专利名称：一种混合固态发酵生产复合调味汁的方法虾主要分为淡水虾和海水虾。淡水虾有青虾、河虾、草虾、小龙虾等；对虾、明虾、基围虾、南极磷虾、龙虾等都是海水虾。虾的肉质肥嫩鲜美，老幼皆宜，备受青睐。虾含有丰富的动物蛋白质、能降低人体血清胆固醇的牛磺酸，还含有丰富的钾、碘、镁、磷、锌、钙等微量元素和维生素A等成分，虾的脂肪中不饱和脂肪酸含量高。2007年全球虾产量超过600万吨，中国虾的产量超过200万吨，其中养殖产量占到一半多。据报道，南极磷虾是地球上已知的蛋白质含量最高的生物物种之一，其生物量就约为6-10亿吨，年可捕捞量约为0. 6亿吨以上。因此南极磷虾虾是一个有巨大发展与开发潜力的水产生物资源。远洋捕捞生产的市售南极磷虾粉一般做为动物饲料应用，没有充分发挥其价值。 南极磷虾粉含有65%的蛋白质和多种人类营养需要的营养物质。科学分析发现，南极磷虾蛋白质生物利用效价高，用南极磷虾粉发酵生产调味品是有效提高其经济价值的技术方法。蛋白质是人体必需的主要营养物质之一，其分解产物是氨基酸。氨基酸的重要生理功能之一是作为蛋白质或多肽的基本组成单位，与生物的生命活动有着密切的关系。除可形成蛋白质外，某些氨基酸还具有突出的呈味作用，如谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸呈鲜味；甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸呈甜味。某些氨基酸还参与一些特殊的代谢反应，如谷氨酸、天冬氨酸具有兴奋性递质作用，谷氨酸对改进和维持脑功能必不可少；赖氨酸可以调节人体代谢平衡， 提高钙的吸收及其在体内的积累，加速骨骼生长；蛋氨酸对有毒物或药物进行甲基化而起到解毒的作用；色氨酸在医药上用作抗闷剂、抗痉挛剂、胃分泌调节剂、胃粘膜保护剂和强抗昏迷剂等；缬氨酸治疗肝功能衰竭等疾病；亮氨酸可用作头晕治疗剂及营养滋补剂；异亮氨酸能治疗神经障碍、食欲减退和贫血；苏氨酸参与脂肪代谢，缺乏苏氨酸时出现肝脂肪病变等。进一步来说，全国范围内调味品业的增长每年都在20%以上，现在仅以植物蛋白质为原料发酵生产的酱油类调味品的年产量就已达到500万吨。以低质鱼类为原料生产的动物蛋白调味品仅为3. 3万吨，只占酱油类产量的0. 66%。因此，利用虾蛋白质为原料采取发酵工程技术开发生物利用价值高的复合调味汁符合社会需求，前景广阔。对用南极磷虾为原料生产复合调味汁的研究到目前为止报导很少。任艳探索了不同蛋白酶酶解南极磷虾制备海鲜调味料，选出一种最优酶，并通过响应面实验优化酶解条件，通过回归分析法建立了能较好地预测磷虾酶解的数学模型方程。根据模型方程得到的最佳酶解条件为初始PH7. 98，温度44. 85°C，加酶量115%。(w/w)。各因素对响应值影响的大小顺序为加酶量>酶解温度>初始PH。酶解得到南极磷虾胰蛋白酶酶解液中的 α -氨基氮含量为0. 690士0. 012g/100ml (任艳，中国海洋大学2009食品科学学位论文“南极磷虾蛋白加工利用的初步研究”)。此项研究所采用的单酶酶种价格昂贵和没有大量产品，且酶解液α-氨基氮含量偏低，故研究的酶解南极磷虾海鲜调味料工艺难以产业化。栾兴社研究了以扇贝下脚料为主要原料采用米曲霉、红曲霉、产脂酵母共同发酵生产海鲜调味汁的生产工艺，产品含20多种氨基酸，游离氨基酸含量为8569mg/100g，必需氨基酸为 2386mg/100g，牛黄酸为66;3mg/100g，红曲色价为340(栾兴社.红曲海鲜调味汁的生产工艺研究冲国酿造，2001，2 :15-16)。可是扇贝下脚料与南极磷虾蛋白质的成分和组织构成差别较大，存在生物降解性能的差异。氨基酸含量是以蛋白质为主原料调味品品质的首要衡量指标，所以，低成本提高氨基酸生成率和综合解决调味品风味结构是现代生物工程急需攻克的技术课题。
本发明提供了一种混合固态发酵生产复合调味汁的方法。该方法所发酵生产的虾味复合调味汁体态圆满，色泽棕红，酱香浓郁，虾味风格突出，鲜香厚重持久，总氨基酸 8550-8600mg/100g,必需氨基酸 3200_3250mg/100g，牛磺酸 450_480mg/100g，呈味核苷酸 45-50mg/100go本发明的技术是一种混合固态发酵生产复合调味汁的方法，其特征是，以南极磷虾为主原料通过多菌种多层次固态发酵生产功能性复合调味汁，依次包括以下步骤(1)南极磷虾酿造粉的制备取南极磷虾粉(市售，水份为8% -12%，细度为40-80目)，以有机溶剂浸提分离出脂肪成分，得到蛋白质含量> 65%，核酸含量> 0. 7%，脂肪含量< 0. 5%及水分含量 (4%的南极磷虾酿造粉备用；所述浸提条件优选为以酒精为溶剂，10_30°C下浸提40-80min ；所述南极磷虾粉与酒精的重量比为1 2 5;(2)生产曲种的扩大培养①培养基及制备菌种斜面培养基5° Β 麦芽汁琼脂；三角瓶、曲盒培养基南极磷虾酿造粉曲种固体培养基。制备方法按重量比南极磷虾酿造粉麸皮豆粕=1-2 6-8 1-2的比例配成料，然后按料水=1 1. 0-1. 5 的比例加入水拌和，得到三角瓶、曲盒培养基；②接种及培养斜面培养将米曲霉(Aspergillusoryzae)CICC 2247、黑曲霉(Aspergillus niger)CICC40384 和米曲霉(Aspergillus oryzae)AS 3. 800，分别接种 5° Β 麦芽汁琼脂斜面，培养96-120h，至斜面孢子生长成熟；三角瓶扩大培养将上述米曲霉CICC 2247斜面孢子、黑曲霉CICC 40384斜面孢子和米曲霉AS 3. 800斜面孢子分别接种不同的三角瓶，搅拌均勻，2648°C培养67-7 ，分别得到三角瓶扩大培养曲种；曲盒扩大培养用于曲盒培养的培养基灭菌后移到接种台上快速冷却至 40士2°C，分为三组；分别按重量比0.5% -1.0%的接种量接入米曲霉CICC 2247三角瓶扩大培养曲种、黑曲霉CICC 40384三角瓶扩大培养曲种和米曲霉AS 3. 800三角瓶扩大培养曲种；然后拌勻，分别按2-3cm厚度在曲盒内摊平，28-30°C培养68-7 (孢子数达到6-8父109/^干基)，分别得到米曲霉(10 2247生产曲种、黑曲霉CICC 40384生产曲种和米曲霉AS 3. 800生产曲种备用；⑶发酵①生产培养基及制备生产培养基用于生产的南极磷虾酿造粉固体培养基。制备方法按重量比蛋白质混合料(重量比南极磷虾酿造粉豆粕=6-8 2-4)小麦片麸皮= 60-70 20-30 6-10的比例配成料，然后按料水=1 0. 8-1. 0的比例加入水拌和，用高压蒸汽蒸锅蒸料(条件为0. 18-0. 25MPa下维持3-5min)，得蒸煮生产培养基备用。②共同培养将蒸煮生产培养基按0. 5 % -1. 0 %的接种量接种米曲霉CICC 2247生产曲种、 黑曲霉CICC40384生产曲种和米曲霉AS 3. 800生产曲种的混合生产曲种，其中混合生产曲种中2247、40384和3. 800生产曲种的重量比为6-8 1-4 1-3 ;30_36 °C共同培养 22-32h，得生产曲料备用，其制备的生产曲料的指标为每克生产曲料干基中性蛋白酶活性彡1700U，酸性蛋白酶活性> 2000U，液化性淀粉酶> 250U，糖化型淀粉酶> 3000U，氨肽酶彡 1300U ；③复合发酵按重量比生产曲料20° Β 食盐水麦芽根=100 100-300 0. 1-1. 0进行混合，控制42-49°C进行发酵；发酵至第7-10天加入生产曲料干重0. 1_1. 0%。的安琪生香高活性干酵母，继续发酵至13-16天，得发酵醅；(4)后处理将该发酵醅加入其质量3-6倍的70_80°C热水浸泡15-2 ，然后于压力IOMpaJj^ 度10-60°C下进行压榨，75-90°C灭菌10-20min后得产品。复合发酵生产的复合调味汁体态圆满，色泽棕红，酱香浓郁，虾鲜风味突出， 鲜香厚重持久，总氨基酸8550-8600mg/100g，必需氨基酸3200_3250mg/100g，牛磺酸 450-480mg/100g,呈味核苷酸 45_50mg/100g。本发明的有益效果是本发明生产的复合调味汁具有风味独特、营养丰富的优点， 本发明采用资源丰富、比较廉价的南极磷虾粉为主要原料进行海鲜复合调味品生产，提供了南极磷虾资源深加工的技术途径，提高了经济价值，丰富了市场需求，适应国情。本发明由于采取固态发酵方法进行发酵，大大节约了生产投资和降低了生产的条件要求，降低了生产成本(成本为2300-2500元/吨液态产品，每吨南极磷虾酿造粉可生产液态复合调味汁5-6吨，效益增加10倍以上)，有效增加了产品风味和产品色泽。该方法通过多菌种混合培养，与采用米曲霉CICC 2247单菌种相比，有效增加了蛋白酶、氨肽酶、糖化酶等酶的种类，强化了复合功能，更能满足发酵环境(特别是PH)发生变化时的生物降解反应，达到更好的氨基酸(提高>38%)、单糖类(提高>43%)、呈鲜核苷酸类物质(提高彡51%)等生成的发酵效果。取市售南极磷虾粉(水份为8%-12%，细度为40-80目)，以酒精为溶剂(按重量比南极磷虾粉酒精=1 幻在12°C下浸提50min分离出脂肪成分，得到蛋白质含量彡65%，核酸含量彡0. 7%，脂肪含量< 0. 5%及水分含量< 4%的南极磷虾酿造粉备用；(2)生产曲种的扩大培养①培养基及制备菌种斜面培养基5° Β 麦芽汁琼脂。制作方法取大麦芽粉碎后加入4倍重量的水，搅勻，在58-60°C之间保温3-6h，糖化完成，过滤得麦芽汁。用水调整到所需波美度，分装，0. 8Kg/cm2高压蒸汽灭菌30min后备用。三角瓶、曲盒培养基南极磷虾酿造粉曲种固体培养基，其配比为重量比南极磷虾酿造粉麸皮豆粕=1:8:1。制备方法按重量比料水=1 1. 1拌和，得三角瓶、曲盒培养基。用于300mL三角瓶的培养基按每瓶10克干基装入，然后高压蒸汽灭菌，用于曲盒的培养基可直接用蒸锅灭菌蒸煮，灭菌条件于121°C下30min。②接种及培养斜面培养将米曲霉(Aspergillusoryzae)CICC 2247、黑曲霉(Aspergillus niger)CICC40384 和米曲霉(Aspergillus oryzae)AS 3. 800，分别接种 5° Β 麦芽汁琼脂斜面，28°C培养96h，至斜面孢子生长成熟；三角瓶扩大培养将上述米曲霉CICC 2247斜面孢子、黑曲霉CICC 40384斜面孢子和米曲霉AS 3. 800斜面孢子分别接种不同的三角瓶，搅拌均勻，28°C培养70h，分别得到三角瓶扩大培养曲种；曲盒扩大培养用于曲盒培养的灭菌培养基移到接种台上快速冷却至40°C，分为三组；分别按重量比0. 6%的接种量接入米曲霉CICC 2247三角瓶扩大培养曲种、黑曲霉 CICC 40384三角瓶扩大培养曲种和米曲霉AS 3. 800三角瓶扩大培养曲种；然后拌勻，分别按2. 5cm厚度在曲盒内摊平，培养6 (孢子数达到6-8X 109/g干基)，分别得到米曲霉CICC 2247生产曲种、黑曲霉CICC 40384生产曲种和米曲霉AS 3. 800生产曲种备用。⑶发酵①生产培养基及制备生产培养基用于生产的南极磷虾酿造粉固体培养基，配比为重量比蛋白质混合料(重量比南极磷虾酿造粉豆粕=7 3)小麦片麸皮=60 30 10。小麦片是小麦采用对辊机压成。培养基制备方法按料水=1 0.8，拌和。用高压蒸汽蒸锅蒸料， 条件控制为0. 25Mpa维持3min，并降温至45°C，得蒸煮生产培养基备用。②共同培养将蒸煮生产培养基按0.6%的接种量接种米曲霉CICC 2247生产曲种、黑曲霉 CICC 40384生产曲种和米曲霉AS 3. 800生产曲种的混合生产曲种，其中混合生产曲种中 2247、40384和3. 800生产曲种的重量比为7 2 1 ;35°C共同培养^h，得生产曲料备用，其制备的生产曲料的指标为每克生产曲料干基中性蛋白酶活性> 1700U，酸性蛋白酶活性> 2000U，液化性淀粉酶> 250U，糖化型淀粉酶> 3000U，氨肽酶> 1300U。③复合发酵按生产曲料20° Β 食盐水麦芽根=100 250 0.8(以重量计算)进行混合，控制46°C进行发酵；发酵至第8天加入生产曲料干重0. 3%。的安琪生香高活性干酵母，继续发酵至14天，得发酵醅。(4)后处理将该发酵醅加入其质量3倍的73°C热水浸泡20h，然后于压力lOMpa，温度37°C条件下进行压榨，85°C灭菌15min后得产品。复合发酵生产的复合调味汁体态圆满，色泽棕红，酱香浓郁，虾鲜风味突出，鲜香厚重持久，总氨基酸8560mg/100g，必需氨基酸3210mg/100g，牛磺酸460mg/100g，呈味核苷酸 47mg/100go实施例2(1)南极磷虾酿造粉的制备取市售南极磷虾粉(水份为8 % -12 %，细度为40-80目)，以酒精为溶剂(按重量比南极磷虾粉酒精=1 2.8)在10°C下浸提70min分离出脂肪成分，得到蛋白质含量彡65%，核酸含量彡0. 7%，脂肪含量< 0. 5%及水分含量< 4%的南极磷虾酿造粉备用；(2)生产曲种的扩大培养①培养基及制备菌种斜面培养基5° Β 麦芽汁琼脂。制作方法取大麦芽粉碎后加入4倍重量的水，搅勻，在58-60°C之间保温3-6h，糖化完成，过滤得麦芽汁。用水调整到所需波美度，分装，0. 8Kg/cm2高压蒸汽灭菌30min后备用。三角瓶、曲盒培养基南极磷虾酿造粉曲种固体培养基，其配比为重量比南极磷虾酿造粉麸皮豆粕=1 7 2。制备方法按重量比料水=1 1.2拌和，得三角瓶、曲盒培养基。用于300mL三角瓶的培养基按每瓶10克干基装入，然后高压蒸汽灭菌，用于曲盒的培养基可直接用蒸锅灭菌蒸煮，灭菌条件为121°C下30min。②接种及培养斜面培养将米曲霉(Aspergillusoryzae)CICC 2247、黑曲霉(Aspergillus niger)CICC40384 和米曲霉(Aspergillus oryzae)AS 3. 800，分别接种 5° Β 麦芽汁琼脂斜面，28°C培养100h，至斜面孢子生长成熟；三角瓶扩大培养将上述米曲霉CICC 2247斜面孢子、黑曲霉CICC 40384斜面孢子和米曲霉AS 3. 800斜面孢子分别接种不同的三角瓶，搅拌均勻，28°C培养72h，分别得到三角瓶扩大培养曲种；曲盒扩大培养用于曲盒培养的灭菌培养基移到接种台上快速冷却至39°C，分为三组；分别按重量比0. 7%的接种量接入米曲霉CICC 2247三角瓶扩大培养曲种、黑曲霉 CICC 40384三角瓶扩大培养曲种和米曲霉AS 3. 800三角瓶扩大培养曲种；然后拌勻，分别按2. 7cm厚度在曲盒内摊平，培养70h (孢子数达到6_8X 109/g干基)，分别得到米曲霉CICC 2247生产曲种、黑曲霉CICC 40384生产曲种和米曲霉AS 3. 800生产曲种备用。(3)发酵①生产培养基及制备生产培养基用于生产的南极磷虾酿造粉固体培养基，配比为重量比蛋白质混合料(重量比南极磷虾酿造粉豆粕=6 4)小麦片麸皮=65 25 10。小麦片是小麦采用对辊机压成。培养基制备方法按料水=1 0.9拌和。用高压蒸汽蒸锅蒸料，条件控制为0. 20Mpa维持％iin，并降温至45°C，得蒸煮生产培养基备用。②共同培养将蒸煮生产培养基按0.7%的接种量接种米曲霉CICC 2247生产曲种、黑曲霉 CICC 40384生产曲种和米曲霉AS 3. 800生产曲种的混合生产曲种，其中混合生产曲种中 2247、40384和3. 800生产曲种的重量比为7. 5 1. 5 1 ;36°C共同培养^h，得生产曲料备用，其制备的生产曲料的指标为每克生产曲料干基中性蛋白酶活性> 1700U，酸性蛋白酶活性> 2000U，液化性淀粉酶> 250U，糖化型淀粉酶> 3000U，氨肽酶> 1300U。③复合发酵按生产曲料20° Β 食盐水麦芽根=100 260 0.9(以重量计算)进行混合，控制43°C进行发酵；发酵至第9天加入生产曲料干重0. 4%。的安琪生香高活性干酵母， 继续发酵至15天，得发酵醅。(4)后处理将该发酵醅加入其质量3. 3倍的76°C热水浸泡18h，然后于压力lOMpa，温度30°C 条件下进行压榨，80°C灭菌17min后得产品。复合发酵生产的复合调味汁体态圆满，色泽棕红，酱香浓郁，虾鲜风味突出，鲜香厚重持久，总氨基酸8555mg/100g，必需氨基酸3220mg/100g，牛磺酸460mg/100g，呈味核苷酸 46mg/100go实施例3(1)南极磷虾酿造粉的制备取市售南极磷虾粉(水份为8 % -12 %，细度为40-80目)，以酒精为溶剂(按重量比南极磷虾粉酒精=1 3. 在15°C下浸提60min分离出脂肪成分，得到蛋白质含量彡65%，核酸含量彡0. 7%，脂肪含量< 0. 5%及水分含量< 4%的南极磷虾酿造粉备用；(2)生产曲种的扩大培养①培养基及制备菌种斜面培养基5° Β 麦芽汁琼脂。制作方法取大麦芽粉碎后加入4倍重量的水，搅勻，在58-60°C之间保温3-6h，糖化完成，过滤得麦芽汁。用水调整到所需波美度，分装，0. 8Kg/cm2高压蒸汽灭菌30min后备用。三角瓶、曲盒培养基南极磷虾酿造粉曲种固体培养基，其配比为重量比南极磷虾酿造粉麸皮豆粕=1.5 7.5 I0制备方法按重量比料水=1 1. 1拌和，得三角瓶、曲盒培养基。用于300mL三角瓶的培养基按每瓶10克干基装入，然后高压蒸汽灭菌，用于曲盒的培养基可直接用蒸锅灭菌蒸煮，灭菌条件为121°C下30min。②接种及培养斜面培养将米曲霉(Aspergillusoryzae)CICC 2247、黑曲霉(Aspergillus niger)CICC40384 和米曲霉(Aspergillus oryzae)AS 3. 800，分别接种 5° Β 麦芽汁琼脂斜面，28°C培养100h，至斜面孢子生长成熟；三角瓶扩大培养将上述米曲霉CICC 2247斜面孢子、黑曲霉CICC 40384斜面孢子和米曲霉AS 3. 800斜面孢子分别接种不同的三角瓶，搅拌均勻，2648°C培养72h，分别得到三角瓶扩大培养曲种；曲盒扩大培养用于曲盒培养的灭菌培养基移到接种台上快速冷却至40°C，分为三组；分别按重量比0. 8%的接种量接入米曲霉CICC 2247三角瓶扩大培养曲种、黑曲霉CICC 40384三角瓶扩大培养曲种和米曲霉AS 3. 800三角瓶扩大培养曲种；然后拌勻，分别按3cm厚度在曲盒内摊平，30°C培养68h (孢子数达到6_8X 109/g干基)，分别得到米曲霉 CICC 2247生产曲种、黑曲霉CICC 40384生产曲种和米曲霉AS 3. 800生产曲种备用。(3)发酵①生产培养基及制备生产培养基用于生产的南极磷虾酿造粉固体培养基，配比为重量比蛋白质混合料(重量比南极磷虾酿造粉豆粕=6.5 3.5)小麦片麸皮=66 25 9。小麦片是小麦采用对辊机压成。培养基制备方法按料水=1 0.8，拌和。用高压蒸汽蒸锅蒸料，条件控制为0. 23Mpa维持％iin，并降温至45°C，得蒸煮生产培养基备用。②共同培养将蒸煮生产培养基按0.8%的接种量接种米曲霉CICC 2247生产曲种、黑曲霉 CICC 40384生产曲种和米曲霉AS 3. 800生产曲种的混合生产曲种，其中混合生产曲种中 2247、40384和3. 800生产曲种的重量比为8 1. 3 0. 7 ;35°C共同培养^h，得生产曲料备用，其制备的生产曲料的指标为每克生产曲料干基中性蛋白酶活性> 1700U，酸性蛋白酶活性> 2000U，液化性淀粉酶> 250U，糖化型淀粉酶> 3000U，氨肽酶> 1300U。③复合发酵按生产曲料20° Β 食盐水麦芽根=100 270 0.9(以重量计算)进行混合，控制47°C进行发酵；发酵至第9天加入生产曲料干重0. 6%。的安琪生香高活性干酵母， 继续发酵至15天，得发酵醅。(4)后处理将该发酵醅加入其质量的3. 5倍的75°C热水浸泡22h，然后于压力lOMpa，温度 33 °C条件下进行压榨，78 °C灭菌19min后得产品。复合发酵生产的复合调味汁体态圆满，色泽棕红，酱香浓郁，虾鲜风味突出，鲜香厚重持久，总氨基酸8560mg/100g，必需氨基酸3235mg/100g，牛磺酸46;3mg/100g，呈味核苷酸 48mg/IOOg0

本发明公开了一种混合固态发酵生产复合调味汁的方法，属于生物技术与生物工程领域。它是以南极磷虾为原料，将米曲霉CICC 2247、黑曲霉CICC 40384和米曲霉AS 3.800分别经斜面培养、三角瓶扩大培养和曲盒扩大培养后的曲种再经共同培养后得到生产曲料，然后再加入食盐水、麦芽根及生香活性酵母复合发酵后，经后处理得到产品。所生产的复合调味汁体态圆满，色泽棕红，酱香浓郁，虾鲜风味突出，鲜香厚重持久，总氨基酸8550-8600mg/100g，必需氨基酸3200-3250mg/100g，牛磺酸450-480mg/100g，呈味核苷酸45-50mg/100g。