一株高CO2耐受性和固定率的微藻及其选育方法_岳丽宏,陈为公专利（CO,lt,sub）-早鸽网

一株高CO2耐受性和固定率的微藻及其选育方法

专利名称

一株高CO2耐受性和固定率的微藻及其选育方法
发明者

岳丽宏, 陈为公
公开日

2012年10月3日
申请日期

2012年2月13日
优先权日

2012年2月13日
申请人

青岛理工大学
文档编号

C12N13/00GK102703326SQ20121003029
关键字

CO lt sub gt 一株
权利要求

1.一株具有高CO2耐受性和高固定率的微藻，其分类命名Chlorella sp.Y_l，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年11月14日，保藏编号 CGMCC No. 54292.权利要求I所述的微藻的选育方法，该方法包括如下步骤 (1)出发株的筛选驯化和分离纯化预培养采用BBM培养基，培养时间为3周，控制培养条件为25°C ±2°C，光照强度25000Lux，光暗比 12 12; CO2驯化采用MBM培养基，利用CO2混合气驯化预培养后的试样，气流体流速lL/min、光照强度25000Lux，25°C ±2°C，光暗周期比为12h 12h，驯化培养10d，CO2混合气浓度(v/V，％，单位下同)依次为0.035%，3%、5%和10%、15%，反复驯化4次；对驯化之后的藻液采用平板划线分离，直至获得纯藻种，作为出发株B-1，出发株B-I的碳含量为50. 726%，最佳生长浓度15% (v/v)，固定率高达2.409g/(L · d)，最高耐受浓度为60% (v/v)，适宜的培养条件范围为在温度为25°C -30°C、初始pH为5.0-6.0、15000-25000Lux 的光照、气体流速为 O. 8-1. 01L/min ； (2)目标株构建出发株强化培养对出发株B-I采取渐变CO2浓度连续试验强化培养，试验条件、步骤同出发株的驯化阶段；各培养周期CO2浓度(v/v，% )依次增加至5%、10%、15%、20%、30%、50%、60%、80%和 100%，各培养 6 天时间；基因诱变育种诱变条件为诱变剂量致死率为7 O -8 O %、最佳诱变藻液浓度为2. 5 X IO6 3. 6 X IO6个/mL、诱变剂量为20W紫外灯、照射距离为25cm、辐射时间是30min ；诱变后的藻液在25°C、转速141r/min、MBM培养基、30% CO2 (v/v)的气体、25000Lux光照、光暗周期比12h 12h条件下预培养6天，按照10%的接种量每隔5d转接一次，转接三次；驯化阶段采用BBM培养基，其他条件不变，筛选出单株优良藻株，为突变株；基因克隆以突变株和出发株为对象，大肠杆菌(感受态细胞ToplO)和PMG为质粒载体，按照《分子克隆实验指南》配置常用缓冲液及试剂，按照植物基因组DNA提取试剂盒操作提取藻株DNA，从基因库中获得小球藻属的rbcL基因序列，引物设计采用Clustal X 1.8软件进行分析；PCR反应体系的反应循环条件为94°C预变性7min、94°C变性lmin、42°C复性Imin、72°C延伸Imin、35个循环、反应最后72°C延伸7min;取2yL PCR产物用于电泳检测，普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒切胶回收DNA片段；按pBS-T连接试剂盒进行PCR产物连接，30°C反应2h后，全部转化50 μ L Τ0Ρ10感受态细胞中，冰上放置30min，42°C水浴热激90s，迅速转入冰浴2min，加入200 μ L LB液体培养基，37°C，220rmp震荡培养45min，取200 μ L上述转化培养物涂至含有Amp (50 μ g/ml)的LB平板上，待所有液体被吸收后，37 °C倒置培养14h左右，出现单菌落时取出平板，挑取单克隆抗体进行检测、保种和测序；PCR法检测阳性克隆条件为94°C预变性7min，94°C变性lmin，42°C复性lmin，72°C延伸lmin，35个循环，反应最后72°C延伸7min ;采用pBS_T载体测序通用引物测序； (3)藻株的含碳量、培养特性测定及优选目标株含碳量采用全自动分析仪检测，色谱条件为载气压力80KPa，吹扫流速80ml/min，氧化体积20ml，氧气分压35KPa，采样延迟10s，运行时间360s，前级燃烧室温度920°C，炉温115°C ;以半胱氨酸为标准品，样品以20mg计，仪器的检出限N% 0. 008%, C% 0. 005% ；培养特性测定条件及过程在初始pH 6. 6、25°C、光照25000Lux、l. OL/min的培养条件下，控制 CO2 含量分别为 O. 035%、5%、10%、20%、25%、30%、60%、和 100%，确定 CO2最佳固定浓度和最高耐受性；采用正交试验，设置20 V、25 °C、30°C、35 °C等四个温度梯度，、5000,15000,25000,35000 和 50000Lux 五个光照梯度，pH5、H6、pH7、pH8 四个初始 pH 梯度，、O.7,0. 8、I. O、I. I、I. 2、I. 50L/min六个气体流速梯度，分别以 NH4CUNaNO3和 NaNO2 为氮源，藻液初始吸光浓度约在O. I左右，确定适宜的温度、初始pH、光照、气流速度及氮源条件；优选目标株优选目标株的碳含量增至56. 981% ;在初始pH 6、25°C、光照25000Lux、气体流速I. lL/min、2g/L的NaNO3为氮源时获得最佳CO2固定浓度20%，CO2固定率高达、5.762g/(L · d)，最高耐受浓度为100% (v/v);对环境均具有较强适应性，包括10% -35%CO2 浓度、20°C -30°C、15000-35000Lux 的光照、初始 pH5. 0-6. 5、气体流速 O. 8-1. 10L/min、以硝酸钠为氮源的浓度在O. 25-2g/L时长势良好
技术领域

本发明属于微藻生物技术领域，具体涉及一株高CO2耐受性和固定率的微藻及其选育方法
背景技术

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权力要求
说明书
法律状态

专利名称：一株高CO<sub>2</sub>耐受性和固定率的微藻及其选育方法近百年来，全球气温明显升高，已经对许多地区的自然生态系统产生了负面影响，甚至导致不可修复性的破坏。随着升温幅度的增加，遭受破坏的生态系统的数目和地理范围也在不断地增加。大量研究表明，全球升温以及由此引发的不良后果主要缘于人类活动排放的CO2等温室气体的温室效应。CO2 —直是人类活动排放的主要温室气体，因此，CO2也就不可避免地成为当前温室气体减排控制的重点。我国是世界上的人口大国、能源生产和消费大国，每年由化石燃料燃烧排放的温室气体的量一直居高不下。2006年底，科技部联合中国气象局、中国科学院等部门发布的《气候变化国家评估报告》指出，在过去的100年里，我国气温升高了 0.6°C，东北最近50年升高了 I. 1°C，据估测，在未来100年，还可能增加2°C 4°C。现在过去100年增温1°C左右就灾害频繁，未来将会怎样？因此，面对我国气候变化的严峻形势、面对全球环境的新要求，在对所排放烟气中的SO2和NOx等大气污染物进行处理的同时，也必须对CO2的排放加以控制，以承担我国对全球环境变化的责任。如何在现有的燃料和能源结构条件下，采取经济有效的方法控制CO2的排放，是发明者近几年一直致力研究的课题。根据前人的研究经验和本人近几年成果分析，微生物法是一种行之有效的减排法。但是，氢化细菌培养需通入氢气，在实际工程应用中增加了技术的复杂性；微藻耐高温性差，通常当CO2浓度大于5%时生长就会受到抑制，固碳效率较低。因此选育能高效固定高浓度CO2的微藻对该技术的发展至关重要。选育合适的微生物不仅可实现对高浓度CO2高效减排，解决生物法的技术瓶颈，所获得的生物质还可通过质能转化开发新能源，减少对化石燃料的需求，进一步减少因化石燃料燃烧而引起的CO2的排放，同时又创造了经济效益。选育合适的微生物，使得生物固定技术与其它减排技术相比，具有占地少、成本低、效益显著、运作简便等特点。本发明所培育高效微生物可以耐高温、实现对高浓度CO2的有效固定，同时，生产的生物质可以作为新能源代替化石燃料，或者用来生产饲料、肥料和绿色食品等。因此，该发明是一项非常重要的绿色环保、高效节能型项目。国内外典型研究成果见表I。这些研究或因最适CO2浓度和最高耐受浓度低、或因为低固定率等原因都未取得满意的结果。如刘玉环等人研究的Scenedesmus dimorphus最适CO2浓度和最高耐受浓度较高，但在最佳浓度时的固定率仅达O. 99g/ (L · d)。黄和等人的“一株小球藻及其应用”(201019026021. X)，分离的小球藻M209256最高CO2耐受浓度仅为24. 5% (v/v)，最佳CO2固定浓度为5% (v/v)，15天最佳生物量为2. 23g/L，按通常的小球藻的含碳量50%计算，最佳CO2固定率为4. 088g/L，折合O. 273g/(L · d)，在 CO2 浓度为 24. 5% (v/v)时 CO2 固定率为 2. 05g/L，折合 O. 137g/(L · d);刘君寒等人的“一株小球藻及其培养方法和应用”(201110145547. 7)，该方法重点获得具有多功能的小球藻，方法述及的小球藻M4653最高CO2耐受浓度为30% (v/v)，优选在5% (v/v) CO2时油脂含量为33. 5%和产量I. 51g/L，在20%时仅为24. 7%和O. 79g/L，显然该藻不适宜高CO2浓度环境生存，且方法中也未对该藻的适宜CO2浓度和最佳CO2固定情况进行阐述。李福利等人的“一株栅藻及其培养方法和应用”(201110144545. 6)，方法仅述及栅藻M4653可用于空气-30% (v/v) CO2环境，研究重点在于含氨氮等废水的净化及其油脂含量，对CO2固定及去除情况未提及，且最佳生物质生长量出现在5% (v/v)CO2时、最佳蛋白量出现在3%(v/v) CO2时,可以理解为最高CO2耐受浓度为30% (v/v),最佳固定浓度仅为5% (v/v)。表I国内外典型的研究成果本发明属于微藻生物技术领域，特别涉及一种高CO2耐受性和固定率的微藻及其选育方法。该藻命名为Chlorella sp.Y-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC No.5429。其特点从自然环境分离得到出发株，经高CO2浓度条件强化培养、基因克隆、诱变育种等操作后，目标株的碳含量增至56.981％，最佳固定浓度达20％(v/v)，固定率高达5.762g/(L.d)，最高耐受浓度为100％(v/v)，对一系列物理化学培养条件有较好的适应性，传代稳定性良好，总体性能好于目前同类研究成果。发明的目的是解决高浓度CO2生物固定技术的瓶颈问题，培育一种能高效固定高浓度CO2的高效生物，实现烟道气等高浓度复杂环境下CO2的有效固定，同时产生出有益的生物质。

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