专利名称：左旋正丁基苯酞的预防和治疗痴呆的用途的制作方法 老年性痴呆或称阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种以临床和病理为特征的进行性退行性神经病。其临床表现主要为记忆力(特别是近记忆力)减退，认知能力低下，思维迟钝，空间定向障碍等。病理表现为β-淀粉样肽(Aβ)与其它分子、神经元和非神经细胞结成一起在细胞外沉积成老年斑以及细胞内神经元纤维缠结(neurofibrillarytangles，NFT)的形成。我国AD患病率在0.2％～5.98％之间，该病多发生在60岁以上的人群。随年龄增加而增多，据估计我国现有AD患者在360万人以上。在北京地区调查痴呆发病率发现血管性痴呆(VD)多于AD。(张明园等痴呆和阿尔茨海默病的发病率。中华精神科杂志1998；31(4)195-196)由于我国已进入老龄化时期，痴呆患者逐年增多。并且，在老年人群中脑血管病发生率是很高的，据估计卒中后痴呆的发病卒约为9～30.8％，长期脑供血不足也是导致血管性痴呆的重要原因。总之，痴呆患者不仅对本人极为痛苦，而且对家庭和社会的负担很大，因此寻找有效药物以延缓、控制AD和VD病情的发展是极为重要的。阿尔茨海默氏病(AD)是老年人认知功能进行性减退的最主要原因。其主要病理改变是形成以β-淀粉样肽(β-amyloid，Aβ)沉积为核心的老年斑和神经纤维绕结。研究表明，脑中胆碱能系统与人的学习记忆功能相关。AD病人脑中ACh水平下降，催化合成ACh的胆碱乙酰转移酶(ChAT)的活性低下，其降低程度与认知功能減退密切相关。此外，氧化应激和炎症反应参与AD的病因也越来越受到重视。Aβ由39-43个氨基酸组成，是β前体蛋白(APP)的降解产物。Aβ沉积的范围与神经损伤和认知功能缺损密切相关。既往研究证实持续地侧脑室灌注(i.c.v.)Aβ(1-40)或Aβ(1-42)能引起大鼠学习和记忆损伤(Nitts.et al.β-Amyloid protein-induced Alzheimer’s disease animalmodel.Neurosci.Lett.1994；17063-66)，提示脑中Aβ聚集所造成的记忆损伤可模拟AD病人的症状。经研究，左旋正丁基苯酞(L-NBP)，能明显改善线粒体功能，改善脑微循环和能量代谢，抑制神经细胞凋亡，抗氧化损伤，抑制炎症反应，抗血栓，降低细胞内钙，抑制谷氨酸的释放等脑保护作用。为此，可以选用持续侧脑室灌注(i.c.v.)Aβ(1-40)作为模型。用Morris水迷宫和生化方法检测所试化合物对动物近记忆和空间位置记忆功能和对氧化损伤的影响。血管性痴呆(VD)是由于脑血管疾病引起脑功能障碍而产生的痴呆，多数伴有多发的较大的脑动脉梗塞或腔隙性脑梗塞或脑低灌。脑血流降低程度与痴呆严重性相关(Roman et al.Vascular dementiadiagnosticcriteria for research studies.Neurology 1993；43250-260)。慢性进行性脑供血不足，使其对氧和葡萄糖以及其他必需的代谢物质利用下降，其结果引起氧化损伤，线粒体功能和神经细胞的生物合成受损，突触传递功能受阻，最后导致神经病理学改变，即发生神经退行性变化(Beal et al.Do defects in mitochondrial metabolism underlie the pathology of neurodegenerativedisease Trends Neurosci.1993；16125-131)。VD病人主要表现为近记忆和空间知觉进行性衰退和认知功能缺损。血管性痴呆的发生和发展与胆碱能神经系统的信息传递密切相关，也与神经细胞的氧化损伤相关，在病理上VD病人皮质下白质稀疏。大量研究表明，ACh被认为是学习和记忆的重要神经递质。AD病人的胆碱能通路功能降低，表现为神经递质ACh水平下降，这是其记忆功能受损及认知缺损的重要原因之一(Toghi et al.Cerebrospinal fluid acetylcholine and choline in vascular dementia ofBinswanger and multiple small infarct types as compared with Alzheimer-type dementia.J.Neural Transm.1996；1031211-1220)。所试化合物对ChAT活性有提高作用，说明其能使胆碱能神经ACh水平增加，有利于改善记忆功能。近十余年来，很多实验室用Morris水迷宫检测大鼠近记忆和空间位置的记忆力，可敏锐地反映动物中枢神经系统受损及其功能变化(Richard Morris.Developments of a water-maze procedure for studying spatiallearning in the rat J.Neurosci Methods.1984；1147-60)，并观察药物对该模型的作用。由于痴呆病人主要表现为认知缺损，特别是对近记忆和空间知觉的进行性损伤。因此该模型不失为一个较理想的观察药物对早老性痴呆病(AD)和VD有否有治疗作用的模型。而用大鼠双侧颈总动脉阻断(2-VO)模型持续低灌可模拟临床上供血不足引起的血管性痴呆，因此用本法可反映药物治疗痴呆的作用(Ni.J.W.et al.Neuronal damage anddecrease of central acetylcholine level following permanent occlusion bilateral commoncarotid arteries in rats.Brain Res.1995；673290-296)。1988年于澍仁报道的芹菜甲素(3-正丁基苯酞，Ag-1)是合成的消旋体3-正丁基苯酞，它对马桑内酯造成大鼠学习和记忆障碍有改善作用，对大鼠海马细胞有保护作用(于澍仁等芹菜甲素增强学习记忆的作用 中国药理学报 1988，9(5)385-388)。此后，有报道认为芹菜提取液对中老年小鼠学习记忆有改善作用(李静等 芹菜提取液对中老年小鼠学习记忆的影响 中草药1996，27(2)104-105；刘洛生等安清益智胶囊的质量标准研究 山东医科大学学报2001，39(6)562-564)，但迄今尚未见到有光学立体异构体一左旋正丁基苯酞(L-NBP)治疗老年性痴呆的报道。
为了克服现有技术的不足，本发明提供了如通式(I)所示 的左旋正丁基苯酞(以下简称L-NBP)作为抗痴呆的药物的应用。本发明所用的左旋正丁基苯酞是经化学合成，先得到消旋正丁基苯酞，后经化学拆分成为左旋光学异构体正丁基苯酞，通过核磁、质谱和红外等光谱分析，特别是用Hp5890气相色谱仪，手性气相色谱柱(Chiraldex G-TA)进行分析，证明本品的光学纯度和化学纯度为单一光学立体异构体一左旋正丁基苯酞(比旋光度＞-66.49°，光学纯度＞98％，化学纯度＞98％)，拆分方法参见中国专利“制备光学活性3-正丁基苯酞的方法”，申请号99109673.8，公开号CN1283621。本品的化学结构式是和食用芹菜及其籽中所含的芹菜甲素结构相同。
本发明用国际上公认的方法即用Morris水迷宫实验检测动物近记忆和空间定向力。
本发明通过建立永久性阻断大鼠双侧颈总动脉(2-VO)引起持续低灌模型，用Morris水迷宫法检测L-NBP对动物近记忆和空间位置功能的影响，用生化方法检测了L-NBP对氧化损伤的某些指标和对胆碱能神经神经系统的影响。鉴于脑低灌引起行为改变伴随着脑胶质细胞激活，白质变稀疏。因此本研究用病理学和免疫组织化学的方法，用胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)和K-B染色(反映神经元髓鞘的病理变化)作为指标，观察了药物对其影响。
本发明的实验显示对于脑供血不足大鼠的近记忆和空间位置功能障碍，本发明的左旋正丁基苯酞具有明显的改善作用。水迷宫试验的学习和保留实验经常被用于评价低灌注大鼠的空间记忆能力。实验结果显示在水迷宫实验中，在第一天训练中，各组间潜伏期没有显著性差异，说明所有动物在笫一天对该项实验操作并不熟悉。经过5天的训练，假手术组的搜索策略从边缘式和随机式转向趋向式和直线式，潜伏期(12.6±3.34秒)明显缩短，说明动物经过训练已具有一定的记忆力和空间定向力。而溶剂对照组的搜索策略没有明显的转变，仍为边缘式和随机式，潜伏期(47.6±5.88秒)未明显缩短，两组相比差异显著(P＜0.01)。L-NBP10mg/kg组的搜索策略从边缘式和随机式转向趋向式和直线式，潜伏期(26.85±5.98秒)缩短明显，与溶剂对照组比较有明显差异(P＜0.001两因素方差分析)，而与假手术组比较无显著差异，说明该剂量组对记忆力和空间定向力有明显改善作用。其它药物如DL-NBP10mg/kg，DL-NBP30mg/kg和D-NBP30mg/kg的改善作用均不明显。
在5天的学习训练结束后，进行平台探索实验，将安全岛撤去以测试大鼠是否已形成对安全岛的空间记忆。除溶剂对照组外，所有大鼠在目标象限的停留时间都大于25％，表明都已经形成了对安全岛的相对位置的记忆。假手术组的停留时间为17.73±1.19秒，而溶剂组对照组的停留时间(14.40±0.73秒)明显缩短。通过单因素方差分析统计，两组间有明显差异(P＜0.05)。L-NBP10mg/kg组在平台所在象限的停留时间较溶剂对照组明显延长(17.62±1.27秒)，两组间比较有显著意义(P＜0.05)。DL-NBP组(10mg/kg和30mg/kg)均无作用。为了排除动物运动能力对其影响，经测定，各组间游泳速度无差异。以上说明只有左旋正丁基苯酞对脑供血不足大鼠的近记忆和空间位置功能缺损有明显作用，而消旋和右旋正丁基苯酞则无作用。
SOD是重要的抗氧化酶，正常对照组皮层组织中SOD的活性为100.07±3.64(NU/mg protein)海马组织中的活性为57.90±7.41(U/mgprotein)。大鼠永久性结扎双侧颈总动脉后，海马SOD的活性与对照组相比明显升高(P＜0.05)，这可能是一种代偿性反应。经L-NBP(10mg/kg)治疗后，该酶活性明显接近正常水平(P＜0.05)。MDA是脂质过氧化的标志，可反应在体内的脂质过氧化的程度，间接地反应出细胞损伤的程度。在此实验中，模型组皮层MDA的含量升高了19.9％，与正常对照组相比具有显著性差异(P＜0.001)。经L-NBP(10mg/kg)治疗后，皮层MDA的含量明显降低了20.7％(P＜0.001)。大鼠永久性结扎双侧颈总动脉后，皮层ChAT的活性显著降低，与正常对照组相比，下降了34.4％(P＜0.05)，表明低灌注可致胆碱能神经功能受损。而L-NBP(10mg/kg)连续给药16天后，可使皮层组织中ChAT的活性较模型组提高了37.1％，具有显著性差异(P＜0.05)。由结果可得出以下结论L-NBP10mg/kg组能明显改善2-VO动物近记忆和空间位置的记忆障碍，而消旋丁基苯酞和右旋丁基苯酞对改善记忆功能障碍均无效。本发明在2-VO后笫10天开始给药(一直给药至第35天)，目的在于观测药物对脑低灌引起的神经元退行变的治疗作用，以排除对急性低灌缺血期的影响。
本发明通过病理学和免疫组织化学方面的研究说明L-NBP对血管性痴呆有明显的治疗作用。永久性结扎双侧颈总动脉后，模型组可见皮层和海马CA1区的神经元明显减少，细胞皱缩和神经元深染，而L-NBP(10mg/kg)治疗后能明显改善低灌注诱导的神经元损伤。文献报道双侧颈总动脉结扎可以诱导脑中胶质细胞活化，并伴有白质稀薄。白质稀薄按其严重程度一般分为4级0级，正常；1级，神经纤维错排；2级，明显空泡形成；3级，有髓鞘的纤维消失。在我们的实验中，模型组的视束较正常对照组显示明显的白质稀薄，有大量的空泡出现，L-NBP(10mg/kg)长期给药后可显著改善这种情况，视束的空泡明显减少。免疫组化实验发现，GFAP-阳性的星形胶质细胞在正常对照组海马，尾核，胼胝体等部位很少检测到，但双侧颈总动脉结扎4周后，许多GFAP-阳性反应的星形胶质细胞和小胶质细胞出现。经L-NBP(10mg/kg)治疗后，GFAP-阳性的胶质细胞显著减少(见图3，4)。总之，L-NBP对ChAT活性有提高作用，说明能使胆碱能神经ACh水平增加，有利于改善记忆功能。此外L-NBP能明显抑制氧化损伤，说明L-NBP能降低神经细胞的损伤。由2-VO引起的脑低灌的病理特征为白质稀疏，空泡和胶质细胞增多(Narri.et al.Chronic cerebralhypoperfusion-induced neuropathological changes in rats.Jpn.J.Psychopharmacol.1998；18181-188)，而L-NBP均能改善这些病理改变。以上这些作用机制对L-NBP改善2-VO大鼠引起的记忆障碍提供了依据。根据以上结果，L-NBP对血管性痴呆有明显的治疗作用。
本发明的实验结果显示对于β-淀粉样肽(1-40)引起的大鼠记忆和空间定向力障碍，本发明的左旋正丁基苯酞具有明显的改善作用。在大鼠脑室内持续灌流Aβ后的水迷宫实验中，第一天训练中，各组间潜伏期没有显著性差异。经过5天的训练，假手术组的搜索策略从边缘式和随机式转向趋向式和直线式，潜伏期(13.02±2.77秒)明显缩短。而模型组的搜索策略没有明显的转变，仍为边缘式和随机式，潜伏期(30.18±4.81秒)未明显缩短，两组相比差异显著(P＜0.01)。经L-NBP治疗后，大鼠在水迷宫试验中的潜伏期明显缩短，其中L-NBP10mg/kg组和30mg/kg组的搜索策略从边缘式和随机式转向趋向式和直线式，潜伏期分别为27.28±6.42秒和25.88±5.51秒，与模型组比较有明显差异(P＜0.05两因素方差分析)，而与假手术组比较无显著差异，说明经1-NBP治疗的大鼠已接近正常水平，见图4。在工作记忆测验中，第一次实验和第2-5次实验的潜伏期见图5A，B。虽然在第一次实验中，各组的潜伏期没有显著性差异，但在以后4次实验中，假手术组的潜伏期为9.15±0.91秒，模型组的潜伏期为14.05±1.88秒，后者潜伏期明显延长，二者有显著性差异(P＜0.01)。L-NBP组可以剂量依赖性的显著改善工作记忆能力(P＜0.01)。
L-NBP还能增加GSH-Px活性和降低MDA的含量。GSH-Px是重要的抗氧化酶，在我们的实验中，假手术组皮层组织中GSH-PX的活性为15.86±0.91(U/mg protein)；海马组织中的活性为16.19±1.19(U/mg protein)。大鼠Aβ(1-40)持续灌流后，GSH-Px的活性与假手术组相比在皮层和海马分别降低了29.5％和42.4％，具有显著性差异(P＜0.01和P＜0.001)。经L-NBP治疗后，30mg/kg组对该酶活性明显升高(P＜0.01)，L-NBP(10mg/kg)也有升高该酶的活性作用，但没有统计学意义。MDA是脂质过氧化的标志，反应体内脂质过氧化的程度，间接地反应出细胞损伤的程度。在此实验中，大鼠Aβ(1-40)持续灌流后皮层和海马MDA的含量分别升高了25.7％和23.6％，与假手术组相比具有显著性差异(P＜0.05和P＜0.01)。经L-NBP治疗后，皮层和海马MDA的含量明显降低，10mg/kg组分别降低了28.4％和24.3％(P＜0.05和P＜0.01)，30mg/kg的作用弱于10mg/kg组，但与Aβ(1-40)模型组相比，仍具有显著性差异(P＜0.05)。
本发明的实验可以得出如下结论大鼠持续侧脑室灌流Aβ(1-40)引起的记忆障碍是公认的观测药物对AD治疗作用的模型。由以上结果可见，L-NBP不仅对2-VO导致供血不足引起血管性痴呆的模型有明显作用，而且对大鼠持续侧脑室灌流Aβ(1-40)引起的近记忆和空间位置的记忆障碍也有明显改善作用。这说明L-NBP对不同原因引起的近记忆和空间位置记忆障碍均有明显改善作用。此外，L-NBP有阻断氧化损伤的作用(提高GSH-Px活性和降低MDA含量)，结合其明显的脑保护作用，提示L-NBP有治疗老年性痴呆的作用。
总而言之，本发明用Morris水迷宫检测大鼠近记忆和空间位置的记忆力，用大鼠2-VO模型持续低灌以模拟临床上供血不足引起的血管性痴呆，因此本法完全可以反映药物治疗痴呆的作用。本发明的实验结果表明L-NBP10mg/kg组能明显改善2-VO动物近记忆和空间位置的记忆障碍，而消旋丁基苯酞和右旋丁基苯酞对改善记忆功能障碍均无效。ACh被认为是学习和记忆的重要神经递质。AD病人的胆碱能通路功能降低，表现为神经递质ACh水平下降，这是其记忆功能受损及认知缺损的重要原因之一。而L-NBP对ChAT活性有提高作用，说明能使胆碱能神经ACh水平增加，有利于改善记忆功能。L-NBP能明显抑制氧化损伤，说明L-NBP能降低神经细胞的损伤。由2-VO引起的脑低灌的病理特征为白质稀疏，空泡和胶质细胞增多，而L-NBP均能改善这些病理改变。因此，本发明的如通式(I)所示的化合物左旋正丁基苯酞对血管性痴呆的有预防和治疗作用。
持续地侧脑室灌注Aβ(1-40)引起大鼠学习和记忆损伤可以模拟早老性痴呆病人的症状。用Morris水迷宫检测大鼠近记忆和空间位置的记忆功能。L-NBP对近记忆和空间位置记忆障碍均有明显改善作用，而D-NBP和DL-NBP则无作用。GSH-Px是重要的抗氧化酶；MDA是反应体内脂质过氧化的程度，间接地反应出脑细胞损伤的程度。L-NBP能提高GSH-Px活性和降低MDA含量的作用，说明L-NBP能阻断氧化损伤，有保护脑损伤作用，而D-NBP和DL-NBP则无作用。因此，本发明的如通式(I)所示的化合物左旋正丁基苯酞对早老性痴呆的有预防和治疗作用。总之，左旋正丁基苯酞有预防和治疗老年性痴呆作用，而消旋丁基苯酞和右旋丁基苯酞均无作用。
本发明因此还涉及含有作为活性成份的本发明化合物和常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1-95重量％的本发明化合物。
本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。
本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。
本发明化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。
本发明化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维索等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。
例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成分本发明化合物与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。
例如，将本发明化合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。
本发明化合物药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明化合物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。本发明化合物的每天的合适剂量范围优选为0.1-100mg/kg体重，更优选为0.1-100mg/天/人。上述剂量可以单-剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药这受限于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。
每一种治疗所需总剂量可分成多次或按一次剂量给药。本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。
术语L-NBP左旋正丁基苯酞2-VO模型永久性双侧颈总动脉结扎


图1.水迷宫实验，1A第五天大鼠的搜索路线；1B第五天平台探索实验中大鼠的搜索路线。
图2.永久性双侧颈总动脉结扎后口服L-NBP对大鼠在水迷宫实验中的空间记忆障碍的影响。图2A表示在训练阶段潜伏期的改变；图2B表示移去平台后的平台探索实验，大鼠自由游泳60秒钟，其在平台所在象限(Q4)停留的时间。所有数值以均数±标准误表示。每组12-14只大鼠；#P＜0.05与假手术(sham)组比较。P＜0.05与溶剂对照组(vehicle)比较。
图3.双侧颈总动脉结扎5周后大鼠海马CA1区(A，B，C)和皮层(D，E，F)的H-E染色的显微镜下图象改变(40倍)。假手术组(A，D)；溶剂对照组(B，E)；L-NBP(10mg/kg)治疗组(C，F)图4..双侧颈总动脉结扎5周后大鼠视束K-B染色(A，B，C放大40倍)和尾核GFAP免疫组化染色(D，E，F放大20倍)的显微镜下图象变化。假手术组(A，D)；溶剂对照组(B，E)；L-NBP(10mg/kg)治疗组(C，F)图5.L-NBP对大鼠持续侧脑室灌流Aβ(1-40)后在水迷宫实验中的记忆障碍的影响。图示为训练阶段逃避潜伏期的改变；所有数值以均数±标准误表示。每组10只大鼠。
图6.L-NBP对大鼠持续侧脑室灌流Aβ(1-40)造成的记忆障碍的影响。工作记忆测验(每天5次)在Aβ(1-40)灌流后第14-16天进行。图5A表示在第一次实验中潜伏期的改变；图5B表示后4次实验中潜伏期的改变。所有数值以均数±标准误表示。每组10只大鼠。##P＜0.01与假手术组相比；*P＜0.05与Aβ(1-40)模型组相比。
图7.实施例1小鼠从手术后第10天开始灌服药物或溶剂。水迷宫实验在术后第29-33天进行，避暗实验在34-35天进行。动物在第36天处死，进行生化测定或病理学检查。在行为学实验中，均在实验前40分钟给药。
图8.实施例2小鼠从手术后第2天开始灌服药物和溶剂。水迷宫训练试验在术后第9-13天进行，第13天进行平台探索试验，第14-16天进行工作记忆测验。动物在第17天处死，断头取脑进行生化测定。在行为学实验中，均在实验前40分钟给药。

1.实施例1 左旋正丁基苯酞对老年性痴呆之一种，血管性痴呆的治疗作用材料和方法试剂和药品L-，D-，DL-NBP由本所合成室提供，光学和化学纯度＞98％，旋光度依次为-66.49，+66.88和0度。用植物油配制。
仪器Morris水迷宫自动监控仪，避暗箱由中国医学科学院药物研究所仪电室研制2-VO模型建立雄性Wistar大鼠，10周龄，体重280克左右，每5只放置1笼中，室温保持在23℃，自由进食和引水。大鼠用戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg)，双侧颈总动脉暴露，仔细分离颈总动脉的包膜和迷走神经。低灌注模型组使用5-0丝线结扎双侧颈总动脉。假手术组除不结扎双侧颈总动脉外接受相同的手术。术后在伤口上撒少许灭菌结晶磺胺粉，缝合皮肤。手术一个月后进行水迷宫实验及避暗实验。
实验分组及设计大鼠随机分成8组，每组10只。1)假手术组除不结扎双侧颈总动脉，其余操作均与低灌注组相同；2)溶剂对照组仅口服植物油；3)DL-NBP10mg/kg组；4)DL-NBP30mg/kg组；5)L-NBP10mg/kg组；6)L-NBP30mg/kg组；7)D-NBP30mg/kg组；从手术后第10天开始灌服药物或溶剂。水迷宫实验在术后第29-33天进行，避暗实验在34-35天进行。动物在第36天处死，进行生化测定或病理学检查。在行为学实验中，均在实验前40分钟给药。
水迷宫实验Morris水迷宫主要由一金属圆柱形水池(池高60cm，直径120cm)和自动显示、监测、记录装置及安全岛(直径10cm的平台)组成。预先在水池中注入清水，然后加入溶有1000g的新鲜奶粉的水溶液，使池水成为不透明的乳白色，水面高出平台15mm。这样动物不能通过听、视和嗅觉到达平台，以便检测动物对空间位置的敏锐性。水温保持23±1℃，水池分为4个象限(东、南、西、北)，平台置于西南象限的中心。每只大鼠的游泳活动通过电视仪进行监测，直接连于计算机进行处理分析。水迷宫实验连续进行5天。每只大鼠1天接受2次训练寻找平台，两次分别从东北象限和西北象限的中点，头朝向池壁入水，两次训练间隔10分钟。记录找到平台的时间(潜伏期)，并将2次实验结果进行平均。如果大鼠在60秒内未找到平台，则潜伏期以60秒计算。无论在60秒内找到平台与否，大鼠都在平台上停留10秒。第一次实验开始前将大鼠放到平台上10秒适应。随训练次数的增加，各组大鼠寻找安全岛的潜伏期缩短。最后一次训练后进行探索实验。移去平台，大鼠自由游泳60秒寻找平台，记录大鼠在每个象限花费的时间。大鼠在原来平台所在象限停留的时间长，提示大鼠已经对这个空间目标存在记忆。
我们将搜索策略分为4类(1)边缘式，大鼠沿水池边缘运动，无寻找动机；(2)随机式，大鼠搜索时无明确方向；(3)趋向式，大鼠已记得安全岛的大概位置，在发现安全岛前转弯少于4次；(4)直线式，大鼠已明确记得安全岛的位置，直接游向安全岛。实验结果以大鼠找到安全岛的时间即潜伏期和搜索策略表示对胆碱乙酰基转移酶、抗氧化酶和MDA的检测将大鼠断头取脑，在冰浴上剥离出皮层和海马组织，称重后迅速置于液氮中冷冻待用。样品加入预冷的pH7.0磷酸钾缓冲液0.05mol L-1(内含0.5mol L-1EDTA和7％甘油)，冰浴制成10％的组织匀浆，蛋白定量以Lowry比色法测定。
1.胆碱乙酰基转移酶(ChAT)的测定反应体系中加入磷酸钠缓冲液0.5mol L-1，乙酰辅酶A0.0062mol L-1，氯化胆碱1.0mol L-1，甲基硫酸新斯的明76μmol L-1，NaCL3mol L-1及EDTA0.011mol L-1，盐酸肌酸酐0.5mol·L-1各40μl，最后各管加入蒸馏水至0.8ml。置37℃温浴5min后，各管加入200μl组织匀浆液，然后将各管加入沸水2min，之后加入2.5mmol L-1砷酸钠0.8ml，室温下15000×g离心3min，取2.0ml上清加入40μ13mmol L-14-PDS，置25℃温浴15min后，测定OD值(λ＝324nm)，计算ChAT活性，以nmolCoA SH/mgprotein/hr表示。
2.超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，的测定参照南京建成试剂公司试剂盒说明书进行。
病理学和免疫组织化学检测每组随机选取4-6只动物，行为学实验后，戊巴比妥麻醉(100mg/kgip)，依次剪开皮肤，胸腔，充分暴露心脏，剪开左侧心尖部，以灌注针朝主动脉方向插入，止血钳夹闭，输注生理盐水，于右心耳下部剪开右心房，生理盐水灌注15-20min(200-300ml)，流出液变清，换以4％多聚甲醛PBS液继续灌注15-20min(150-200ml)，动物全身僵硬，肝脏发白为止，然后断头取脑，用刀片切去前部端脑和后部小脑，放入4％多聚甲醛继续固定48h(石蜡切片)或20％的蔗糖多聚甲醛溶液固定48h(冰冻切片)。
石蜡切片经固定、包埋，切片后应用Hematoxylin-Eosin(HE)染色，K-B(Klüver-Barrera Luxol fast blue)染色进行病理检测，免疫组化的方法检测GFAP在脑组织中含量的变化。
统计分析所有结果采用均数±标准误表达。水迷宫实验中各组的潜伏期差异比较采用重复测定的两因素方差分析。组间差异采用post hoc LSD或Turkey检验。水迷宫平台探索实验采用单因素方差分析。避暗实验采用Kruskal-Wallis检验和Mann-Whitney U检验。生化测定采用单因素方差的分析。P＜0.05为有显著性差异。
实验结果L-NBP对大鼠水迷宫学习记忆的影响在水迷宫实验中，学习和保留实验经常被用于评价低灌注大鼠的空间记忆能力。在第一天训练中，各组间没有显著性差异。经过5天的训练，假手术组的的搜索策略从边缘式和随机式转向趋向式和直线式，潜伏期(12.6±3.34秒)明显缩短。而溶剂对照组的搜索策略没有明显的转变，仍为边缘式和随机式，潜伏期(47.6±5.88秒)未明显缩短，两组相比差异显著(P＜0.01)。L-NBP10mg/kg组的搜索策略从边缘式和随机式转向趋向式和直线式，潜伏期(26.85±5.98秒)缩短明显，与溶剂对照组比较有明显差异(P＜0.001两因素方差分析)，而与假手术组比较无显著差异。其它药物如DL-NBP10mg/kg，DL-NBP30mg/kg和D-NBP30mg/kg的改善作用均不明显，见图1A，B和图2。在5天的学习训练结束后，进行平台探索实验，将安全岛撤去以测试大鼠是否已形成对安全岛的空间记忆。除溶剂对照组外，所有大鼠在目标象限的停留时间都大于25％，表明都已经形成了对安全岛的相对位置的记忆。假手术组的停留时间(17.73±1.19秒)明显长于溶剂对照组(14.40±0.73秒)，通过单因素方差分析统计，有明显差异(P＜0.05)见图3。L-NBP10mg/kg组在平台所在象限的停留时间较溶剂对照组明显延长(17.62±1.27秒，P＜0.05)。DL-NBP组(10mg/kg和30mg/kg)均无作用。为了排除动物运动能力对其影响，经测定，各组间游泳速度无差异。以上说明只有左旋正丁基苯酞对脑供血不足大鼠的近记忆和空间位置功能缺损有明显作用，而消旋和右旋正丁基苯酞则无作用。
对SOD、ChAT活性和MDA含量的影响 SOD是重要的抗氧化酶，正常对照组皮层组织中SOD的活性为100.07±3.64(NU/mg protein)；海马组织中的活性为57.90±7.41(U/mg protein)。大鼠永久性结扎双侧颈总动脉后，海马SOD的活性与对照组相比明显升高(P＜0.05)，这可能是一种代偿性反应。经L-NBP(10mg/kg)治疗后，该酶活性接近正常水平(P＜0.05)，MDA是脂质过氧化的标志，可反应在体内的脂质过氧化的程度，间接地反应出细胞损伤的程度。在此实验中，模型组皮层MDA的含量升高了19.9％，与正常对照组相比具有显著性差异(P＜0.001)。经L-NBP(10mg/kg)治疗后，皮层MDA的含量明显降低了20.7％(P＜0.001)。大鼠永久性结扎双侧颈总动脉后，皮层ChAT的活性显著降低，与正常对照组相比，下降了34.4％(P＜0.05)，表明低灌注可致胆碱能神经功能受损。L-NBP(10mg/kg)连续给药16天后，可使皮层组织中ChAT的活性较模型组提高了37.1％，具有显著性差异(P＜0.05)。(见表1表1.L-NBP对低灌注大鼠皮层和海马的SOD和ChAT活性和MDA含量的影响(n＝7-9)组别 SOD活性 MDA含量 ChAT活性(NU/mg蛋白) (nmol/mg蛋白)(％of假手术)脑区皮层 海马皮层海马皮层 海马假手术组100.07±3.64 57.90±7.41 3.13±0.10 3.03±0.12 100.0±13.3 100.0±7.2溶剂对照组 114.42±7.82 81.16±6.84#3.91±0.22###3.63±0.45 65.6±15.1#102.6±15.1
L-NBP98.84±5.5357.60±3.86*3.10±0.09***3.42±0.12104.3±8.2*110.0±13.5(10mg/kg)#P＜0.05，###P＜0.001与假手术组相比；*P＜0.05，***P＜0.001与溶剂对照组相比。
对病理学和组织化学的影响永久性结扎双侧颈总动脉后，模型组可见皮层和海马CA1区的神经元明显减少，细胞皱缩和神经元深染，而L-NBP(10mg/kg)治疗后能明显改善低灌注诱导的神经元损伤。文献报道双侧颈总动脉结扎可以诱导脑胶质细胞活化，并伴有白质稀薄。白质稀薄按其严重程度一般分为4级0级，正常；1级，神经纤维错排；2级，明显空泡形成；3级，有髓鞘的纤维消失。在我们的实验中，模型组的视束较正常对照组显示明显的白质稀薄，有大量的空泡出现，L-NBP(10mg/kg)长期给药后可显著改善这种情况，视束的空泡明显减少。免疫组化实验发现，GFAP-阳性的星形胶质细胞在正常对照组海马，尾核，胼胝体等部位很少检测到，但双侧颈总动脉结扎4周后，许多GFAP-阳性反应的星形胶质细胞和小胶质细胞出现。经L-NBP(10mg/kg)治疗后，GFAP-阳性的胶质细胞显著减少(见图3，4)。
实验结论由结果可得出以下结论L-NBP10mg/kg组能明显改善2-VO动物近记忆和空间位置的记忆障碍，而消旋丁基苯酞和右旋丁基苯酞对改善记忆功能障碍均无效。本研究在2-VO后笫10天开始给药(一直给药至第35天)，目的在于观测药物对脑低灌引起的神经元退行变的治疗作用，以排除对急性低灌缺血期的影响。
L-NBP对ChAT活性有提高作用，说明能使胆碱能神经ACh水平增加，有利于改善记忆功能。此外L-NBP能明显抑制氧化损伤，说明L-NBP能降低神经细胞的损伤。由2-VO引起的脑低灌的病理特征为白质稀疏，空泡和胶质细胞增多(Narri.et al.Chronic cerebralhypoperfusion-induced neuropathological changes in rats.Jpn.J.Psychopharmacol.1998；18181-188)，而L-NBP均能改善这些病理改变。以上这些作用机制对L-NBP改善2-VO大鼠引起的记忆障碍提供了依据。根据以上结果，提示L-NBP对血管性痴呆有明显治疗和预防作用的可能。
实施例2左旋正丁基苯酞能明显改善β-淀粉样肽(1-40)引起的老年性痴呆症状材料和方法试剂和药品L-NBP由本所合成室提供，用植物油配制。Aβ(1-40)购自Sigma公司。Alzet脑微渗透泵灌流装置购自美国DURECT公司。仪器Morris水迷宫自动监控仪及实验方法，参见以上脑低灌注大鼠学习记忆损伤实验模型建立雄性Wistar大鼠，10周龄，体重280克左右，每笼放置1只动物，室温保持在23℃，自由进食和引水。大鼠用戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg)，腹卧位固定于立体定位仪上，剪开头部的皮肤，将用于灌流Aβ(1-40)的套管植入右侧脑室，根据Paxions和Watson的大鼠脑立体定位图谱，植入部位在前囟后0.3mm，右1.1mm，深4.0mm。套管与一个微量渗透泵相连接。微量渗透泵置于大鼠的背部。Aβ(1-40)溶于35％乙腈/0.1三氟乙酸，以300pmol/天持续脑室灌流(i.c.v)，对照组仅灌流溶剂35％乙腈/0.1％三氟乙酸。既往实验证实在此流速下，溶剂不会引起大鼠行为和神经化学的改变。
实验分组及设计大鼠随机分成4组，每组10只。1)假手术组大鼠脑室仅灌流35％乙腈/0.1三氟乙酸+溶剂；2)模型组Aβ(1-40)+溶剂；3)Aβ(1-40)+L-NBP10mg/kg组；4)Aβ(1-40)+L-NBP30mg/kg组。从手术后第2天开始灌服药物和溶剂。水迷宫训练试验在术后第9-13天进行，第13天进行平台探索试验，第14-16天进行工作记忆测验。动物在第17天处死，断头取脑进行生化测定。在行为学实验中，均在实验前40分钟给药。(见图8)水迷宫实验自icv Aβ(1-40)后第9-13天进行水迷宫训练试验，第13天进行平台探索试验。在icv Aβ(1-40)后第14-16天进行工作记忆测验(见上图)，该测验是在训练试验和平台探索试验后动物已获得一定的记忆基础上，观察改变平台和象限后动物的快速学习空间记忆能力。除了平台每天改变位置，实验过程与标准的水迷宫训练试验相似。每天5次实验，大鼠分别从5个入水点开始进行游泳。每天的第一次实验称为示范试验，大鼠被允许游到处于新位置的平台上，并停留10秒钟，其后的四次试验，平台位置保持不变，只是入水点的象限不同。工作记忆能力的潜伏期取第2到第5次试验的平均值，每只大鼠的工作记忆能力通过3天的实验平均值进行计算。
生化实验丙二醛(MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的测定同以上实验。
统计分析所有结果采用均数±标准误表达。水迷宫实验中各组的潜伏期差异比较采用重复测定的两因素方差分析。组间差异采用post hocLSD或Turkey检验。水迷宫平台探索试验，工作记忆测验，生化测定采用单因素方差分析。P＜0.05为有显著性差异。
实验结果L-NBP对大鼠水迷宫学习记忆的影响在第一天训练中，各组间没有显著性差异。经过5天的训练，假手术组的搜索策略从边缘式和随机式转向趋向式和直线式，潜伏期(13.02±2.77秒)明显缩短。而模型组的搜索策略没有明显的转变，仍为边缘式和随机式，潜伏期(30.18±4.81秒)未明显缩短，两组相比差异显著(P＜0.01)。经L-NBP治疗后，大鼠在水迷宫试验中的潜伏期明显缩短，其中L-NBP10mg/kg组和30mg/kg组的搜索策略从边缘式和随机式转向趋向式和直线式，潜伏期分别为27.28±6.42秒和25.88±5.51秒，与模型组比较有明显差异(P＜0.05两因素方差分析)，而与假手术组比较无显著差异，说明经L-NBP治疗的大鼠已接近正常水平，见图4。在工作记忆测验中，第一次实验和第2-5次实验的潜伏期见图5A，B。虽然在第一次示范实验中，各组的潜伏期没有显著性差异，但在以后4次实验中，假手术组的潜伏期为9.15±0.91秒，模型组的潜伏期为14.05±1.88秒，后者潜伏期明显延长，二者有显著性差异(P＜0.01)。L-NBP组可以剂量依赖性的显著改善工作记忆能力(P＜0.01)。L-NBP增加GSH-Px活性和降低MDA的含量GSH-Px是重要的抗氧化酶，在我们的实验中，假手术组皮层组织中GSH-PX的活性为15.86±0.91(U/mg protein)；海马组织中的活性为16.19±1.19(U/mg protein)。大鼠Aβ(1-40)持续灌流后，GSH-Px的活性与假手术组相比在皮层和海马分别降低了29.5％和42.4％，具有显著性差异(P＜0.01和P＜0.001)。经L-NBP治疗后，30mg/kg组对该酶活性明显升高(P＜0.01)，L-NBP(10mg/kg)也有升高该酶的活性作用，但没有统计学意义。MDA是脂质过氧化的标志，反应体内脂质过氧化的程度，间接地反应出细胞损伤的程度。在此实验中，大鼠Aβ(1-40)持续灌流后皮层和海马MDA的含量分别升高了25.7％和23.6％，与假手术组相比具有显著性差异(P＜0.05和P＜0.01)。经L-NBP治疗后，皮层和海马MDA的含量明显降低，10mg/kg组分别降低了28.4％和24.3％(P＜0.05和P＜0.01)，30mg/kg的作用弱于10mg/kg组，但与Aβ(1-40)模型组相比，仍具有显著性差异(P＜0.05)，见表2。
表2.L-NBP对大鼠持续灌流Aβ(1-40)后皮层和海马SOD活性和MDA含量的影响(n＝7)组 GSH-PX MDA(U/mg protein) (nmol/mg protein)皮层 海马 皮层 海马假手术组 15.86±0.91 16.19±1.191.10±0.09 1.13±0.06模型组 11.18±1.32##9.32±1.01###1.48±0.14#1.48±0.12##Aβ(1-40)L-NBP 11.73±0.53 12.73±1.341.06±0.05*1.12±0.07**(10mg/kg)L-NBP 15.40±1.03**18.91±1.16**1.06±0.10*1.15±0.07*(30mg/kg)#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001与假手术组比较；*P＜0.05，**P＜0.01与模型组比较。
实验讨论大鼠持续侧脑室灌流Aβ(1-40)引起的记忆障碍是公认的观测药物对AD治疗作用的模型。由以上结果可见，L-NBP不仅对2-VO导致供血不足引起血管性痴呆的模型有明显作用，而且对大鼠持续侧脑室灌流Aβ(1-40)引起的近记忆和空间位置的记忆障碍也有明显改善作用。这说明L-NBP对不同原因引起的近记忆和空间位置记忆障碍均有明显改善作用。此外，L-NBP有阻断氧化损伤的作用(提高GSH-Px活性和降低MDA含量)，结合其明显的脑保护作用，提示L-NBP有治疗和预防老年性痴呆的作用。


本发明公开了如通式(I)所示左旋正丁基苯酞制备预防和治疗痴呆，尤其是阿尔茨海默病、血管性痴呆的药物中的用途。