专利名称：一种丝素羟基磷灰石复合材料及其制备方法 骨缺损、骨不连是临床常见的骨创伤、感染后遗症，如何修复骨缺损、骨不连一直是骨科界的棘手问题。因此在骨科、牙科、整容、颌面修复等外科手术中经常需要优良性质的生物活性人工骨材料。羟基磷灰石(Hydoxyapatite，简称HA)，其化学式为Ca10(PO4)6(OH)2，是构成骨和牙的主要无机质，其化学成分、晶体结构、物化性能都与人的正常骨的无机物相似，具有良好的生物相容性和生物活性，但是纯羟基磷灰石材料较脆，弯曲强度低，几乎没有韧性，不能适应骨移植[Pompea W，Worch H，Schulte K，Materials Science andEngineering，2003，362(1)40-60]。为了提高钙·磷材料的柔韧性和可加工性，模仿天然骨的组成结构特点，制备具有生物活性和力学性能良好的无机/有机复合生物材料作为硬组织的骨修复、替代材料和组织工程骨修复体材料的主体，日益受到广泛重视。目前，许多方法己用于羟基磷灰石陶瓷的增韧补强。例如，层状结构、纳米颗粒、金属间化合物颗粒、金属颗粒、晶须、碳纤维等。赵俊亮等[碳纤维增强羟基磷灰石/环氧树脂复合材料的制备与力学性能，材料科学与工程学报，2003，21(5)640-643]采用环氧树脂、碳纤维与羟基磷灰石复合，使羟基磷灰石陶瓷的韧性和强度提高，但是，由于在复合的过程中引入了第二相，往往会导致生物相容性的下降，一般说来，用生物惰性材料增强的羟基磷灰石材料的生物活性会比纯羟基磷灰石的低。因此必须采用生物相容性好的材料来增加羟基磷灰石材料的韧性。研究表明蚕丝蛋白无毒、无刺激性，具有良好的生物相容性，能够促进人体细胞的生长，具有生物可降解性(David L.Kaplan，Silk-basedbiomaterials；Biomaterials，2003，24401-416)，由于蚕丝蛋白分子链上含有许多极性基团，该基团与极性无机材料相容性好，可以用来提高羟基磷灰石的韧性。将羟基磷灰石与蚕丝蛋白复合后，能使二者的优良性能充分结合，从而可得到生物相容性和生物活性的骨修复和重建骨修复体材料。蚕丝纤维与织物具有较高的韧性和强度，作为增强材料加入后可以提高材料的强度和韧性。在本发明作出之前，中国专利“羟基磷灰石颅骨种植体”(公开号CN1370507A)公开了一种在蚕丝网、空心尼龙网之间分层加入羟基磷灰石粉制成颅骨种植体的技术，它采用在层与层之间由粘合剂相连接，然后加压加温100℃左右成型的方案，由于手工涂敷或机械模压成型方法制得复合层结构的人工颅骨修复材料，材料中不存在相互贯通的空隙，因此，这种羟基磷灰石复合材料不适合用于组织工程中的细胞培养支架。同样，胡佳山等[材料科学与工程.2001，19(3)79-83]将碳纤维和原蚕丝经有机试剂进行表面处理后制成长度为2mm左右的纤维与羟基磷灰石拌合，并以10MPa压力压制成型，采用上述技术得到的复合骨水泥，也不能形成一定大小的相互贯通的空隙，无法实现细胞的培养，因此，其应用面受到了限制。目前，在生物医学材料领域，十分需要一种不仅具有良好的生物相容性和力学性能，且能适用于细胞培养的组织工程材料。
本发明目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种具备良好力学性能、细胞相容性和适当降解速率的丝素羟基磷灰石多孔复合材料及其制备方法，为组织工程提供一种新材料。为达到上述目的，本发明采用的技术方案是一种丝素羟基磷灰石复合材料，它由羟基磷灰石、家蚕丝素蛋白、蚕丝增强材料组成，其质量比为1∶0.1～5∶0.001～0.1，复合材料中具有孔径为1～100微米的相互贯通的孔隙，孔隙体积占50～90％。它的抗弯强度为0.1～20MPa，抗弯模量为50～2000Mpa。
制备上述丝素羟基磷灰石复合材料的方法，其制备步骤如下1、把浓度为1～20％的丝素蛋白溶液与羟基磷灰石粉末混合均匀，再加入蚕丝增强材料，将混合物置于金属模具中；
2、将上述金属模具低温快速冷冻10min～24h，使模具内的混合物形成冷冻体；3、将含有冷冻体的金属模具在-10～-30℃的温度条件下冷冻10～24h后，把分子量低于100的醇类、酮类、醛类有机试剂渗入冷冻体中，再在20～40℃的温度条件下预干燥；4、在110～130℃的温度条件下干燥定型，得到丝素羟基磷灰石多孔复合材料。
上述技术方案中，所述的羟基磷灰石为纳米级；所述的蚕丝增强材料为脱过胶的茧壳单丝、并丝、真丝织物；所述的分子量低于100的醇类、酮类、醛类有机试剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、叔丁醇、丙酮、丁酮、甲醛、乙醛、丙醛、丁醛的一种或几种；所述的低温快速冷冻是在-70℃以下的液体中冷冻。
本发明所提供的丝素羟基磷灰石多孔复合材料，在制备过程中，由于采用了溶液共混—冷冻凝胶法，也就是通过溶液共混，在-70℃以下的液体中快速低温冷冻，使HA粉末在较均匀的溶液中快速固化，形成均匀的冷冻体，然后升高温度到丝素溶液的玻璃化转变温度(-34～-20℃)以上，加入低分子量易挥发的有机试剂，使冷冻体中的丝素蛋白分子重新排列，凝胶化以固定HA粉末，再通过加热干燥，除去水份以及低分子量易挥发的有机试剂，由于这些物质的挥发而留下一定结构的孔隙，从而得到多孔复合材料。制备过程中不需要加入化学交联剂，加入的分子量低于100的醇类、酮类、醛类有机试剂比较容易挥发除去，可以，能保持材料良好的生物相容性。在制备时，还可以通过改变羟基磷灰石与蚕丝蛋白类成分的组成比例，达到改善和提高多孔骨修复体在生物活性、力学特性等多方面的性能效果，以满足不同临床需要而进行综合调整的目的。同时，制备成形后的丝素羟基磷灰石复合材料不再需要进行灼烧工艺，因此，可以保持材料中丝素的活性，为加入各种药物或生长因子提供了良好的基体。
由于占自然骨重量65％左右的羟基磷灰石成分主要是纳米羟基磷灰石，因此，为使本发明上述的羟基基磷灰石成分和蚕丝蛋白类成分的细粉能有更好的均匀混合程度，一个优选的措施，是在上述的制备过程中，作为重要原料的羟基磷磷灰石成分最佳的是采用为纳米级的羟基磷灰石。
与现有技术相比，本发明具有以下优点1、丝素蛋白(SF)、羟基磷灰石(HA)、蚕丝纤维均具有较好的生物相容性，SF可生物降解并能引导促进细胞再生，HA具有骨传导作用，可作为骨基质材料直接转化为骨组织，最终被自身组织替代，是理想的组织工程材料。
2、采用溶液共混—冷冻凝胶法，在冷冻固化时能将SF、HA、蚕丝纤维一次性复合，可使三者渗透分布均匀，且加入低分子量易挥发的有机试剂，通过加热干燥，水份及低分子量易有机试剂的挥发，形成一定结构的孔隙，从而得到多孔复合材料，满足了用于组织工程中的细胞培养支架的需要。
3、金属模具易成型、形状易控制，因此，在金属模具内成型的复合材料也可容易地获得所需的大小和形状，可以方便地满足不同形状要求的需要。
4、采用蚕丝纤维增强材料，因而不需要通过烧结的方法来解决材料的力学性能，使多孔复合材料具有较好的强度，并且由于丝素活性的存在，为在材料中复合骨形成蛋白(BMP)或其它药物、蛋白因子等提供了一种新的材料与方法。

下面结合实施例对本发明作进一步描述实施例一将0.6g羟基磷灰石(HA)加入到20ml浓度为3％的丝素蛋白(SF)溶液中，搅拌10min后将其置于超声波中均匀化处理，再加入预先脱胶并剪成5mm长的蚕丝纤维0.04g，搅拌30min。
将上述混合物倾入已成型的金属模具中，把它置于-80℃的乙醇浴中低温快速冷冻1小时，使模具内的混合物形成冷冻体。
取出含有冷冻体的金属模具，把它放在-10℃的冰箱中冷冻20小时，再把整个模具浸入适量的乙醇溶液中，让乙醇慢慢地渗入到丝素羟基磷灰石冷冻体中，使丝素凝胶化，2h后将其取出。
把金属模具置于烘箱中，在30℃的条件下预干燥20小时，然后，再把它置于110℃的温度下干燥5小时，脱模后制得丝素羟基磷灰石多孔复合材料，编号为1#，其性能参见表一。
实施例二将4.8gHA加入到20ml浓度为6％的丝素溶液中，搅拌10min，然后将其用超声波处理10min后，加入0.36g蚕丝纤维(预先脱胶，剪成10mm长)，继续搅拌10min，形成乳液状混合物中。
将该混合物倾入金属模具中，立刻将模具置于-85℃的乙醛浴中低温快速冷冻5小时，形成冷冻体，取出后再在-30℃的温度条件下冷冻24小时，然后，将整个模具浸入适量的乙醛溶液中，乙醛缓缓渗透到冷冻体中，使丝素凝胶化，24h后将其取出，置于烘箱中30℃干燥20小时，再于120℃干燥5小时，脱模后得到丝素羟基磷灰石多孔复合材料，编号为2#，其性能参见表一。
实施例三HA含量为3.6g，丝素溶液浓度为9％，预先脱胶后的蚕丝纤维剪成2mm长，加入0.5g，采用液氮低温快速冷冻10min，其它制备过程同实施例2，制得丝素羟基磷灰石多孔复合材料，编号为3#，其性能参见表一。
实施例四将10.8gHA加入到30ml浓度为9％的丝素溶液中，搅拌10min，然后将其用超声波处理5min，继续搅拌10min得到HA丝素糊状物；取1.1g蚕丝平纹织物，脱胶，凉干，剪成5块，分别为10×1cm大小。
在金属模具中先加一层HA丝素糊状物，然后铺一层蚕丝织物，反复依次铺层，达到厚度约为2mm，最后在其表面涂一层HA丝素糊状物，得到复合层状材料；立刻将金属模具置于-75℃的乙醇浴中冷冻8h，然后在-10℃下冻10，再在-20℃下的丙酮中浸泡12h。
在30℃的鼓风中预干燥，脱模后，再于130℃干燥5小时，制得丝素羟基磷灰石多孔复合材料，编号为4#，其性能参见表一。
表一是采用本发明实施例技术方案制备的丝素羟基磷灰石复合材料的性能表。参见表一，本发明所得到的复合材料产品，表观密度较低(低于0.5g/cm3)，孔隙率较高，孔隙的总体积占复合材料总体积的50～90％；复合材料的抗弯强度在0.1～20MPa，抗弯模量在50～2000Mpa，具有孔径为1～100微米的相互贯通的孔隙。组成复合材料的原料具有良好的生物相容性，制备过程中充分保持了材料的这种特性，加上复合材料成型后具有较好的力学性能、孔隙率以及较大的孔径，因此，本发明所提供的多孔复合材料可以用作为骨缺损的修复、药物控制释放以及骨组织工程材料，应用前景十分广阔。
表一



本发明公开了一种丝素羟基磷灰石复合材料及其制备方法。它以羟基磷灰石、丝素蛋白为基体，脱胶后的家蚕丝或织物为增强体，采用溶液共混－冷冻凝胶法，使HA粉末在较均匀的溶液中快速固化，形成均匀的冷冻体后，再升温到丝素溶液的玻璃化转变温度以上，加入低分子量易挥发的有机试剂，使冷冻体中的丝素蛋白分子重新排列，凝胶化以固定HA粉末，通过加热干燥，除去水份及有机试剂后，形成一定结构的孔隙，制得丝素羟基磷灰石多孔复合材料。它具有良好的力学性能、细胞相容性和适当的降解速率，满足了细胞培养支架的需要，可以作为骨缺损的修复、药物控制释放以及骨组织工程材料，应用前景十分广阔。