一种卤代酸脱卤酶的提取纯化方法[0004]本发明的目的是提供卤代酸脱卤酶的分离提纯的方法及用于外消旋的2-卤代酸的手性转化。[0005]为实现上述目的，本发明技术方案如下:[0006]卤代酸脱卤酶的分离提取方法，其以施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)为原料，提取并分离纯化得到两种卤代酸脱卤酶，且两种酶的立体选择性相反。[0007]具体操作过程如下，[0008]1)收集的菌体，用10-100mM的磷酸盐缓冲液(pH6_9)清洗后，超声破碎细胞；[0009]2)于 0-10°C，3000~l5000rpm 离心 10-60min，取上清；[0010]3)上清液中加入硫酸铵制成20-40%的硫酸铵饱和度，搅拌l_2h后，离心取蛋白沉淀物，用PH4-10的磷酸盐缓冲液分别重溶后，得到降解D-2-氯丙酸的卤代酸脱卤酶，进一步用超滤膜超滤除盐，膜的截留分子量为lOOOODa。
[0011]4)在3)的基础上所得的上清进一步加入硫酸制成60-100%的硫酸铵饱和度，搅拌
1-2h后，离心去沉淀的蛋白，用pH4-10的磷酸盐缓冲液重溶后，得到降解L-2-氯丙酸的卤代酸脱卤酶，最后用超滤膜超滤除盐，膜的截留分子量为10kDa.[0012]所述硫酸铵分级沉淀所得卤代酸脱卤酶还可以采用阴离子交换树脂及琼脂糖树脂进一步纯化，具体为:
[0013]1)所得两种卤代酸脱卤酶分别经阴离子柱交换柱层析分离。用NaCl(0-1M)或Na2SO4 (0-0.3M)进行线性梯度洗脱，得到活性组分。酶液体积与洗脱液体积比为1:20-40。收集活性组分并测定蛋白含量。
[0014]2)将离子交换柱所得活性组分经超滤浓缩后，上凝胶柱，用0.02-0.08M，pH4_9的磷酸钾缓冲液洗脱分离，得到卤代酸脱卤酶。
[0015]所述阴离子交换树脂为DEAE-Sepharose FF, Q-Sepharose FF, Q-Sepharose XL或Q-sepharose HP。琼脂糖凝胶树脂为 Sephacryl S200, Superdex 200 或 Sephadex GlOO0
[0016]外消旋的2-卤代酸的手性转化方法的具体技术方案如下:lmL反应体系中含加入手性的5-50mM 2-卤代酸，50_100mM缓冲液及脱卤酶。在30°C反应0.5_24h后，加入1%(ν/V)浓磷酸(85%，w/v)终止反应，得到转化产物。
[0017]所述缓冲液为K2HPO4-K2HPO4 (pH7.5)时，酶的加入量为:0.1-0.8mL ;缓冲液为Glycine-NaOH(pH 10.0)时，酶的加入量为:0.05-0.lmL。
[0018]有益效果
[0019]本发明与现有技术相比，具有如下有益效果
[0020]1.从施氏假单胞菌中分离纯化得到卤代酸脱卤酶。利用本技术，在施氏假单胞菌中首次分离纯化得到2种具手性选择性的卤代酸脱卤酶。
[0021]2.本发明作为一种具有选择性降解卤代酸的脱卤酶具有良好的应用前景。本发明分离得到的卤代酸脱卤酶可将卤代酸选择性脱齒，得到相应的手性羟基酸。
[0022]3.由于能够降解卤代酸，且对两种手性的卤代酸起作用，可应用于环境领域，消除卤代酸对环境的危害。

[0023]卤代酸脱卤酶的分离纯化以海洋细菌施氏假单胞菌为原料，采用硫酸铵沉淀，超滤，离子交换柱和凝胶柱分离等多种分离手段相结合的方法，得到较纯的两种卤代酸脱卤酶。L-2-卤代酸脱卤酶能够选择性催化转化L-2-氯丙酸。表观分子量为25kDa。在pH8-11之间表现出较好的活性。D-2-卤代酸能够催化转化D-2-氯丙酸。分类地位:施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri),属于细菌域(Bacteria),变形菌门(Proteobacteria),Y _变形菌纲(Gammaproteobacteria)，假单胞菌目(Pseudomonadales)，假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，假单胞菌属(Pseudomonas.)。
[0024]下述实施例中所用施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 203096 ;中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，地址:武汉市武昌珞珈山(武汉大学)，邮编:430072，电话:(027)-68752319 ;其发表于现有的专利，专利申请号为200310111556.X，专利名称是:施氏假单胞菌ZWLR2-1及其制法和应用，菌能降解1_氯-硝基苯。
[0025]1、菌体培养:
[0026]I)种子液的培养:将施假单胞菌菌种在2216E固体平板培养基中划线，30°C复苏培养，然后在含2216E培养基(IOmL)的试管中培养I天，得种子液A。取3_5mL种子液A接种到含2-氯丙酸培养基(IOOmL/瓶)中培养，经培养48h后得到种子液B。种子液A及种子液B均在摇床(200rpm，30°C)下暗处培养。
[0027]a)2216E培养基:在IL的水中，加入蛋白胨(5.0g/L),酵母浸粉(lg/L)，FeCl3 (0.lg/L), NaCl (30g/L)及琼脂粉(15g/L)，培养基pH为7.5，121°C灭菌后，倒平板制成固体培养基后备用。2216E液体培养基除了不含有琼脂粉外，其它成分同固体培养基。
[0028]b)2_氯丙酸(2-CPA)液体培养基:培养基中含Na2HPO4.12H20 (12g/L)，NaH2PO4.2H20 (lg/L)，NaCl (30g/L)，酵母浸粉(0.1gL)，(NH4)2S04(2.0g/L)，MgSO4.7H20(0.lg/L)及 IOmL 微量元素母液(见参考文献 Van der Ploeg J, Van HallGj Janssen DB.Characterization of the haloacid dehalogenase from Xanthobacterautotrophicus GJlO and sequencing of the dhlB gene[J].Journal Of Bacteriology，1991，173(24):7925-7933.)。培养基在121°C灭菌20min，冷却后临用前加入1%(ν/ν)的2-氯丙酸溶液(lmol/L)。
[0029]2)菌体摇瓶扩大培养
[0030]a)摇瓶培养:取种子液B 3-5mL，接种到2_氯丙酸(2-CPA)液体培养基(IOOmL培养基/瓶)中。接种后在30°C下暗处200r/min摇床培养，培养48h或菌体置于指数生长后期后，收集菌体。
[0031]b)发酵罐培养:在30L培养罐中加入20L的培养基(同摇瓶培养),种子液B为
0.6-0.8L。200r/min，30°C下恒温培养。培养24h后，终止培养并收集菌体。
[0032]3)菌体的收集:将发酵液离心(6500rpmX15min，4°C)，收集底部沉淀的菌体。菌体经磷酸钾缓冲液(K2HPO4-K2HPO4, 50mM，pH7.5)重悬清洗2_3次(即初次离心的菌体用相同的缓冲液重悬，相同条件离心收集菌体。重复该过程2-3次)。最后将菌体置于_70°C保存备用。
[0033]2、活性检测:
[0034]a)D-2-卤代酸脱卤酶的活性测定
[0035]标准反应体系为:在ImL的反应体系中，含有D-2-CPA (IOmM), K2HPO4-K2HPO4(IOOmM, pH7.5)及0.8mL的酶液。在30°C反应3h后加入10% (v/v)浓磷酸(85%)终止反应。如有沉淀，12000rpm离心IOmin去除沉淀，取上清用HPLC检测2-氯丙酸的含量。
[0036]b)L-2-卤代酸脱卤酶的活性测定
[0037]标准反应体系为:在ImL的反应体系中，含有L_2_CPA (IOmM), Glycine-NaOH(100mM，pH10.0)及0.1mL的酶液。在30°C反应Ih后加入10% (v/v)浓磷酸(85%)终止反应。如有沉淀，12000rpm离心IOmin去除沉淀，取上清用HPLC检测2-氯丙酸的含量。
[0038]c) HPLC 检测条件:
[0039]Hypersil GOLD C18 色谱柱(5 μ m, 250mmX4.6mm, Thermo);流动相，乙臆-水(15:85, pH 2.2)，水中含 0.1% (v/v)的浓 H3PO4 (85%, w/v);流速，lmL/min ;柱温，30°C ;检测波长，210nm。实施例1卤代酸脱卤酶的分离纯化
[0040]将16.9g冻存的菌体施氏假单胞菌菌体用341mL缓冲液A (50mMK2HP04-K2HP04+0.65mM DTT，pH 7.5)重悬，每管分装约25mL后，超声破碎细胞(350w，超声5s，间隔5s，60次为一循环。共2次循环)。离心(12000rpmX30min，4°C)后取上清备用。上清中加入固体硫酸铵制成40%的硫酸铵饱和度,搅拌Ih后,离心(12000rpmX 30min,4°C)后得沉淀物A。离心后所得上清继续加入硫酸铵饱和度至80%，搅拌Ih后，离心(12000rpmX30min，4°C)后得蛋白沉淀物 B。
[0041]将沉淀物A用76mL缓冲液A重溶，12000rpmX 5min离心(4°C )去除沉淀后，所得酶液进一步用超滤膜超滤除盐，膜的截留分子量为lOkDa。取截留的酶液，为酶液Al。沉淀物B用19mL缓冲液A重溶，12000rpmX 5min离心(4°C )去除沉淀后，所得酶液进一步用超滤膜超滤除盐，膜的截留分子量为IOkDa,取截留的酶液，为酶液BI。经酶活性检测后，酶液Al中主要含D-2-卤代酸脱卤酶，酶液BI中主要含L-2-卤代酸脱卤酶。(见下表)