专利名称：Stc2基因及其表达产物的应用的制作方法肝癌严重威胁着我国人民的生命健康。肝癌的诊断，尤其早期诊断是临床诊疗和预后的关键。目前，在我国肝癌的定性诊断仍以检测血清AFP(甲胎蛋白)为主，呈现如下特点60%以上的肝癌病例血清AFP > 400 μ g/L ;目前还没有其他肿瘤标志物的特异性可与AFP相媲美；AFP检测较少依赖影像学设备和新技木。AFP是目前全球应用最为广泛的肝 癌肿瘤标志物，已经应用了数十年，其敏感性为40% 65%，特异性为76% 96%，如此的敏感性和特异性均不令人满意。因此，发现灵敏度和特异性高的新的肿瘤标志物将是提高肝癌早期诊断水平的关键。除AFPタト，近年来用于肝癌检测的其他血清标志物还包括甲胎蛋白异质体、Y-谷氨酰转肽酶同エ酶II (GGT-II)、碱性磷酸酶同エ酶I、醛缩酶同エ酶A(ALD-A)、岩藻糖苷酶(AFU)、抗胰蛋白酶I、异常凝血酶原、铁蛋白与酸性铁蛋白等。AFP异质体和异常凝血酶原的应用提高了肝癌患者的检出率，但早期诊断和指导个性化治疗的分子分型诊断仍是我们面临的极大挑战。一般认为以下四类生物分子常作为原发性肝癌标志物1、癌胚和糖蛋白抗原；2、酶和同エ酶；3、细胞因子；4、基因。肝癌的治疗在过去20年来已取得很大的进展，外科手术切除及肝脏移植属于“根治性”治疗，仍是肝癌治疗的首要选择。随着肝癌早期诊断水平的提高及肿瘤治疗生物学概念的改变，肿瘤局部非手术治疗在肝癌治疗中的地位日益提高。经导管动脉内化疗栓塞(TACE)已成为不能切除肝癌治疗的首选方法，是中晚期肝癌治疗的重要手段。该方法可使90%以上的肝癌患者受益，但总体疗效有待提高。此外，经皮肝穿刺瘤内无水こ醇治疗(PEI)也是较常用的局部化疗方法，对癌直径< 3cm的肝癌及门静脉癌栓的治疗有一定价值。但目前肝癌的化疗药物基本沿用其他肿瘤的治疗药物，针对性差，疗效不佳，因此，迫切需要寻找新的作用靶点，研究和开发肝癌特异的新药物，提高化疗的特异性和有效性。近几年来随着对肝癌基础研究的深入，生物治疗在肝癌的综合治疗中取得了较大进展，成了继手术、放疗、化疗后肿瘤治疗的第四大疗法，如免疫治疗、基因治疗，包括抗血管生成、自杀基因治疗、肿瘤疫苗治疗、siRNA技术等。但许多生物治疗的临床疗效仍不十分满意，且绝大多数还处在实验研究阶段，相关的关键理论和实验技术仍需进ー步研究和发展。STC2是ー种糖蛋白激素，在人体多种组织广泛表达，并可能有自分泌或旁分泌功能。STC2具有调节钙磷代谢平衡的作用，有研究显示STC2抑制钠磷协同转运蛋白启动子的活性，从而抑制了肾细胞系对磷酸盐的摄取。研究发现，当内质网功能紊乱时，可以通过 PERK-ATF4 途径诱导 STC2 的表达(Ito D, Walker JR, et al. Characterization ofstanniocalcin 2， anovel target of the mammalian unfolaed protein response withcytoprotectiveproperties. Mol Cell Biol，2004，24 (21) :9456-69) 此外，在氧化性应激和缺氧时可以通过HIF-I的介导使STC2表达，而不依赖PERK-ATF4途径(Law AY，WongCK. Stanniocalcin~21s a HIF-I target gene that promotes ceil proliferation inhypoxia. Exp Cell Res. 2010,316(3) :466-76)。有关STC2基因的研究文献报道较少，特别是STC2基因与肝癌的关系研究还未见文献报道。
本发明要解决的技术问题之ー是提供ー种STC2基因及其表达产物在制备诊断肝癌的产品中的应用。本发明要解决的技术问题之ニ是提供ー种STC2基因及其表达产物在制备治疗肝癌的药物中的应用。本发明要解决的技术问题之三是提供ー对特异扩增STC2基因的引物，该引物可用于制备用RT-PCR或实时定量PCR诊断肝癌的产品。本发明要解决的技术问题之四是提供两对STC2基因的siRNA，该两对siRNA可用于制备治疗肝癌的药物。 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一方面，提供了ー种STC2基因及其表达产物在制备诊断肝癌的产品中的应用。所述诊断肝癌的产品包括用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或基因芯片诊断肝癌的产品。在本发明中，所述用RT-PCR诊断肝癌的产品至少包括ー对特异扩增STC2基因的引物。所述用实时定量PCR诊断肝癌的产品至少包括ー对特异扩增STC2基因的引物。所述用免疫检测诊断肝癌的产品包括 与STC2蛋白特异性结合的抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。所述用原位杂交诊断肝癌的产品包括与STC2基因的核酸序列杂交的探针。所述用基因芯片诊断肝癌的产品包括 与STC2基因的核酸序列杂交的探针。在本发明中，可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对STC2蛋白特异的抗体。例如，将提纯的人STC2基因产物或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗体。同样，表达人STC2蛋白或它的抗原的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。根据本发明制备的抗体可以是单克隆抗体，这些单克隆抗体可用杂交瘤及时制备。本发明的抗体包括可以阻抑STC2功能的抗体，也可以是不影响人STC2功能的抗体。每ー类抗体都可以通过对人STC2基因产物的片段或功能域致免疫而产生，而人STC2基因产物及其片段可以用重组方法产生或用多肽合成仪进行合成。与非修饰形式的STC2基因产物结合的抗体，可以利用在原核细胞例如E. coli中产生的基因产物来免疫动物而得到。与翻译后修饰形式如糖基化或磷酸化STC2蛋白或多肽结合的抗体，可以利用在真核细胞如酵母或昆虫细胞中产生的基因产物来免疫动物而得到。在本发明中，所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其他衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。在本发明的一方面，提供用于制备用RT-PCR或实时定量PCR诊断肝癌产品的ー对特异扩增STC2基因的引物，所述引物的上游引物序列具有如SEQ ID NO :1所示的序列或其互补序列，所述引物对的下游引物序列具有如SEQ ID NO :2所示的序列或其互补序列。在本发明的另一方面，提供了ー种STC2基因在制备治疗肝癌的药物中的应用。所述治疗肝癌的药物包括通过RNA干扰抑制STC2基因表达的双链核糖核酸，或用于抑制STC2蛋白活性的蛋白质。为了实现本发明中STC2基因作为制备肝癌治疗药物的靶点，本发明通过如下技术方案实现 I.化学合成双链核糖核酸分子，其序列特异性针对STC2基因序列，利用脂质体包裹递送至肝癌细胞内，干扰STC2基因的表达，CCK-8法测量肝癌细胞Huh-7，H印3B，MHCC-97H，MHCC-97L生长活性。本发明中实验结果证明特异性针对STC2基因的小核糖核酸分子能够抑制肝癌细胞体外的生长，说明STC2基因可用作制备肝癌治疗药物的靶基因。本发明中用于特异性干扰STC2基因的小核糖核酸序列设计原则如下(I)从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找“AA” ニ连序列，并记下其3’端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在45% -55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5’和3’端的非编码区(untranslatedregions, UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNA核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。(2)将潜在的序列和相应的基因组数据库(人，或者小鼠，大鼠等等)进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列，例如使用BLAST(www. ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/)。(3)选出合适的目标序列进行合成。通常ー个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列体外评估干扰STC2基因表达。2.体外评估干扰STC2基因表达，肝癌细胞克隆形成能力、软琼脂克隆形成能力、细胞周期、细胞凋亡等细胞生物学特性的改变。3.利用各种载体,包括DAN载体、腺病毒、腺相关病毒载体来干扰STC2基因的表达，达到体内干扰STC2基因的效果，检测它们对裸鼠皮下移植瘤、肝脏原位接种瘤的治疗效果，从而实现抑制肝癌细胞体内増殖的目的。4.获得能够特异性抑制STC2基因激酶活性的多肽、单克隆抗体，达到抑制STC2活性的目的，从而实现抑制肝癌细胞体内増殖的目的。在本发明中，可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对STC2蛋白特异的抗体。例如，将提纯的人STC2基因产物或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗体。同样，表达人STC2蛋白或它的抗原的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。根据本发明制备的抗体可以是单克隆抗体，这些单克隆抗体可用杂交瘤及时制备。本发明的抗体包括可以阻抑STC2功能的抗体，也可以是不影响人STC2功能的抗体。每ー类抗体都可以通过对人STC2基因产物的片段或功能域致免疫而产生，而人STC2基因产物及其片段可以用重组方法产生或用多肽合成仪进行合成。与非修饰形式的STC2基因产物结合的抗体，可以利用在原核细胞例如E. coli中产生的基因产物来免疫动物而得到。与翻译后修饰形式如糖基化或磷酸化STC2蛋白或多肽结合的抗体，可以利用在真核细胞如酵母或昆虫细胞中产生的基因产物来免疫动物而得到。5.获得能够特异性抑制STC2基因激酶活性的化合物，达到抑制STC2激酶活性的目的，从而现实抑制肝癌细胞増殖的目的。在本发明的另一方面，提供用于制备治疗肝癌药物的STC2基因的两对siRNA，分别为siRNA-1548与siRNA-1779。其中，siRNA-1548的正义链具有如SEQ ID NO. 7所示序列，siRNA-1548的反义链具有如SEQ ID NO. 8所示序列。siRNA-1779的正义链具有如SEQID NO. 9所示序列，siRNA-1779的反义链具有如SEQ ID NO. 10所示序列。 本发明实验证实STC2基因在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织，并且通过STC2基因序列特异性siRNA干扰可以显著抑制肝癌细胞的生长，因此STC2基因及其表达产物可作为诊断肝癌的标志物和用于肝癌治疗的药物靶点，使肝癌诊断更加准确、快速，并提供了新的肝癌治疗的基因靶点。总之，本发明STC2基因为防治肝癌提供了新的治疗靶点和有效新药。下面结合附图与
对本发明作进ー步详细的说明图I为实施例I中RT-PCR验证STC2基因在40例肝癌病人癌组织和癌旁组织中的表达情况示意图，在图I中，“N”指癌旁组织，“C”指肝癌组织；结果显示23例(57. 5% )病例癌组织中STC2基因表达量高于相应癌旁组织中。图2为实施例2中实时定量PCR检测STC2基因在人肝癌组织和癌旁组织中的表达情况示意图，癌组织中STC2基因表达量显著高于癌旁组织中(P <0.001)；图3为实施例5中在肝癌细胞YY-8103中干扰STC2基因表达，检测细胞生长曲线示意图，结果显示序列特异性针对STC2基因的两条siRNAs能够有效沉默STC2基因的mRNA水平(图3A)，同时肝癌细胞YY-8103生长受到显著地抑制(图3B);图4为实施例5中在肝癌细胞Focus中干扰STC2基因表达，检测细胞生长曲线示意图；结果显示序列特异性针对STC2基因的两条siRNAs能够有效沉默STC2基因的mRNA水平(见图4A)，同时肝癌细胞Focus生长受到显著地抑制(见图4B)；图5为实施例6中在肝癌细胞Focus中干扰STC2基因表达，分析细胞克隆形成能カ结果示意图；其中，图5A表示定量PCR检测shRNA干扰STC2基因沉默效果；图58是细胞克隆形成的照片；图5C表示克隆计数。图6为实施例7中STC2基因过表达对肝癌细胞PLC克隆形成能力的影响，其中，图6A是PCR检测STC2基因在肝癌细胞PLC过表达情况；图6B是细胞克隆形成的照片；图6C是克隆计数。图7为实施例8中定量PCR检测STC2基因在正常成人各组织的表达情況。

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人,分子克隆实验室手册· (NewYork ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例IRT-PCR实验检测STC2基因在肝癌组织中的表达情况逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)实验检查STC2基因在肝癌组织中的表达情况。RT-PCR 是指将逆转录(Reverse Transcription ；RT)反应和 PCR(Polymerase ChainReaction)反应组合在一起的方法。RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了ー种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及SI核酸酶分析在内的RNA分析技木，更灵敏，更易于操作。RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo (dT)或基因特异性的引物起始。RT-PCR可以 一歩法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每ー步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。I、组织分离实验用组织来源于原发性肝癌的手术病人。手术切除的肝脏ー经离体，迅速切取病灶及周围5公分外癌旁组织，放入液氮中(_80°C )保存。癌和癌旁的诊断均以病理诊断为最终依据。2、总核糖核酸(RNA)的抽提试剂盒抽提总核糖核酸(RNA)采用TRIZOL(Invitrogen),该试剂是基于酸性酹ー步抽提法生产的。TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。用于抽提总核糖核酸(RNA)所用的器皿和水均进行核糖核酸酶灭活处理，以保证实验中无核糖核酸酶的环境。3、核糖核酸(RNA)抽提步骤RNA提取的一般步骤是破碎组织一分离RNA —沉淀RNA —洗涤RNA —融解RNA —保存RNA。破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。分离RNA—半用酚、氯仿等有机溶剤，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA—般分布于上层，与蛋白层分开。沉淀RNA—般用こ醇、3Μ NaAc (pH-5. 2)或异丙醇。洗涤RNA使用70%こ醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干こ醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。融解RNA一般使用TE。保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品(如胰脏、肝脏)中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存ー个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70°C。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA :加入NaAc 至 O. 3M, 12，OOOXg 离心 5 分钟。
4、cDNA 的合成(I)冰浴离心管里面加入模板RNA 4yL(lyg/yL)，随机引物2yL(20pmol/μ L),去离子水5 μ L,混匀，离心3-5秒；(2)70°C水浴5分钟，冰浴30秒(此处是为了使引物和模板正确配对);(3)加入5 X M-MLV逆转录酶第一链缓冲液4 μ L (200U/ μ I), RNase抑制剂I μ L (Ribonuclease Inhibitor, 40U/ μ I，TaKaRa)，dNTP 2 μ L (2. 5mM, TaKaRa)(这些应该先配好，然后分再装到每一管)，混匀；(4) 37°C水浴5分钟，加入I μ L M-MLV RT反转录酶(200U/ μ I)，混匀；
(5)37°C水浴I小时(此步是反转录过程)；(6) 700C，10分钟结束反应(此处是灭活酶活性，避免对后续实验产生干扰)，产物置冰上进行下一歩PCR实验，余下的-70°C保存。 5、RT-PCR的弓丨物设计及扩增理想的引物对只同目的序列两侧的単一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。设计理想的引物都有以下共同的特点典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。选择GC含量为40%到60%或GC含量反映模板GC含量的引物。设计5’端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。避免引物对3’末端存在互补序列，这会形成引物ニ聚体，抑制扩增。避免3’末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。避免3’末端的错误配对。3’端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。避免存在可能会产生内部ニ级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。因此，本实施例中设计的引物具体如下STC2(F) :5，-ATGCTACCTCAAGCACGACC-3’ (SEQ ID NO 1)；STC2 (R) :5，-TCTGCTCACACTGAACCTGC-3，(SEQ ID NO 2)；β -actin(F) :5，-CATCCTGCGTCTGGACCT-3，(SEQ ID NO :3)；β -actin(R) :5，-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3J (SEQ ID NO :4)。以β-actin作为内对照，反应混合物中各成分为β-actin(F)、β -actin(R) >STC2(F)、STC2 (R) UOXPCR buffer、MgcI2、dNTP、Taq DNA 聚合酶(TaKaRa Taq ) cDNA 模板分别为0· 2,0. 2,0. 4,0. 4,1. 0,1. 0,0. 2,0. I和5 μ LcDNA模板，最后补充ddH20使反应体系为10 μしPCR的反应条件如下94°C，5分钟预变性；94°C，30秒变性；55°C，30秒退火；720C，30秒延伸；35个循环，电泳检测PCR扩增产物。6、实验结果显示，STC2基因在肝癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织中的表达水平(见图I)，在40例肝癌病例中，23例癌组织中STC2基因的表达量高于癌旁组织，占57. 5%的比例。在图I中，“N”指癌旁组织，“C”指肝癌组织。7、根据上述实验结果，可通过RT-PCR诊断肝癌设计STC2基因的PCR引物，检测肿瘤组织中STC2基因RNA的含量，RNA含量高则说明患肝癌的可能高，反之则低。实施例2实时定量PCR实验采用相对定量法检测STC2基因在肝癌样本中的表达差异(Thermal CyclerDice RealTime System TP800, Takara ； SYBR Premix Ex Taq , Takar a)。突光定量PCR(real-timePCR)反应体系如下总体积 20μ L，SYBR Premix Ex Taq 10yL，上下游引物(10 μ mol/L)各0· 4 μ L，cDNA I μ L，ddH20 8. 2 μ L,混匀试剂，离心后放入PCR仪中进行扩增反应。反应条件为95°C变性5秒，68°C退火延伸30秒，40循环。仪器使用按厂家的说明操作。本实施例中设计的引物具体如下STC2所用引物与半定量RT-PCR所用STC2引物一致，上游引物为5’-ATGCTACCTCAAGCACGACC-3’(SEQ ID NO :1);下游引物为5’ -TCTGCTCACACTGAACCTGC-3’ (SEQ ID NO :2)。管家基因β-actin作为内參，其上游引物为AATCGTGCGTGACATTAAG GAG(SEQ IDNO :5)，下游引物ACTGTGTTGGC GTACAGGTCTT (SEQ ID NO :6)。实时定量PCR检测表明，STC2基因在肝癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织中的表达水平，经t检验，P < O. 001 (见图2)。该实验结果表明，可通过实时定量PCR诊断肝癌设计STC2基因的PCR引物，检测肿瘤组织中STC2基因RNA的含量，RNA含量高则说明患肝癌的可能性高，反之则低。实施例3原位杂交用STC2基因探针，与肿瘤切片进行原位杂交，阳性杂交信号越強，患肝癌的可能性越高。实验步骤为将肝脏肿瘤组织取材后OCT包埋、液氮速冻，恒冷冰冻切片，该冰冻切片进ー步用于原位杂交。实施步骤如下(I)冰冻切片与杂交前预处理I).将样品从_80°C取出，用OCT包埋，在-23°C (切片机腔体温度)平衡至少30min。将包埋好的样品固定在样品头上，切ΙΟμπι厚的连续组织切片，平铺于涂有多聚赖氨酸(lmg/ml)的玻片上(玻片预先经180°C干烤6小吋)，保存于-70°C冰柜备用。2).冰冻切片经室温干燥IOmin后，在4%的多聚甲醛-PBS (pH7. 4)固定lOmin。3).活跃的 DEPC-PBS (未高压的 O. I % DEPC-I X PBS 溶液)洗 2 次，每次 5min。4).在O. 2M的盐酸作用中作用IOmin后，重复步骤4)。5).在切片上滴加蛋白酶1((0.14 8/1111)，37で孵育151^11，重复步骤4)。6).经O. IM TEA (三こ醇胺)作用5min后，再在新配制的O. 25% ΑΑ/0. IM TEA (こ酸酐/三こ醇胺，pH8. O)中こ酰化IOmin (在大多数实验中，步骤4，5，6省略)。7). 5XSSC 中平衡 15min。(2)杂交I).在脱水后的玻片上滴加预杂交液(约100 μ L/玻片)，置于放有湿盒液(50%甲酰胺 ν/ν ;0. 3Μ NaCl ；lmM EDTA ;IOmM Tris-Cl，pH8. O)的湿盒中，55 58°C下的烘箱中预杂交2h。2).甩掉预杂交液，地高辛标记的反义或正义cRNA探针(浓度l-2ng/l·! L)经70°C变性10分钟，置冰上lmin，玻片上滴加预杂交液(约60 μ L/玻片)，覆盖parafilm膜，放湿盒中在48 58°C下杂交18-30h。(3)杂交后处理I).取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉杂交液，用52°C预热的5XSSC洗30mino2).在无 DNA 的 RNA 酶 Α(20μ g/ml)溶液中 37°C下孵育 30min。3).分别依次用 52°C预热的 2 X SSC, IXSSC O. I X SSC 洗 2 次，每次 30min。(4)杂交信号检测I).在缓冲液 A(0. IM Tris-HCl pH7. 5,0. 15Μ NaCl)中平衡 5min。2).在玻片上滴加碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(I 500 I : 2000稀释于含O. 5%阻断液的缓冲液A中)，室温反应2h。3).用缓冲液A洗2次，毎次15min。
4).在缓冲液 B (O. IM Tris-HCl ；0. IM NaCl ；0. 05M MgCl2, ρΗ9· 5)中平衡 5min。5).硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴_4_氯_3_吲哚氧磷酸盐(BCIP)溶于缓冲液B中，每ml缓冲液B含有4. 5 μ L NBT和3. 5 μ L BCIP0在玻片上滴加混合染液在湿盒中显色过夜。6).充分显色后，用 EDTA(lmM EDTA, ρΗ8. O)洗 15min 终止反应。7).在95%こ醇中洗Ih以除去非特异的背景。8).用蒸馏水洗15min除去可能存在的结晶体。9).脱水、透明，用中性树胶封片。10).充分干燥后在显微镜下观察、照相。实施例4免疫检测I.抗原蛋白获得(I)利用基因工程表达可从Genebank数据库中获得人STC2基因的cDNA序列，通过PCR扩增获得编码框，插入原核生物或真核生物表达载体中，表达STC2蛋白，并按基因工程表达产物的纯化体系纯化蛋白。2、抗体制备可采用以下几种方法制备抗体(I)细胞融合法用上述制备的STC2蛋白免疫动物(包括兔子、山羊等)，获得脾脏细胞，再与骨髄瘤细胞融合，并按常规单克隆抗体制备技术制备单克隆抗体。(2)利用噬菌体表面展示库，克隆免疫动物的脾脏IgG可变区并表达成基因工程单克隆抗体。(3)利用纯化的蛋白免疫动物，制备多抗血清。3、检测(I)用制备的抗体(多抗或单抗)，用组织化学方法进行肝癌的病理检测，阳性信号为肝癌。(2)取患者血清，用ELISA方法检测，阳性反应为肝癌可疑病人。(3)将STC2抗体作为蛋白质芯片的探针之一，用于多种肿瘤诊断。实施例5STC2基因的小干扰核糖核酸(SiRNA)体外化学合成小干扰核糖核酸(SiRNA)具有快速、简单和特异性强等特点，在抗肿瘤治疗等方面有广泛的应用前景。针对STC2基因mRNA设计合成两对siRNA序列，分别是siRNA-1548和siRNA_1779，序列分别如下siRNA-1548 :正义链，5’-GGCUUACAUGGGAUUUGCAUGACdTdT-3’ (SEQ ID NO :7);反义链，5’-AAGUCAUGCAAAUCCCAUGUAAGdCdC-3’ (SEQ ID NO :8)；siRNA-1779 :正义链，5’-GUGGAGAUGAUCCAUUUCAdTdT-3’ (SEQ ID NO :9);反义链，5’-UGAAAUGGAUCAUCUCCACdTdT-3’ (SEQ ID NO :10)。另外设置无关序列作为阴性对照SiRNA，其序列如下正义链，5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’(SEQ ID NO :11)；反义链，5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’(SEQ ID NO :12)。在96孔板中每孔接种3X IO3肝癌细胞系YY-8103和Focus细胞(均源自中国科学院细胞库)，待细胞密度达到40%左右吋，利用脂质体(Lipofectamine 2000)转染试剂分别将上述3种siRNA按终浓度50nmol/L转染进YY-8103和Focus细胞中，4h后换成含10%胎牛血清的DMEM。以24h为I个检测单位培养7d，每天检测I次该细胞密度。每孔待 测细胞液中加10 μ L CCK-8，37°C孵育lh。利用酶标仪在450nm波长下检测其吸光度以代表细胞存活能力，绘制生长曲线(见图3和图4)。如图3和图4所示，实验结果表明特异性干扰STC2基因表达的小干扰核糖核酸(siRNA) siRNA-1548与siRNA-1779能够有效沉默STC2基因的mRNA水平，同时能够抑制肝癌细胞系YY-8103和Focus的生长，肝癌细胞的存活率明显低于对照组的细胞，说明人STC2基因的表达下调能在一定程度上抑制肝癌细胞生长。实施例6shRNAs干扰STC2基因抑制肝癌细胞生长将构建好的质粒pSUPER质粒转染肝癌细胞后48小时后抽提细胞株RNA，定量PCR鉴定RNA干扰的效果，确认质粒能够发挥RNAi效应后，与pcDNA3. I (质粒质量比5 : I)共转染，将细胞重新接种于IOcm大盘中培养，同时培养液中加入新霉素G418进行筛选培养4 6周，去除培养液，IXPBS漂洗两遍后结晶紫染色后拍照计数。结果如图5所示，定量PCR检测shRNAs有效沉默STC2基因的表达(见图5A)，并且显著抑制细胞克隆形成能力(见图5B，图5C)。实施例7STC2基因过量表达促进肝癌细胞的生长I.构建pcDNA3. 1B-STC2质粒，PCR扩增相应片段，酶切后连接到空质粒pcDNA3. IB上，测序。2.细胞克隆形成分析I)转染采用 LipofectamineTM2000 转染细胞；2) 35mm培养皿培养24小时后消化计数，接种5 10 X IO4细胞至IOOmm培养皿，继续培养24小时后，再加G418至终浓度600-1000mg/ml (根据不同细胞的敏感度而不同)
培养2 3星期直至有克隆形成，期间每隔三天换液；3)吸去培养皿内的培液，IXPBS洗两次，用结晶紫染色液染色2-4小时；4)按照相同的标准计数每个培养皿上的细胞克隆数。实验结果如图6所示，定量PCR检测STC2基因在质粒pcDNA3. 1B-STC2转染PLC/PRF/5细胞中的过量表达(见图6A)，同时克隆形成形成显示STC2基因显著促进细胞克隆形成能力(见图6B，图6C)。实施例8PCR实验检测STC2基因在正常人体组织中的表达情况用常规PCR的方法检测STC2基因在正常成人组织中的表达。实验结果显示STC2在胚胎肝脏中表达，在成熟肝脏中不表达(见图7)，进ー步表明STC2基因的表达可用于准确诊断肝癌。序列表〈110〉上海人类基因组研究中心<120>STC2基因及其表达产物的应用<130>CPC-NP-11-15118<160>12 <170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_feature〈223〉引物<400>1atgctacctc aagcacgacc 20<210>2<211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_feature〈223〉引物<400>2tctgctcaca ctgaacctgc 20<210>3<211>18<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_feature〈223〉引物<400>3catcctgcgt ctggacct18<210>4<211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉
<221>misc_feature〈223〉引物<400>4gtacttgcgc tcaggaggag20<210>5<211>22<212>DNA
〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_feature〈223〉引物〈400>5aatcgtgcgt gacattaagg ag 22<210>6<211>22<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_feature〈223〉引物<400>6actgtgttgg cgtacaggtc tt 22<210>7<211>25<212>RNA〈213〉人工序列<220><221>misc_RNA〈222〉(I) ·· (25)<223>siRNA<400>7ggcuuacaug ggauuugcau gactt 25<210>8<211>25<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_RNA〈222〉(I) ·· (25)
<223>siRNA<400>8aagucaugca aaucccaugu aagcc 25<210>9<211>21<212>RNA〈213〉人工序列 〈220〉<221>misc_RNA〈222〉(I) ·· (21)<223>siRNA<400>9guggagauga uccauuucat t 21<210>10<211>21<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_RNA〈222〉(I) ·· (21)<223>siRNA〈400〉10ugaaauggau caucuccact t 21<210>11<211>21<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_RNA〈222〉(I) ·· (21)<223>siRNA〈400〉11uucuccgaac gugucacgut t 21<210>12<211>21<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_RNA
〈222〉(I) ·· (21)<223>siRNA
<400>12acgugacacg uucggagaat t 2

本发明公开了一种STC2基因及其表达产物的应用，用于制备肝癌诊断及治疗的产品。本发明的STC2基因及其表达产物，可作为诊断肝癌的特异性标志基因，使肝癌诊断更加准确、快速；本发明的STC2基因及其表达产物可作为制备治疗肝癌药物的靶基因，提供新的肝癌治疗途径。