专利名称：一种海洋卤代酸脱卤微生物的分离筛选方法卤化物被广泛地用来生产杀虫剂，除草剂，工业用溶剂和脱脂剂，其中卤代酸尤其 手性纯产品有着巨大的应用前景。同时由于大量使用，现在有机卤化物已成为公认的“危险 性”有毒污染物，据文献报导卤代酸广泛存在于自然环境之中，尤其是水环境中。研究脱卤 酸脱卤酶一方面可以生产手性有机中间体，另一方面有重大环境应用价值可以用于污染水 源的脱卤处理，工厂的有机废水处理，用于环境修复等方面。传统的卤代酸分离纯化方法都 是以土壤为分离源，通过检测微生物脱卤产生的卤族元素来筛选。由于海洋中很多微生物， 海洋藻类，海洋动物可产生多种卤化物，同时由于大量的工业和生活废水排放入海，使得海 洋中有机卤化物的含量和种类都非常丰富。海洋相对于陆地是脱卤微生物的更好分离源。
本发明的目的在于提供一种简便易行、快速有效的海洋卤代酸脱卤微生物的分离 筛选新方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为首先选取海洋中卤化物较丰富的海区(如污染严重的河口区)或经检验含有丰富 卤化物的海区中微生物多样性高的海洋样品为分离源；通过特殊设计的卤代酸单一碳源液 体培养富集培养样品中的脱卤微生物，通过检测培养基颜色变化，快速获得大量目的微生 物；以显色平板对富集后的大量微生物进行筛选，通过颜色变化很容易挑出活性较好的目 的菌株；最后对初筛得到的目的菌株进行液体培养，用HPLC的方法对菌株脱卤能力进行检 测，以比色法检测菌液0D600值来比较菌株生长能力，最终得到生长性状良好降解能力较 强的脱卤菌株。目标菌株可以在有氧条件下催化卤代物进行脱卤反应，其反应式为RCL00H+H20 — R0HC00H+HCL—种海洋卤代酸脱卤微生物的分离筛选方法，以海洋样品为菌株分离源，以卤代 酸为单一碳源进行富集培养，经过显色平板和液体培养筛选得到具有卤代酸脱卤能力的菌 株，具体工艺步骤如下1)取海洋样品，称重，样品于装有无菌海水的烧杯中洗涤3 5次，洗去样品表面 附着的微生物和其它杂质；2)将样品放入灭菌后的研钵中，加 入其5-10倍重量体积比(5-10mL无菌海水/g 样品)的无菌海水，研磨至均勻的浆液；取浆液I-IOmL加入IOOmL卤代酸液体培养基中，在 三角烧瓶中20 40°C，150 250转/分摇瓶培养；观察培养液颜色变化由蓝色变为橙红 色时，取I-IOmL菌液加入新的卤代酸液体培养基中，继续摇瓶培养；3)观察菌液再次变为橙红色时取0. 5mL，加入装有4. 5mL无菌海水的试管中涡旋混勻，取混勻后的菌液200ul备用；再取上述混勻后的菌液0. 5mL,加入装有4. 5mL无菌海水的试管中涡旋混勻，取混 勻后的菌液200ul备用；重复上述操作过程6-9次，使最终菌液的浓度稀释到原培养后浓度的10_6 10_9 ；4)分别取上述稀释操作中各步的备用菌液50-200ul涂卤代酸显色培养基平板， 每个备用菌液涂5 10个平板；25 35°C培养箱中倒置培养，观察菌株生长与情况，当平 板上出现明显的橙红色菌株后挑取深红色的菌落在卤代酸显色平板上划线；划线后的平板 再于25 35°C培养箱中倒置培养3 5天，挑取深红色的单菌落继续在显色平板上划线培 养，重复这一过程3 5次； 5)挑选深红色的菌落接种2216E平板，培养2 3天后挑取单菌落接种2216E液 体培养基在试管中25 35°C，150 250转/分培养24 48小时，观察培养液出现明显 浑浊后取菌液加入装有体积浓度15-20%甘油水溶液的冻存管中颠倒混勻后-70°C放置保 存备用；6)在菌株生长的2216E平板上，取1环菌体接种到装有100 200mL卤代酸液体 培养基的三角烧瓶中，培养基中卤代酸浓度10 30mM，25 35°C，150 250转/分摇瓶 培养；3天后分光光度计检测菌液在600nM波长检测光下吸光值(0D600)，HPLC检测菌液中 残留卤代酸量，0D600值大于等于1，卤代酸降解率(残留卤代酸浓度/卤代酸初始浓度) 大于等于50%的菌株即为高活力卤代酸脱卤菌株。所述海洋样品为海洋生物、海洋植物、海底沉积物、海泥或海水中的未滤过物，海 水中的未滤过物是指将海水样品用0. 22uM膜抽滤，膜表面残留的未滤过物。所述的卤代酸液体培养基配制过程如下将KH2PO4I 2g、Na2HP0412H20 10 12g、 溴百里酚兰40 80mg、(NH4)2SO4I 2g和酵母浸粉0. 01 0. 05g加入到IL陈海水中，调 PH值到7. 5 9. 0，120-125度蒸汽灭菌15 20分钟后，放置冷却到50 80°C，加入浓度 为IM pH为7. 0经0. 22uM滤膜过滤除菌的卤代酸，至卤代酸的终浓度为10 30mM。所述卤代酸是指2-氯丙酸、2-2氯丙酸等烃链2号位为卤族元素(氯、溴、氟、碘) 取代的卤代脂肪酸。所述卤代酸显色培养基配制过程如下将(NH4)2S042g、酵母浸粉0.05g、琼脂 15-20g、溴百里酚兰40-80mg加入到IL陈海水中，调pH值到7. 5 9. 0，120-125度蒸汽灭 菌15-20分钟后，放置冷却到50 80°C，加入浓度为IM pH为7. 0经0. 22uM滤膜过滤除菌 的卤代酸，至卤代酸的终浓度为10 30mM。所述2216E培养基(固体培养基)配制过程如下将蛋白胨5克、酵母膏1克、磷 酸高铁0. 01克、琼脂15 20克加入陈海水1000毫升，氢氧化钠(质量浓度5% )的溶液 调PH值7. 5-8，煮沸后120-125度蒸汽灭菌15-20分钟，放置冷却到60 80°C，倒平板。HPLC检测条件柱子0DS 200X4. 6，流动相12 88的乙腈水用磷酸调pH到2. 0， 流速:lml/min，柱温25°，检测波长210nm，检测时间8分钟/样品。由于在海水中存在高浓度的卤素离子，微生物脱卤释放卤素离子很难检测，为此 本方法在富集阶段采用了创新设计的氯丙酸培养基，培养基选用PH值在7左右的磷酸盐缓 冲体系搭配酸碱指示剂溴百里酚兰，由于磷酸缓冲液和溴百里酚兰的解离常数和培养基PH 值相近，该培养基颜色变化和PH变化呈线性，可以通过检测培养基颜色变化考察氯丙酸降解情况，方法简便快捷。而在复筛阶段采用了精确度高的HPLC方法。这两种检测方法的采 用保证了本发明的有效性和准确性。本发明适用于环境保护、污水处理、医药中间体、含氯农药等工业领域和实验研究 领域。2.将海绵块放入灭菌后的研钵中，加入15mL无菌海水，研磨至均勻的浆状。取勻 浆ImL加入IOOmL卤代酸液体培养基中(500mL三角烧瓶)28°C 200转/分摇瓶培养。观察 培养液颜色变化，7天后培养液由蓝色变为橙红色。取ImL菌液加入新的富集培养基中，继 续摇瓶培养。3.菌液培养5天后再次变为橙红色时取0. 5mL,加入装有4. 5mL无菌海水的试管 中涡旋混勻，取混勻后的菌液0. 5mL,加入装有4. 5mL无菌海水的试管中涡旋混勻，取混勻 后的菌液如上依次梯度稀释到10-9。4.取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9稀释比对应的稀释液200111涂卤代酸显色 平板(12cm)每个梯度涂5个平板。28°C培养箱中倒置培养，观察菌株生长与情况，5天后平 板上出现明显的橙红色菌株后挑取深红色的菌落在卤代酸显色平板上划线，28°C培养箱中 倒置培养3 5天，挑取生长较好的红色较深的单菌落继续在显色平板上划线培养，重复这 一过程3 5次。5.挑选生长较好红色较深的菌落6株分别接种2216E平板，培养2 3天后挑取 单菌落接种2216E液体培养基在试管中28°C 200转/分培养24小时，观察培养液出现明显 浑浊后取200uL加入装有1800uL20%甘油的冻存管中颠倒混勻后_70°C放置保存备用。6.每个菌株各取1环菌体接种卤代酸液体培养基(卤代酸浓度20mM， 100mL/500mL三角烧瓶)28°C 200转/分摇瓶培养。3天后分光光度计检测菌液的0D600 值，HPLC检测菌液中残留卤代酸量计算降解率。0D600值大于等于1，卤代酸降解率(培养 基中残留卤代酸浓度/培养基中卤代酸初始浓度)大于等于50 %的菌株有2株，菌株降解 与生长数据如下菌株编号12菌液0D6001. 01 1. 23降解率(％)5262实施例1所使用的卤代酸液体培养基配制过程如下将KH2P04lg、Na2HPO412H20 12g、溴百里酚兰40mg、(NH4) 2S042g和酵母浸粉0. Olg加入到IL陈海水中，调pH值到7. 6， 125度蒸汽灭菌15分钟后，放置冷却到60°C，加入浓度为IM pH为7. 0经0. 22uM滤膜过滤 除菌的氯丙酸，至氯丙酸的终浓度为20mM。实施例1所使用的卤代酸显色培养基配制过程如下将(NH1)2SOJg,酵母浸粉 0. 05g、琼脂15g、溴百里酚兰40mg加入到IL陈海水中，调pH值到7. 6，125度蒸汽灭菌15分钟后，放置冷却到60°C，加入浓度为IM pH为7. O经0. 22uM滤膜过滤除菌的氯丙酸，至氯丙酸的终浓度为20mM。实施例1所使用的2216E培养基(固体培养基)配制过程如下将蛋白胨5克、酵 母膏1克、磷酸高铁0. 01克、琼脂20克加入陈海水1000毫升，氢氧化钠溶液调PH值7. 6， 煮沸后125度蒸汽灭菌15-20分钟，放置冷却到60°C，倒平板。通过菌株的分子生物学(16SrDNA序列比对)鉴定，分离到的菌株与中国普通微生 物菌种保藏中心的恶臭假单胞菌(编号1. 1130)的菌株16SrDNA序列相似性达到100%，可 鉴定为假单胞菌属，恶臭假单胞菌种。恶臭假单胞菌为海洋中常见的广泛存在的海洋氯丙 酸降解菌种。实施例2与实施例1不同之处在于，其所选用的海洋样品为大连石槽水域海泥。分离获得 菌株16株，分光光度计检测菌液的0D600值，HPLC检测菌液中残留卤代酸量计算降解率。 0D600值大于等于1，卤代酸降解率(培养基中残留卤代酸浓度/培养基中卤代酸初始浓 度)大于等于50%的菌株有4株，菌株降解与生长数据如下菌株编号1234菌液1.012 1.311 1.342 2.5820D600降解率(％)536265100通过对菌株的分子生物学(16SrDNA序列比对)鉴定，分离到的菌株3与中国普 通微生物菌种保藏中心的恶臭假单胞菌(编号1.2309)的菌株16SrDNA序列相似性达到 100%，可鉴定为假单胞菌属，恶臭假单胞菌种。菌株1，2，4与中国普通微生物保藏中心的 铜绿假单胞菌(编号1.2031)的菌株16SrDNA序列相似性达到100 %，可鉴定为假单胞菌 属，铜绿假单胞菌种。假单胞属细菌菌为海洋中常见的广泛存在的海洋氯丙酸降解菌种。实施例3与实施例1、2不同之处在于，其所选用的海洋样品为大连凌水河口水域海水。分 离获得菌株12株，分光光度计检测菌液的0D600值，HPLC检测菌液中残留卤代酸量计算降 解率。0D600值大于等于1，卤代酸降解率(培养基中残留卤代酸浓度/培养基中卤代酸初 始浓度)大于等于50%的菌株有3株，菌株降解与生长数据如下菌株编号123菌液1. 112 1.211 1.8420D600降解率(％)546375通过对菌株的分子生物学(16SrDNA序列比对)鉴定，分离到的菌株1与中国普 通微生物菌种保藏中心的恶臭假单胞菌(编号1.2309)的菌株16SrDNA序列相似性达到 100%，可鉴定为假单胞菌属，恶臭假单胞菌种。菌株2，3与中国普通微生物菌种保藏中心 的恶臭假单胞菌(编号1. 2309)的菌株16SrDNA序列相似性达到98%，可鉴定为假单胞菌 属，恶臭假单胞菌种。假单胞菌为海洋中常见的广泛存在的海洋氯丙酸降解菌种。
本发明涉及一种海洋卤代酸脱卤微生物的分离筛选方法，其以海洋样品为分离源，通过卤代酸单一碳源液体培养基富集培养，卤代酸单一碳源显色平板筛选，菌株的分离纯化，菌体在卤代酸液体培养条件下催化脱卤情况检测四个步骤可以最终得到海洋卤代酸脱卤微生物。本发明适用于环境保护、污水处理、医药中间体、含氯农药等工业领域和实验研究领域。