述VL区包含如SEQ ID NO:34、42和47中所示的LCDRl、LCDR2和LCDR3序列。
[0040]本发明的另一个方面是一种分离的抗体重链可变区，其包含SEQ ID NO:56,57,58、59、60、61、62、63、64、65、66、67 或 68 中所示的氨基酸序列。
[0041]本发明的另一个方面是一种分离的抗体轻链可变区，其包含SEQ ID NO:69,70,71、72、73、74、75或76中所示的氨基酸序列。
[0042]本发明的另一个方面是分离的多核苷酸，其编码本发明的抗体重链可变区和抗体轻链可变区。
[0043]本发明的另一方面是一种载体，其包含至少一种本发明的多核苷酸。
[0044]本发明的另一方面是一种宿主细胞，其包含本发明的载体。
[0045]本发明的另一个方面是一种制备结合人胶原II的抗体的方法，所述方法包括:培养本发明的宿主细胞，以及回收由所述宿主细胞产生的抗体。

[0046]本说明书中所引用的所有出版物(包括但不限于:专利和专利申请)均以引用方式并入本文，如同在本文中完整给出。
[0047]除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。本文描述了示例性的组合物和方法，不过类似或等同于本文所述的组合物和方法的任何组合物和方法都可用于本发明实践或测试。
[0048]术语“抗体”包括整个抗体及其任何片段。抗体片段包含免疫球蛋白分子的至少一部分，诸如得自抗体重链或轻链的互补性决定区(CDR)、可变区、恒定区或构架区。抗体可以是Fab、F(ab)、F(ab)2、scFv、dsFv或双体。抗体可以是单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体、人源化或人源性抗体、二聚抗体、四聚抗体或多聚抗体。上述抗体片段的结构、制备技术、以及所述抗体及其片段的用途本领域众所周知的(Ausubel等人编，Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY 1987-2001 ;Sambrook 等人，MolecularCloning:A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor, NY, 1989 ;Harlow 和 Lane,Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989 ;Colligan 等人编，Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY 1994-2001 ；Colligan等人，Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, 1997-2001 ；Kohler 等人，Nature，256:495-497,1975 ;Queen 等人，Proc Natl Acad Sci,86:10029-33,1989 ;美国专利号4，816，567)。例如，鼠单克隆抗体可以由Kohler等人的杂交瘤方法(Nature 256:495-497,1975)来制造。嵌合的mAb可以通过在美国专利号4，816，567中公开的方法来制备。可以通过本领域技术人员已知的技术(例如美国专利号5，225，539所公开的技术)来制备这样的人适应mAb，其具有衍生自非人供体免疫球蛋白(通常是鼠)的CDR和其分子的衍生自一种或多种人免疫球蛋白的剩余免疫球蛋白衍生部分。可用于人适应的人构架序列可以由本领域技术人员从相关数据库选择。任选地，通过诸如在Queen等A? Proc.Natl.Acad.Sc1.(USA)，86: 10029-10032,1989 和 Hodgson 等人，Bio/Technology,9 =421,1991中公开的那些技术来掺入改变的构架支持残基以保留结合亲和力，可以进一步修饰人适应mAb。
[0049]缺乏任何非人序列的完全人单克隆抗体，可通过在例如下述文献中提到的技术从人免疫球蛋白转基因小鼠制备:Lonberg等人，Nature 368:856-859,1994 ;Fishwild等人，Nature Biotechnologyl4:845-851,1996 ；和 Mendez 等人，Nature Geneticsl5:146-156，1997。还可以通过在例如下述文献中提到的技术从噬菌体展示文库制备和优化人 mAb:Knappik 等人，J .Mol.Biol.296:57-86, 2000 ;和 Krebs 等人，J.Tmmuno1.Meth.254:67-842001。抗体的片段例如Fab、F(ab’)2、Fd和dAb片段可通过抗体的切割或者通过重组工程来产生。例如，Fab和F(ab’)2片段可通过用酶如胃蛋白酶处理抗体来产生。
[0050]免疫球蛋白可以根据重链恒定域氨基酸序列分为五种主要种类，即IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM0 IgA 和 IgG 进一步再被分为同种型 IgAp IgA2、IgGp IgG2、IgG3 和 IgG4。
[0051]抗体可变区由被3个“抗原结合位点”中断的“构架”区组成。使用不同的术语来定义抗原结合位点:(i)三个在VH中(HCDR1、HCDR2、HCDR3)且三个在VL中(LCDR1、LCDR2、LCDR3)的互补性决定区(CDR)是基于序列变异性(Wu和Kabat，J.Exp.Med.132 =211-250,1970 ;Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版。PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.,1991)。(ii)三个在VH (H1、H2、H3)中和三个在VL (L1、L2、L3)中的“超变区”、“ HVR”或“HV”，指抗体可变区中的在结构上超变的区域，如 Chothia 和 Lesk (Chothia 和 Lesk,Mol.Biol.196:901-917,1987)所定义。其它术语包括 “ IMGT-CDR” (Lefranc 等人，Dev.Comparat.Tmmuno1.27:55-77,2003)和“特异性决定残基选择” (SDRU) (Almagro, Mol.Recognit.17:132-143，2004)。International ImMunoGeneTics (IMGT)数据库(http://www_imgt_org)提供了抗原结合位点的标准化编号和定义。CDR、HV和MGT描绘(delineation)之间的对应性参见Lefranc等人，Dev.Comparat.Tmmuno1.27:55-77, 2003。
[0052]“构架”或“构架序列”是可变区的除了被定义为抗原结合位点的那些序列之外的其余序列。构架通常分成四个区域FRl、FR2、FR3和FR3，它们形成每个可变区中的三个抗原结合位点的骨架。因为抗原结合位点可以由上面所述的各种术语定义，所以构架的精确氨基酸序列取决于如何定义抗原结合位点。
[0053]本文使用的术语“结合人胶原II的抗体”表示，根据在实例2中描述的方法，使用用10 ii g/mL人胶原II包被的平板，在ELISA测定中以I y g/ml或更小的EC50结合人胶原
II的抗体。
[0054]本文使用的术语“人胶原II”或huColII表示，从软骨分离出的人II型胶原。人胶原II被合成为前胶原aCol2Al链(SEQ ID NO:79)。所述前胶原分子被分泌进细胞外基质中，在此处它形成原纤维。原纤维形成伴有特异性蛋白水解酶对C-和N-前肽的去除。原纤维hucolll的加工是众所周知的。
[0055]术语“载体”是指能够在生物系统内复制或可以在此类系统间移动的多核苷酸。载体多核苷酸通常含有诸如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记之类的元件，其功能是促进这些多核苷酸在生物系统中的复制或保持`。此类生物系统的例子可包括细胞、病毒、动物、植物和用能够复制载体的生物组分再造的生物系统。包含载体的多核苷酸可以是DNA或RNA分子或这些分子的杂合分子。
[0056]术语“表达载体”是指可用于在生物系统或再造生物系统中指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列所编码的多肽的翻译的载体。
[0057]术语“多核苷酸”是指包含由糖-磷酸主链或其它等同的共价化学方式所共价连接的核苷酸链的分子。双链DNA和单链DNA以及双链RNA和单链RNA是多核苷酸的典型例子。
[0058]术语“多肽”或“蛋白质”是指包含至少两个由肽键连接以形成多肽的氨基酸残基的分子。少于50个氨基酸的小多肽可以称作“肽”。[0059]本文使用如下的常规单字母和三字母氨基酸代码: