减少炎症介质释放的方法和可用于该方法的肽的制作方法[0001]本发明是申请日为2007年7月26日，申请号为200780035710.6，标题为“减少炎症介质释放的方法和可用于该方法的肽”的专利申请的分案申请。[0002]相关申请的交叉引用[0003]本申请要求2006年7月26日提交的美国专利申请N0.:60/833，239的优先权，在此通过引用将其全部内容并入本申请。[0005]炎症性白细胞合成多种炎症介质，这些炎症介质在细胞内是分离的并储存在细胞质膜结合型的颗粒 中。此类介质的实例包括，但不限于，中性粒细胞的髓过氧化物酶(MPO)(例如参见 Borregaard N，Cowland JB.Granules of the human neutrophilicpolymorphonuclear leukocyte.Bloodl997 ;89:3503-3521)、嗜酸性粒细胞的嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPO)和主要碱性蛋白(major basic protein, MBP)(例如参见 Gleich G J.Mechanisms of eosinophi1-associated inflammation.J AllergyClin Immunol2000 ; 105:651-663)、单核细胞/巨噬细胞的溶菌酶(例如参见HoffT，Spencker TjEmmendoerffer A., Goppelt-Struebe M.Effects of glucocorticoidson the TPA-1nduced monocytic differentiation.J Leukoc Bioll992 ；52:173-182 ；和Balboa M A，Saez Y，Balsinde J.Calcium-1ndependent phospholipase A2is requiredfor lysozyme secretion in U937promonocytes.J Immunol2003 ; 170:5276-5280)、和天然杀伤(NK)细胞和细胞毒性淋巴细胞的粒酶(例如参见Bochan MR, Goebel WSj BrahmiZ.Stably transfected antisense granzyme B and perforin constructs inhibit humangranule-mediated lytic ability.Cell Immunol1995 ; 164:234-239 ;Gong JH.，MakiG，Klingemann HG.Characterization of a human cell line (NK-92)with phenotypicaland functional characteristics of activated natural killer cells.Leukemial994 ；8:652-658 ；Maki G，Klingemann HG，Martinson JA，Tam YK.Factors regulating thecytotoxic activity of the human natural killer cell line, NK-92.J Hematother StemCell Res2001 ； 10:369-383 ；和 Takayama Hj Trenn Gj Sitkovsky MV.A novel cytotoxic Tlymphocyte activation assay.J Immunol Methodsl987 ；104:183-190)。此类介质在损失部位释放并促进例如肺部和其他部位的炎症和组织修复。已知白细胞通过胞吐机制释放这些颗粒(例如参见Burgoyne RDj Morgan A.Secretory granule exocytosis.Physiol Rev2003 ；83:581-632 ;和 Logan MR, Odemuyiwa SO, Moqbel R.Understanding exocytosis in immuneand inflammatory cells: the molecular basis of mediator secretion.J Allergy ClinImmunol2003 ;111:923_932)，但参与这一胞吐过程的调节分子和具体途径尚未充分揭示。[0006]一些外源性剌激可促进白细胞脱颗粒，这涉及通过蛋白激酶C活化并随后磷酸化的事件的途径(例如参见 Burgoyne RDj Morgan A.Secretory granule exocytosis.PhysiolRev2003 ；83:581-632 ；Logan MR, Odemuyiwa SO,Moqbel R.Understanding exocytosis inimmune and inflammatory cells: the molecular basis of mediator secretion.J AllergyClin Immunol2003 ；111:923-932 ；SmoIen JEjSandborg RR.Ca2+_induced secretion byelectropermeabilized human neutrophils: the roles of Ca2+，nucleotides and proteinkinase C.Biochim Biophys Actal990 ； 1052:133-142 ；Niessen HWjVerhoeven AJ.Roleof protein phosphorylation in the degranulation of electropermeabilized humanneutrophils.Biochim.Biophys.Acta1994 ； 1223:267-273 ； 和 Naucler C，GrinsteinSj Sundler R.，Tapper H.Signaling to localized degranulation in neutrophils adherentto immune complexes.J Leukoc Biol2002 ；71:701-710)。[0007]MARCKS蛋白(其中MARCKS在这里指的是“豆蔻酰化富丙氨酸激酶C底物”(MyristoylatedAlanine-Rich C Kinase Substrate))是蛋白激酶 C(PKC)的遍在性憐酸化革E，并高度表达于白细胞(例如参见Aderem AAj Albert KAj Keum MM，Wang JKj GreengardP，Cohn ZA.Stimulus-dependent myristoylation of a major substrate for proteinkinase C.Naturel988 ；332: 362-364 ；Thelen M，Rosen A, Nairn AC, Aderem A.Regulationby phosphorylation of reversible association of a myristoylated protein kinase Csubstrate with the plasma membrane.Naturel991 ；351:320-322 ；和 Hartwig JHj ThelenMj Rosen A，Janmey PA，Nairn AC，Aderem A.MARCKS is an actin filament crosslinkingprotein regulated by protein kinase C and calcium-calmodulin.Naturel992 ；356:618-622) o MARCKS蛋白机械性参与排列在呼吸道内的杯状细胞的粘蛋白胞吐性分泌过程(例如参见 Li et al.，J Biol Chem2001 ；276:40982-40990 ;和 Singer et al.，NatMed2004 ; 10:193-196)。MARCKS通过MARCKS蛋白氨基酸序列的N-端氨基酸的酰胺键在位于氨基酸序列N端的甘氨酸(即，位置I)的α-胺位置被豆蘧酰化。在气道上皮细胞中，MARCKS的豆蘧酰化N-端区域似乎是分泌过程所必需的。所谓MARCKS蛋白的N-端指的是MANS 肽，其具有豆蘧酰基-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO:1),均为 L-氨基酸。此外，在此公开的MANS肽的肽片段也优选地由L-氨基酸组成。其机制似乎涉及MARCKS，一种豆蘧酰化的蛋白质，与细胞内颗粒的膜结合。[0008]已经发现来自MARCKS的N-端的N-端豆蘧酰化的肽阻断粘蛋白分泌以及MARCKS与杯状细胞内粘蛋白颗粒膜的结合(例如参见Singer et al.，Nat Med2004 ；10:193-196)。该肽含有MARCKS蛋白的24个氨基酸，始自MARCKS蛋白的通过酰胺键而被豆蘧酰化的N-端甘氨酸，称为豆蘧酰化的α-Ν-端序列(MANS) ; 8卩，豆M 酰基-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO:1)。此外，Vergeres et al.，J.Biochem.1998，330 ;5_11也公开了 MARCKS蛋白的N-端甘氨酸残基通过由豆蘧酰基CoA:蛋白质N-豆蘧酰基转移酶(NMT)催化的反应而被豆蘧酰化。
[0009]在炎性疾病例如哮喘、COPD和慢性支气管炎中；在遗传性疾病例如囊性纤维化中；在过敏性疾病(特应性、过敏性炎症)中；在支气管扩张症中；以及在多种急性感染性呼吸道疾病例如肺炎、鼻炎、流感或普通感冒、关节炎或自身免疫病中，炎性细胞通常见于或者迁移至与炎性疾病状态有关的损伤或感染区域，特别是患有此类疾病的患者的呼吸道或者气道内。这些炎性细胞可通过它们释放的炎症介质造成组织损伤，由此在疾病的病理学中起着极大的作用。在囊性纤维化患者中可观察到通过这种慢性炎症造成的此类组织损伤或破坏的一个实例，其中中性粒细胞所释放的介质(例如，髓过氧化物酶(MPO))引起气道上皮组织脱落。
[0010]MARCKS是大约82kD的蛋白质，其具有3个进化保守性区域(Aderem etal., Nature1988 ；332:362-364 ;TheIen et al., Nature1991 ；351:320-322 ；Hartwig etal., Nature1992；356:618-622；Seykora et al.,J Biol Cheml996 ；271:18797-18802):N-端、磷酸化位点结构域(或PSD)、和多重同源性2 (MH2)结构域。人MARCKS cDNA和蛋白质是已知的，参见 Harlan et al., J.Biol.Chem.1991, 266:14399 (GenBank AccessionN0.M68956)和 Sakai et al.，Genomicsl992, 14:175。W000/50062 也给出这些序列，在此通过引用将其全部内容并入本申请。该N-端是包含24个氨基酸残基的α-氨基酸序列，具有通过酰胺键连接于N-端甘氨酸残基的豆蘧酸部分，该N-端参与MARCKS与细胞内膜(Seykora et al., J Biol Cheml996 ;271:18797-18802)以及可能地与钙调蛋白(Matsubaraet al.，J Biol Chem2003 ；278:48898-48902)的结合。该 24 个氨基酸的序列称为 MANS 肽。


[0011]MARCKS蛋白参与从侵润性白细胞的颗粒释放炎症介质与所有组织和器官的疾病的炎症相关，包括特征为气道炎症的肺部疾病，例如哮喘、CCffD和囊性纤维化。不过，气道的炎症和粘液分泌是两个分开且独立的过程(Li et al.，J Biol Chem2001 ；276:40982-40990 ；Singer et al.,Nat Med2004 ；10:193-196)。尽管多种因素可促进粘液的产生和分泌，其中包括由炎性细胞释放的介质，但目前没有过量粘液导致炎症的直接关联。
[0012]在本发明的一个方面，MANS肽可在降低炎症性白细胞释放炎症介质颗粒或囊泡的速度和/或量上发挥作用。
[0013]在另一个方面，衍生自MARCKS N-端的肽，特别是衍生自所述24个氨基酸的N-端序列的肽，即，衍生自具有位置I的甘氨酸的MARCKS N-端I至24位氨基酸的序列内的活性连续肽片段，以及此类片段的N-端酰胺例如此类片段的N-端乙酸酰胺，和/或以及此类片段的C-端酰胺例如与氨形成的C-端酰胺，可抑制或降低炎症介质自炎症性白细胞的释放的速度和/或量。对释放的这种抑制或降低包括抑制MARCKS相关性炎症介质自炎症性白细胞的释放。
[0014]在另一个方面，衍生自MARCKS N-端的肽，特别是衍生自I至24位氨基酸的N-端序列的肽，即，衍生自具有位置I的甘氨酸的MARCKS N-端I至24位氨基酸的序列内的活性连续肽片段，以及此类片段的N-端酰胺例如此类片段的N-端乙酸酰胺，以及此类片段的C-端酰胺例如与氨形成的C-端酰胺，可通过抑制炎症性白细胞内的脱颗粒过程而抑制炎症介质释放的速度和/或量，例如抑制本发明所鉴定的那些炎症介质。
[0015]在另一个方面，MANS肽及其活性片段以及在此所述的此类片段的活性酰胺，可在炎性细胞中与天然的MARCKS蛋白竞争结合膜，以减少(减弱或降低)MARCKS-相关性炎症介质自此类炎性细胞中的含有此类炎症介质的颗粒或囊泡的释放。
[0016]应答于佛波酯诱导的PKC活化而分泌特异性颗粒成分的白细胞细胞类型和模型细胞类型可用于在体外证实本发明的肽和本发明的取代的肽(例如，α-N-酰胺、C-端酰胺和酯)的功效。
[0017]可使用人的白细胞细胞系来证实本发明的化合物和组合物减少膜结合型炎症介质的释放。例如，自人血中分离的中性粒细胞可用于证实髓过氧化物酶(MPO)释放的减少或抑制。人的早幼粒细胞细胞系HL-60克隆15可用于证实本发明的化合物和组合物减少或抑制嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPO)的释放或分泌(例如参见Fischkoff SA.Graded increase in probability of eosinophilic differentiation ofHL-60promyelocytic leukemia cells induced by culture under alkaline conditions.Leuk Resl988 ； 12:679-686 ；Rosenberg HF，Ackerman S J，Tenen DG.Human eosinophilcationic protein:molecular cloning of a cytotoxin and helminthotoxin withribonuclease activity.J Exp Medl989 ； 170:163-176 ；Tiffany HLj Li F，RosenbergHF.Hyperglycosylation of eosinophil ribonucleases in a promyelocytic leukemiacell line and in differentiated peripheral blood progenitor cells.J LeukocBioll995 ;58:49_54 ;和 Badewa AP，Hudson CE,Heiman AS.Regulatory effects ofeotaxin，eotaxin—2，and eotaxin_3on eosinophil degranulation and superoxideanion generation.Exp Biol Med2002 ;227:645-651)。单核细胞白血病细胞系 U937 可用于证实本发明的化合物和组合物减少或抑制溶菌酶的释放或分泌(例如参见HoffTjSpencker Tj Emmendoerffer A.,Goppelt-Struebe M.Effects of glucocorticoidson the TPA-1nduced monocytic differentiation.J Leukoc Biol 1992 ；52:173-182 ；Balboa M A，Saez Y，Balsinde J.Calcium-1ndependent phospholipase A2is required forlysozyme secretion in U937promonocytes.J Immunol2003 ; 170:5276-5280 ;和 SundstromC，Nilsson K.Establishment and characterization of a human histiocytic lymphomacell line (U-937) ? Int J Cancer 1976 ； 17:565-577) 0 淋巴细胞天然杀伤细胞系 NK-92可用于证实本发明的化合物和组合物减少或抑制粒酶的释放(例如参见Gong JH., MakiGj Klingemann HG.Characteri zation of a human cell line (NK-92)with phenotypicaland functional characteristics of activated natural killer cells.Leukemial994 ；8:652-658 ；Maki G，Klingemann HG，Martinson JAj Tam YK.Factors regulating thecytotoxic activity of the human natural killer cell line, NK-92.J Hematother StemCell Res2001 ； 10:369-383 ；和 Takayama Hj Trenn Gj Sitkovsky MV.A novel cytotoxic Tlymphocyte activation assay.J Immunol Methodsl987 ；104:183-190)。在抑制或减少炎症介质(例如在此所述的那些)释放的体外方法中，将各种细胞类型与多种浓度范围的本发明的肽化合物或肽组合物预温育，随后将这些细胞与炎症介质释放的刺激物例如佛波酯进行温育。确定与缺乏所述肽化合物或肽组合物的情况下所述介质的释放相比，炎症介质释放被抑制的百分数，例如以所释放的介质的浓度的分光光度读数的形式。
[0018]为了证实相对氨基酸序列位置在本发明的肽中的重要性，比较了如下两类肽抑制或降低所释放的炎症介质的量的相对能力，其一为与MARCKS蛋白N-端区域的24个氨基酸的序列(即，MANS —豆蘧酰化的α -N-端序列肽)相同的肽，另一虽含有与MANS相同的24个氨基酸残基，但相对于MANS中的序列顺序而言这些残基的顺序是随机的(即，RNS肽，或者称为“随机N-端序列肽”)。在所检测的各种细胞类型中，MANS肽以浓度依赖型方式在0.5-3.0小时期间减少了炎症介质的释放，而RNS肽则不能。这些结果提示，与MARCKS蛋白、特别是与其N-端区域、且更加具体地是与其24个氨基酸残基的N-端区域中的顺序相同的本发明的肽内的相对氨基酸序列位置，参与了处理抑制白细胞脱颗粒的至少一种细胞内途径。
[0019]本发明涉及所述24个氨基酸的肽序列的新用途，并涉及所述α _Ν_端乙酰化的肽序列、所述豆蘧酰化的多肽，也称为MANS肽，并涉及其活性片段，所述活性片段可选自具有MANS肽氨基酸序列的4到23个连续氨基酸残基的肽，且所述片段如果不以SEQ ID NO:1的位置I的N-端甘氨酸作为起始，它们可以是N-端-豆蘧酰化的，或者它们的N-端可以被C2至C12的酰基酰化，包括N-端乙酰化，和/或它们的C-端以NH2酰胺化。
[0020]本发明还涉及阻断MARCKS-相关性细胞分泌过程的新方法，特别是那些涉及自炎性细胞的MARCKS-相关性炎症介质释放的过程，其刺激途径涉及蛋白激酶C(PKC)底物MARCKS蛋白和自细胞内囊泡或颗粒释放成分。
[0021]本发明涉及抑制自至少一种炎性细胞胞吐释放至少一种炎症介质的方法，包括将细胞与有效量的至少一种肽相接触，所述细胞包含位于所述细胞内的囊泡内的至少一种炎症介质，所述至少一种肽选自MANS肽及其在此所述的活性片段，以使得所述炎症介质自所述炎性细胞的释放与在缺乏所述至少一种肽的情况下可能自相同类型的炎性细胞释放的所述炎症介质相比被降低。
[0022]本发明进一步涉及抑制自对象的组织或体液内的至少一种炎性细胞释放至少一种炎症介质的方法，包括给所述对象的包含至少一种炎性细胞的组织和/或体液施用治疗有效量的药物组合物，所述至少一种炎性细胞包含位于所述细胞内的囊泡内的至少一种炎症介质，所述组合物包含治疗有效量的选自MANS肽及其活性片段的至少一种肽，以使得所述炎症介质自至少一种炎性细胞的释放与在缺乏所述至少一种肽的情况下可能自至少一种相同类型的炎性细胞释放的所述炎症介质相比被降低。更具体地，抑制炎症介质的释放包含阻断或降低炎症介质自炎性细胞的释放。
[0023]更具体地，本发明包括降低对象的炎症的方法，包括施用治疗有效量的药物组合物，所述组合物包含MANS肽(即，N-豆蘧酰基-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO:1))或其活性片段。活性片段的长度为至少4个氨基酸且优选地至少6个氨基酸。在此，MARCKS蛋白的“活性片段”指的是这样的片段，其影响(抑制或降低)MARCKS蛋白介导的释放，例如MARCKS蛋白介导的炎症介质释放。活性片段可选自GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV (SEQID NO:2) ；GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA(SEQ ID NO:4) ；GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA (SEQID NO:7) ；GAQFSKTAAKGEAAAERPGE (SEQ ID NO:11) ；GAQFSKTAAKGEAAAERPG (SEQ IDNO:16) ；GAQFSKTAAKGEAAAERP (SEQ ID NO:22) ；GAQFSKTAAKGEAAAER(SEQ ID NO:29)；GAQFSKTAAKGEAAAE (SEQ ID NO:37) ；GAQFSKTAAKGEMA (SEQ ID NO:46) ；GAQFSKTAAKGEAA (SEQID NO:56) ；GAQFSKTAAKGEA(SEQ ID NO:67) ；GAQFSKTAAKGE(SEQ ID NO:79)；GAQFSKTAAKG(SEQ ID NO:92) ；GAQFSKTAAK(SEQ ID NO:106) ；GAQFSKTAA(SEQ ID NO:121)；GAQFSKTA(SEQ ID NO:137) ；GAQFSKT(SEQ ID NO:154) ；GAQFSK(SEQ ID NO:172) ；GAQFS(SEQID NO: 191)和GAQF (SEQ ID NO:211)。这些肽在N-端氨基酸不含有豆蘧酰基部分，而是要么不含任何化学部分，要么在N-端氨基酸含有非豆蘧酰基化学部分和/或在C-端氨基酸含有化学部分，例如上述的N-端乙酰基和/或C-端酰胺基。MANS肽及其N-端豆蘧酰化的片段中存在疏水性N-端豆蘧酰基部分可增强它们与质膜的相容性并可能增强其对质膜的通透性，并可能使得所述肽被细胞摄取。豆蘧酰基疏水性插入膜的脂双层可提供高达IO4M4的脂质分配系数或表观缔合常数或大约8kcal/mol的单一吉布斯自由结合能(例如参见 Peitzsch, R.M., and McLaughlin, S.1993, Binding of acylated peptidesand fatty acids to phospholipid vesicles:pertinence to myristoylated proteins.Biochemistry.32:10436-10443)，这足以(至少部分地)允许MANS肽和豆蘧酰化的MANS肽片段分配入细胞的质膜内，同时MANS肽(其是豆蘧酰化的)内部和豆蘧酰化的MANS肽片段内部的额外的官能团及其相互作用可增强它们的相对膜通透性。所述片段可各自展现代表其相应结构的分配系数和膜亲和力。可通过本领域已知的肽合成方法制备所述片段，例如通过固相妝合成法(例如参见Chan, Weng C.and White, Peter D.Eds., Fmoc SolidPhase Peptide Synthesis:A Practical Approach, Oxford University Press, New York, NewYork(2000)；和 Lloyd-Wi11iams, P.et al.Chemical Approaches to the Synthesis ofPeptides and Proteins (1997)所述的方法)，并可通过本领域已知的方法纯化，例如通过高压液相色谱法。可通过质谱分析确定各种肽的分子量，其中各种肽显示为具有适当分子质量的峰。使用本文实施例中所公开的方法，无需过多的实验即可容易地确定这些单个的肽或各种肽的组合(例如，2种所述肽的各种组合、3种所述肽的各种组合、4种所述肽的各种组合)在本发明的方法中的功效。优选的组合可包括两种所述的肽；所述肽的优选的摩尔比可以是从50:50(即，1:1)至99.99至0.01，可使用本文实施例中所公开的方法容易地确定该比率。
[0024]优选地，将MANS肽或其活性片段置于用于阻断炎症的药物组合物中。本发明还包括抑制对象的细胞分泌过程的方法，该方法包括施用治疗有效量的化合物，所述化合物包括抑制对象的炎症介质的MANS肽或其活性片段。所述施用通常选自局部施用、胃肠外施用、直肠施用、肺部施用、吸入和鼻部或口服，其中肺部施用通常包括气溶胶、干粉喷雾吸入器、定量喷雾吸入器、或喷雾器。
[0025]施用用于人或动物的包含脱颗粒抑制量的MANS肽或脱颗粒抑制量的MANS肽活性片段的组合物，例如MANS肽或其活性片段的药物组合物，可将MANS肽或其活性片段至少提供至炎性粒细胞所处的或者炎性粒细胞将侵入的组织的内部或表面的部位处，或者提供至与所述组织的表面相接触的含液体层中，由此使得MANS肽或其活性片段接触炎性粒细胞。在一个方面，可在炎症刚发作或者刚检测到时、或在人或动物刚感觉到炎症时、或人或动物的炎症水平刚出现可感知的变化时，施用该组合物以使得炎症的量低于在缺乏MANS肽或其活性片段的情况下可能出现的炎症的量。在另一个方面，可在人或动物的组织的炎症进展过程中进行施用，以降低在缺乏MANS肽或其活性片段的情况下可能出现的额外的炎症的量。施用的剂量和频率可通过临床评价而确定，并与疾病或炎症来源以及组织受累的程度和患者的年龄和个头有关，而可预期的是，在首次施用所述药物组合物的3到8小时之后、优选地6到8小时之后，可重复施用药物组合物。
[0026] 本发明还包括减轻对象的炎症的方法，包括施用治疗有效量的抑制MARCKS-相关性炎症介质释放的化合物，从而对象的至少一种炎症介质的释放与缺乏所述治疗时可能出现的情况相比是降低的。在本文中，"降低〃通常指的是炎症效应的减轻。优选地，通过在此公开的方法抑制或阻断炎症介质的释放。[0027]本发明的另一个实施方式包括减轻对象的炎症的方法，包括施用治疗有效量的抑制MARCKS-相关性炎症介质释放的化合物，从而对象的炎症与缺乏所述治疗时可能出现的情况相比是降低的。本发明还公开了减轻或抑制对象的炎症的方法，包括施用治疗有效量的有效抑制炎症部位的炎症介质的MANS肽或其活性片段。术语"抑制"指的是炎症介质分泌的量降低。术语“完全抑制”指的是炎症介质分泌的量降低至零。同样，如上所述，活性片段的长度为至少4个、且优选地至少6个氨基酸。术语“胞吐过程”是指胞吐作用，即细胞分泌或排泄的过程，其中包含于位于细胞内部囊泡内的物质通过囊泡的囊泡膜与细胞外膜的融合而被排出。“脱颗粒”指的是释放细胞颗粒成分。术语“脱颗粒抑制”指的是降低炎性细胞颗粒内所含炎症介质的释放。因此，脱颗粒抑制量的MANS肽和/或其活性片段是指这些肽的量足以使得颗粒内所含炎症介质的释放与缺乏同样的肽的情况下的释放相比被降低。
[0028]在参照肽GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO:1)中，在参照肽的 N-端位置处，G位于第I位；与I位的G相邻的是2位的A ;与2位的A相邻的是3位的Q ;与3位的Q相邻的是4位的F ;与4位的F相邻的是5位的S ;与5位的S相邻的是6位的K ;与6位的K相邻的是7位的T ;与7位的T相邻的是8位的A ;与8位的A相邻的是9位的A ;与9位的A相邻的是10位的K ;与10位的K相邻的是11位的G ;与11位的G相邻的是12位的E ;与11位的G相邻的是13位的A ;与13位的A相邻的是14位的A ;与14位的A相邻的是15位的A ;与15位的A相邻的是16位的E ;与16位的E相邻的是17位的R ;与17位的R相邻的是18位的P ;与18位的P相邻的是19位的G ;与19位的G相邻的是20位的E ;与20位的E相邻的是21位的A ;与21位的A相邻的是22位的A ;与22位的A相邻的是23位的V ;而与23位的V相邻的是24位的A，其中第24位是该参照肽的C-端位置。
[0029]参照肽的“变体”或参照肽的4-23个氨基酸片段的变体是具有这样的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列与参照肽的氨基酸序列或参照肽的片段的氨基酸序列分别在参照肽或参照肽片段氨基酸序 列中的至少一个氨基酸位置上不同，但是仍保持粘蛋白或粘液抑制活性，所述活性通常分别是所述参照肽或片段的活性的0.1-10倍，优选分别是参照肽或片段的活性的0.2-6倍，更优选分别是参照肽或片段的活性的0.3-5倍。参照氨基酸序列的“变体”或参照氨基酸序列的4-23个氨基酸片段的变体是这样的氨基酸序列，其与参照氨基酸序列或参照氨基酸序列的片段有至少一个氨基酸不同，但具有这样的肽的氨基酸序列，所述肽保持参照氨基酸序列编码的所述肽或片段的粘蛋白或粘液抑制活性，所述活性通常分别是参照序列的肽或片段的活性的0.1-10倍，优选分别是参照序列的肽或片段的活性的0.2-6倍，更优选分别是参照序列的肽或片段的活性的0.3-5倍。取代变体肽或取代变体氨基酸序列通过参照氨基酸序列中的一或多个氨基酸取代而与参照肽或参照氨基酸序列不同(即有差异)；缺失变体肽或缺失变体氨基酸序列通过参照氨基酸序列中的一或多个氨基酸缺失而与参照肽或参照氨基酸序列不同(即有差异)；而添加变体肽或添加变体氨基酸序列通过参照氨基酸序列中的一或多个氨基酸添加而与参照肽或参照氨基酸序列不同(即有差异)。变体肽或变体氨基酸序列可为参照序列中一或多个氨基酸的取代(例如至少1、2、3、4、5、6、7、或8个氨基酸取代)的结果，或者可为参照序列中一或多个氨基酸的缺失(例如至少1、2、3、4、5、6、7、或8个氨基酸缺失)的结果，或者可为参照序列中一或多个氨基酸的添加(例如至少1、2、3、4、5、6、7、或8个氨基酸添加)的结果，或其以任何顺序的组合。取代变体4-23个氨基酸的肽片段或者取代变体4-23个氨基酸的片段序列可通过参照氨基酸片段序列中的一或多个氨基酸的取代而与参照4-23个氨基酸的肽片段或参照4-23个氨基酸的片段序列不同(即有差异)；缺失变体4-23个氨基酸的肽片段或者4-22个氨基酸的缺失变体氨基酸片段序列可通过参照氨基酸片段序列中的一或多个氨基酸的缺失而与5-23个氨基酸的参照肽片段或5-23个氨基酸的参照氨基酸片段序列不同(即有差异)；而4-23个氨基酸的添加变体肽或者4-23个氨基酸的添加变体氨基酸序列可通过参照氨基酸序列中的一或多个氨基酸的添加而与4-22个氨基酸的参照肽序列或4-22个氨基酸的参照氨基酸序列不同(即有差异)。4-23个氨基酸的变体肽或4-23个氨基酸的变体氨基酸序列可为参照氨基酸序列的4-23个氨基酸的片段中一或多个氨基酸的取代(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8个氨基酸取代)的结果，或者可为相对较大的参照氨基酸序列中一或多个氨基酸的缺失(例如至少1、2、3、4、5、6、7、或8个氨基酸缺失)的结果，或者可为相对较小的参照氨基酸序列中一或多个氨基酸的添加(例如至少1、2、3、4、5、6、7、或8个氨基酸添加)的结果，或其以任何顺序的组合。优选地，变体肽或氨基酸序列与参照肽或参照肽的片段或参照氨基酸序列或参照氨基酸序列的片段分别通过以下变化而不同:少于10个氨基酸取代、缺失和/或添加；更优选少于8个氨基酸取代、缺失和/或添加；更优选少于6个氨基酸取代、缺失和/或添加；更优选少于5个氨基酸取代、缺失和/或添加；更优选少于4个氨基酸取代、缺失和/或添加。最优选所述变体氨基酸序列与参照肽或片段氨基酸序列通过I个或2个或3个氨基酸而不同。
[0030]“序列相同性”意指，就两条肽的氨基酸序列而言，具有相同氨基酸的位置的数目除以两条序列中较短一条中的氨基酸的数目。
[0031 ] “基本相同”意指，就两条肽的氨基酸序列的比较或两条肽片段(例如参照肽氨基酸序列的片段)的氨基酸序列的比较而言，肽或肽片段的氨基酸序列具有至少75%序列相同性，优选至少80%序列相同性，更优选至少90%序列相同性，且最优选至少95%序列相同性。
[0032]术语“肽”在本文中包括肽及其可药用的盐。
[0033]本文中的“分离的”肽意指天然存在的肽，其已经通过纯化、重组合成或化学合成而与其天然伴随的细胞组分(例如核酸和其他肽)分离或基本分离，并且也包括已经从细胞成分、生物物质、化学前体或其他化学物质中纯化或基本纯化的非天然存在的重组或化学合成的肽。
[0034]以下三字母和单字母氨基酸简写在全文使用:丙氨酸:(Ala)A ;精氨酸:(Arg)R ;天冬酰胺:(Asn)N ;天冬氨酸:(Asp)D ;半胱氨酸:(Cys)C ;谷氨酰胺:(Gln)Q ;谷氨酸:(Glu)E ;甘氨酸:(Gly)G ;组氨酸:(His)H ;异亮氨酸:(He) I ;亮氨酸:(Leu)L ;赖氨酸:(Lys)K ；甲硫氨酸:(Met)M ;苯丙氨酸:(Phe)F ;脯氨酸:(Pro) P ;丝氨酸:(Ser) S ;苏氨酸:(Thr)T ;色氨酸:(Trp)W ;酪氨酸:(Tyr)Y ;缬氨酸:(Val)V。本文所用的其他氨基酸三字母符号包括，见括号中，(Hyp)代表羟脯氨酸，(Nle)代表正亮氨酸，(Orn)代表鸟氨酸，(Pyr)代表焦谷氨酸，以及(Sar)代表肌氨酸。通常，肽的氨基端(或N-端)出现在所示肽的氨基酸序列的左侧末端， 而羧基端(或C-端)出现在所示氨基酸序列的右侧末端。肽的氨基酸序列可以用单字母符号书写来代表肽中通过肽酰胺键共价相连的氨基酸。
[0035]MANS肽的活性片段可用于预防或降低动物组织内由炎症介质引起的炎症的量。MANS肽的活性片段还可用于预防或降低动物体内由炎症介质产生或引起的组织损失的量。MANS肽的活性片段由MANS肽(SEQ ID NO:1)的至少4个连续氨基酸且不超过23个连续氨基酸组成。术语“活性片段”在本发明中旨在涵盖那些能够预防或降低炎症介质自炎性细胞释放的MANS肽片段。与参照肽例如MANS肽相比，所述活性片段可使得炎症介质的释放降低至少5%到至少99%。
[0036]表1中是单字母简写形式的氨基酸序列的列表以及相应的肽编号和SEQ ID NO。参照肽氨基酸序列(MANS肽)是肽I。肽2至231是本发明的肽的氨基酸序列，它们具有参照氨基酸序列的4至23个连续氨基酸的氨基酸序列，此外肽232是包含MANS肽的氨基酸的随机N-端序列(RNS)的氨基酸序列。在此所述的本发明的肽的氨基酸序列的代表性变体氨基酸序列是肽233至245和247至251。列出的这些变体肽无意于作为限制性的一组肽，而仅仅是作为本发明变体肽的代表性实例而给出的。还给出了本发明的肽的代表性反向氨基酸序列(肽246)和代表性随机氨基酸序列(肽232)。表中的反向和随机氨基酸序列不是本发明的代表。
[0037]表1给出了本发明的肽及其相应的氨基酸序列的列表以及相应的SEQ ID NO。
[0038]表1:肽和氨基酸序列
[0039]