专利名称：：一种利用光能生产乙醇的微生物的制作方法技术领域：。具体涉及一种经过基因工程修饰后可通过光合作用高效生产乙醇的微生物，以及所述基因工程修饰微生物的方法和运用此基因工程微生物制备乙醇的方法。：石化能源为国民经济与社会发展的重要物质基础，但石化能源具有稀缺性和不可再生性，随着时间的推移，其价格必将因储量的减少和开采量的下降而上涨。此外，电力行业高度依赖煤炭资源，是造成威胁着电力供应的“煤炭矛盾”长期存在的根本原因之一。因此，可再生能源具有长远的发展潜力和广阔的市场前景。可再生能源产业的发展必然对相关产业的发展起到带动作用，这将使我国的国民经济结构更加合理。目前的液体生物燃料主要有生物燃料乙醇和生物柴油。然而，生物燃料的快速发展面临着粮食安全和土地淡水资源紧缺问题。现有技术通过燃料乙醇产业作为替代能源，但是，随着燃料乙醇产量增加，粮食供给短缺和价格上涨导致以粮食为原料的生物能源产业不能持续性发展。近几年大力发展的非粮燃料乙醇和生物质发电产业同样受到客观条件的制约，难以满足大规模替代化石燃料的规模和成本要求。以木薯、甜高粱、纤维素为原料的燃料乙醇产业从本质上说是以种植业为基础的，需要大规模投入可耕地、淡水、化肥以获得较高产量，而这些资源均为稀缺资源，用于替代化石能源将对整体资源环境造成巨大压力。因此，迫切需要开发不占用可耕地、淡水、化肥资源的新型生物能源技术，为可再生能源产业发展提供具备现实可行性的手段，切实有效减少二氧化碳排放，替代化石能源使用，促进基于化石能源的传统工业体系向基于可再生能源的绿色工业体系转化。对微生物进行基因工程改造来生产能源是能源产业中的一个发展方向。但现有技术中，工业上主要是利用具有乙醇代谢途径的异养微生物，例如酵母和大肠杆菌等。蓝藻是一种自养微生物，是目前地球上最广泛的生物体。蓝藻是单细胞生物，没有细胞核，但细胞中央含有核物质，通常呈颗粒状或网状，染色质和色素均匀的分布在细胞质中。蓝藻的细胞质中都有内膜系统，可以进行光合作用，产生自己所需要的物质，即可以自养。但是，自然存在的光合细菌蓝藻通常不能利用阳光和二氧化碳合成乙醇，仅在避光和无氧条件下通过发酵产生少量乙醇。本领域已知生产乙醇的微生物(例如大肠杆菌，酵母菌，运动发酵单细胞菌等)中存在乙醇生产的代谢途径。已知的乙醇生产代谢途径是从糖酵解途径的丙酮酸经过乙醛再到末端代谢产物乙醇，其中丙酮酸到乙醛的反应过程由丙酮酸脱羧酶(pyruvatedecarboxylase,PDC)催化，乙醒到乙醇的反应过程由乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase,ADH)催化控制。蓝藻的基因组中不存在丙酮酸脱羧酶基因，因而不具有产生乙醇的能力。本发明提供了一种利用基因工程蓝藻生产乙醇的方法，经过对野生蓝藻的改造，从而使得蓝藻能够直接利用太阳光和二氧化碳生产乙醇。
本发明以蓝藻为宿主，将外源乙醇代谢途径的丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因导入蓝藻，形成具有稳定遗传性状和较高乙醇产率的基因工程菌株，使得改造的蓝藻菌株能够利用阳光、水和二氧化碳生产乙醇。本发明还提供了基因工程蓝藻通过光合作用利用阳光、水和二氧化碳制备乙醇的方法。本发明提供了一种利用光合作用生产乙醇的基因工程蓝藻，其含有整合到染色体上的外源丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因。外源丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因在蓝藻细胞内编码具有丙酮酸脱羧酶活性和乙醇脱氢酶活性的蛋白。本发明使用的宿主是蓝藻，其可以是集胞藻(Synechocystis)、隐球藻属(Aphanocaps)、鱼腥藻属(Anobaena)、念珠藻属(Nostoc)、颤藻属(Oscillatoria)、聚球藻属(Synechococcus)、球藻属(Gloeocapsa)、阿格藻属(Agmmenellumm)、双歧藻属(Scytonema)或鞭枝藻属(Mastigocladus)。本发明的蓝藻优选为集胞藻(Synechocystissp.)。在本发明的一个方面，采用的宿主是集胞藻PCC6803。本发明的基因工程蓝藻含有整合到染色体上的编码丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的核酸。丙酮酸脱羧酶(pyruvatedecarboxylase,PDC)广泛存在于豆类植物、麻黄等植物、酿酒酵母属(Saccharomycesspecies)、曲霉属等真菌中，另外运动单胞菌(Zymomonasmobilis)、醋杆菌属(Acetobacterspecies)中也都含有丙酮酸脱羧酶。不同来源的丙酮酸脱羧酶，其编码序列和活性有所不同。已经对各种来源的丙酮酸脱羧酶进行了测序和活性研究，发现不同来源的丙酮酸脱羧酶的序列有所区别，但也具有很多保守的区域和活性位点。其中，如Genebank报道的，运动单胞菌的丙酮酸脱羧酶具有如SEQIDNO.1的氨基酸序列，其基因pdc具有如SEQIDNO.2的核酸序列。不同来源的丙酮酸脱羧酶的序列有所区别，但都具有对应于SEQIDNO.1的氨基酸序列，其中存在保守序列和活性位点。乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase,ADH)大量存在于人和动物肝脏、植物及微生物细胞之中，是一种含锌金属酶，具有广泛的底物特异性，其分子由两个亚基组成，其中一个位于酶的活性中心，另一个起稳定四级结构的作用。乙醇脱氢酶够以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(MD)为辅酶，催化伯醇和醛之间的可逆反应CH3CH20H+NAD+—CH3CH0+NADH+H+。在人和哺乳动物体内，乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶(ALDH)构成了乙醇脱氢酶系，参与体内乙醇代谢。酵母和细菌(乳酸菌，以及某些条件下的大肠杆菌除外)不将葡萄糖发酵为乳酸，而是将葡萄糖发酵为乙醇和二氧化碳。总反应式为Glucose+2ADP+2Pi—2ethanol+2C02+2ATP+2H20。在酵母和许多细菌中，乙醇脱氢酶在发酵起着重要作用从糖酵解产生的丙酮酸转化为乙醛和二氧化碳，随后乙醛在ADHI的作用下转化为乙醇。后一步的目的是重新产生NAD+，于是糖酵解的能量生成得以继续。不同来源的乙醇脱氢酶，其编码序列和活性有所不同。已经对各种来源的乙醇脱氢酶进行了测序和活性研究，发现不同来源的乙醇脱氢酶的序列和活性有所区别。其中，如Genebank报道的，聚球藻的其中一种乙醇脱氢酶ADHB具有如SEQIDNO.3的氨基酸序列，其基因adhB具有如SEQIDNO.4的核酸序列。不同来源的乙醇脱氢酶的序列有所区别，但可具有对应于SEQIDNO.3的氨基酸序列，其中存在保守序列和活性位点。根据生物学理论知识，生物的蛋白的氨基酸序列会发生变异，所述蛋白的变异通常是由编码该蛋白的基因的突变造成基因的突变可以是自发。现代基因工程技术令有目的的点突变变成可能。点突变法可经由设计好的寡核苷酸，在任何一个基因片段上对某个核酸或多个核酸进行设计好的突变，例如通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，成为基因研究工作或产业开发中一种非常有用的手段。氨基酸蛋白质是生物体内重要的活性分子，例如催化各种生理生化反应的酶。氨基酸是蛋白质的基本成分。氨基酸在结构上的差别受侧链基团R的影响。通常根据R基团的化学结构或性质可将20种氨基酸分为非极性氨基酸和极性氨基酸。非极性氨基酸又称疏水氨基酸，包括丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(He)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、蛋氨酸(Met)。本发明提供了一种利用光合作用生产乙醇的基因工程蓝藻，其含有整合到染色体上的外源基因，所述外源基因为丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因，其中所述丙酮酸脱羧酶基因编码的丙酮酸脱羧酶具有对应于SEQIDNO.1的氨基酸序列，并且其中自N端第290位的苏氨酸Thr具有突变，以及所述乙醇脱氢酶基因编码的乙醇脱氢酶具有对应于SEQIDNO.3的氨基酸序列。在本发明的一个方面，本发明的基因工程蓝藻染色体整合的丙酮酸脱羧酶基因编码的丙酮酸脱羧酶具有(I)对应于SEQIDNO.1的氨基酸序列，并且其中自N端第290位的苏氨酸Thr具有突变，或(2)在上述氨基酸序列中还引入了一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位后所得的氨基酸序列，并具有丙酮酸脱羧酶的活性。在本发明的一个方面，本发明的基因工程蓝藻染色体整合的乙醇脱氢酶基因编码的乙醇脱氢酶具有(I)对应于SEQIDNO.3的氨基酸序列，或(2)在上述氨基酸序列中还引入了一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位后所得的氨基酸序列，并具有丙酮酸脱羧酶的活性。在本发明的一个方面，在上述本发明的基因工程蓝藻中表达的丙酮酸脱羧酶中第290位的苏氨酸Thr突变为酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)。在本发明的一个方面，上述第290位的苏氨酸Thr突变为酪氨酸(Tyr)。在本发明的一个方面，上述第290位的苏氨酸Thr突变为天冬酰胺(Asn)。在本发明的一个方面，上述第290位的苏氨酸Thr突变为甘氨酸(Gly)。在本发明的一个方面，上述第290位的苏氨酸Thr突变为丝氨酸(Ser)。氨基酸是由多核苷酸编码的。多核苷酸中的信使RNA链上决定一个氨基酸的相邻的三个碱基叫做一个“密码子”，亦称三联体密码。具体的，其中几个氨基酸的密码子如下苏氨酸(Thr):ACU，ACC,ACA,ACG；半胱氨酸(Cys)UGU,UGC；甘氨酸(Gly)GGU,GGC,GGA,GGG；丝氨酸(Ser):UCU，UCC,UCA，UCG；天门冬酰胺(Asn)AAU,AAC；谷氨酰胺(Gln):Ckk，CAG。在本发明的一个方面，所述基因工程蓝藻带有的所述丙酮酸脱羧酶基因具有SEQIDNO.2的碱基序列的多核苷酸，并且其中编码对应于SEQIDNO.1氨基酸序列中自N端第290位的酪氨酸(Tyr)的碱基序列由TAC改变为编码苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)的碱基序列。在本发明的一个方面，其中所述编码对应于SEQIDNO.1氨基酸序列中自N端第290位的苏氨酸的碱基序列由TAC替换为ACC、ACA、ACT或ACG，优选替换为ACC。在本发明的又一个方面，所述基因工程蓝藻带有的所述丙酮酸脱羧酶基因具有与上述碱基序列或其互补碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。在本发明的一个方面，基因工程蓝藻带有的所述外源乙醇脱氢酶基因具有SEQIDNO.4的碱基序列的多核苷酸，或是与SEQIDNO.4的碱基序列或其互补碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。在本发明的一个方面，本发明的基因工程蓝藻中所述丙酮酸脱羧酶基因选自来源于运动发酵单胞菌、酵母、蓝藻和大肠杆菌的丙酮酸脱羧酶基因，优选来源于运动发酵单胞菌。在本发明的一个方面，本发明的基因工程蓝藻中所述乙醇脱氢酶基因选自来源于运动发酵单胞菌、酵母、蓝藻、嗜热醋酸菌、绿屈挠菌、聚球藻的乙醇脱氢酶基因，优选来源于聚球藻。在本发明的一个方面，本发明的基因工程蓝藻中含有整合到染色体上的外源丙酮酸脱羧酶基因和外源乙醇脱氢酶基因，所述外源丙酮酸脱羧酶基因选自来源于运动发酵单胞菌，并且所述外源乙醇脱氢酶来源于聚球藻。在本发明的一个方面，基因工程蓝藻带有的所述外源乙醇脱氢酶基因具有SEQIDNO.4的碱基序列的多核苷酸，或是与SEQIDNO.4的碱基序列或其互补碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。在本发明的一个方面，基因工程蓝藻的染色体上还整合有表达所述丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶所需的启动子，所述启动子与丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶可操作地连接。本发明对蓝藻进行的基因修饰是通过引入外源基因实现的。引入外源基因是通过制备构建体和转化到蓝藻细胞中，并进一步整合到蓝藻的染色体。制备的构建体包含至少一种调控序列，优选的调控序列是启动子。启动子是基因调控中普遍存在的顺式作用元件，是RNA聚合酶能够识别并与之结合而起始基因转录的一段DNA序列，通常位于基因5’端上游。它能决定转录的方向和效率，以及RNA聚合酶类型，并引导RNA聚合酶与模板的正确结合。启动子是基因表达调控的重要元件，它与RNA聚合酶及其他反式作用因子的相互作用是通过基因转录实施基因调控转录的关键。在本发明中，对蓝藻进行的基因修饰包括导入表达丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶所需启动子，并整合到蓝藻染色体上。所述启动子与丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶可操作地连接。多种启动子可用于本发明的构建体，可根据所需结果来选择启动子，并且可包括用于在蓝藻中表达的组成型启动子、细胞特异性启动子、诱导型启动子或其他启动子。在本发明的一个方面，本发明使用的所述启动子为来源于藻类的PrbC(ribUl0Se-l，5-bisphosphatecarboxylase,rbc)启动子、表达基因光诱导启动子、硝酸盐诱导启动子或温度诱导启动子。启动子Prbc是蓝细菌体内的强启动子，具备在蓝细菌体内高效表达基因的能力，被成功应用在多种蓝细菌菌株中。另一种光诱导启动子PsbA位于蓝藻光系统蛋白psbA上游。光诱导启动子在蓝藻光合作用和细胞代谢的研究中作为表达外源基因的强启动子使用。硝酸盐启动子位于硝酸盐还原酶(nitratereductase,NR)上游。硝酸盐还原酶NR是一种诱导酶，硝酸盐对NR的活性有明显诱导作用，而铵则能抑制NR的表达，因此NR的启动子已经成为转基因研究中比较理想的可控性启动子。本领域的研究发现NR启动子来驱动外源基因表达，显示了其具有可诱导性和高效性表达的特点，在藻类基因工程研究中应用广泛。热诱导启动子PgroESL位于蓝藻热休克基因groESL上游。由于groESL启动子具高效性，人们一直试图利用其提高宿主细胞中外源基因的表达水平。优选的，本发明采用了Prbc启动子。在本发明的一个方面，本发明的基因工程蓝藻产生的乙醇由细胞中扩散到培养液中。本发明的基因工程蓝藻的培养液中，溶液中乙醇浓度达到O.lg/L，优选的，达到O.5g/L，更优选的，达到1.5到5g/L。在本发明的一个方面，本发明的基因工程蓝藻保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2011年12月02日，其保藏号为CGMCCNo.5533。在本发明的一个方面，本发明提供了制备上述基因工程蓝藻的方法，其包括将外源丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因，以及表达所述外源丙酮酸脱羧酶和/或乙醇脱氢酶所需启动子导入蓝藻，并整合到蓝藻染色体上。本发明的制备基因工程藻类包括以下主要步骤。通过PCT或合成的方法获得目的基因或目的核苷酸片段，包外源丙酮酸脱羧酶基因、启动子和/或抗性标记基因等核苷酸片段。将带有目的基因的DNA片段连接到能够独立复制并具有选择标记的载体上，如质粒、噬菌体和病毒等，以形成重组DNA分子。DNA片断与载体的连接方式主要有同聚末端连接、粘性末端连接、平齐末端连接及人工接头分子连接。重组DNA必须进入宿主细胞DNA中，才能得到扩增和表达。根据载体的性质不同，可采用转染、转化、转导等方式，将重组DNA分子导入宿主细胞内，并使其大量繁殖。应用于蓝藻遗传转化的供体DNA大体可分为三类第一类是直接利用未修饰的外源质粒，可将外源DNA导入蓝藻。第二类是利用自身染色体或基因组，通过同源重组作为插入突变的有效方法。第三类是使用穿梭载体。穿梭质粒可以含有蓝藻质粒复制起点，能够以复制子形式独立存在。穿梭质粒还可以带有与蓝藻基因组相同的序列，从而在进入蓝藻后与发生染色体同源重组，从而稳定存在和表达。在本发明的一个方面，本发明提供了通过培养上述基因工程蓝藻制备乙醇的方法。经过上述基因工程的改造，本发明的蓝藻的细胞内能够有效地表达具备了催化丙酮酸到乙醛的反应活性的丙酮酸脱羧酶，从而能够利用阳光、水和二氧化碳生产乙醇。本发明的基因工程蓝藻在含有碳源(例如二氧化碳)的培养液中，在光照条件下进行繁殖和光反应，产生乙醇，然后进行分离、收集和提纯，例如采取传统蒸馏和气提等工艺。本发明中的外源基因是通过载体导入蓝藻的，所述载体包括(a)核酸，其包含丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因，其中所述丙酮酸脱羧酶基因编码的丙酮酸脱羧酶具有(I)对应于SEQIDNOI的氨基酸序列，并且其中自N端第290位的苏氨酸Thr具有突变，或(2)在上述氨基酸序列中还引入了一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位后所得的氨基酸序列，并具有丙酮酸脱羧酶的活性；以及，其中所述乙醇脱氢酶基因编码的乙醇脱氢酶具有(I)对应于SEQIDNO3的氨基酸序列；或(2)在上述氨基酸序列中引入了一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位后所得的氨基酸序列，并具有乙醇脱氢酶的活性。和(b)启动子，所述启动子与所述丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶基因可操作地连接。在本发明的一个方面，所述第290位的苏氨酸Thr可以突变为酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨·酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)，优选的，突变为酪氨酸(Tyr)。在本发明的一个方面，所述载体带有的其中启动子为来源于蓝藻的Prbc启动子、光诱导启动子、硝酸盐诱导启动子或温度诱导启动子，优选为Prbc启动子。本发明提供的一种具有上述特征的载体，此载体具有抗生素标记(优选抗性基因Ω片段)，启动子(例如Prbc启动子)、具有290Tyr点突变的运动单胞菌丙酮酸脱羧酶pdc基因和乙醇脱氢酶基因adhB片段。其中突变的pdc基因是通过点突变技术获得的，将编码PDC的pdc基因上的TAC突变为ACC，从而将TOC的290位的酪氨酸Tyr置换为苏氨酸Thr。本发明提供的另一种具有上述特征的载体是用于转化蓝藻的穿梭质粒，此载体带有抗生素标记、启动子、具有290Tyr点突变的运动单胞菌丙酮酸脱羧酶pdc基因和乙醇脱氢酶基因adhB片段。在本发明的有一个方面，上述载体还包括蓝藻基因组片段，从而使得所述丙酮酸脱羧酶基因、乙醇脱氢酶基因和所述启动子在转换蓝藻后可重组到蓝藻的染色体上。本发明还提供了一种分离的蛋白，其具有丙酮酸脱羧酶活性。所述分离的蛋白具有(I)对应于SEQIDNO.1的氨基酸序列，并且其中自N端第290位的苏氨酸Thr具有突变，或(2)在上述氨基酸序列中还引入了一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位后所得的氨基酸序列，并具有丙酮酸脱羧酶的活性。在本发明的一个方面，在上述本发明的分离的蛋白中，所述第290位的苏氨酸Thr突变为酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)。在本发明的又一个方面，所述第290位的苏氨酸Thr突变为酪氨酸(Tyr)。在本发明的又一个方面，所述第290位的苏氨酸Thr突变为天冬酰胺(Asn)。在本发明的又一个方面，所述第290位的苏氨酸Thr突变为甘氨酸(Gly)。在本发明的又一个方面，所述第290位的苏氨酸Thr突变为丝氨酸(Ser)。本发明还提供了编码上述分离的蛋白的分离的核酸。所述核酸为(I)具有SEQIDNO.2的碱基序列的多核苷酸，并且其中编码对应于SEQIDNO.1氨基酸序列中自N端第290位的苏氨酸的碱基序列由TAC改变为编码酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)的碱基序列；或(2)与上述碱基序列或其互补碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。在本发明的一个方面，所述分离的核酸中编码对应于SEQIDNO.1氨基酸序列中自N端第290位的苏氨酸的碱基序列由TAC替换为ACC、ACA、ACT或ACG，优选替换为ACC。图1为构建本发明基因工程蓝藻的示意图。图2为构建本发明基因工程蓝藻的示意图。图3为本发明基因工程蓝藻在培养液中的生物量、乙醇含量和时间的关系图。具体实施例方式实施例1带有抗生素标记、启动子和运动单胞菌pdc基因的载体pXT117的获得采用商购的pET28b(Novagen,美国)做为构建的载体。rbc启动子(即Prbc)核酸序列是根据已报道的集胞藻属的序列信息(如Genebank的BA000022.2，X65960.1)合成，其序列如SEQIDNo.5所示。pdc基因的核酸序列是根据已报道的运动单胞菌的pdc基因的核酸序列(如Genebank的X59558.1)合成，其序列如SEQIDNo.2所示。为了克隆到pET28b以及后期的构建需要，合成时在Pdc基因序列的3’端增加SpeI位点，NotI位点。另外采用带有抗壮观霉素和抗链霉素的抗性基因的omegainterposon,即Ω片段(参见Prentki,P.,andH.M.Krisch；1984；InvitroinsertionalmutagenesiswithaselectableDNAfragment；Gene29:303-313；以及XiaomingTan,LunYaoetc.,2011,Photosynthesisdrivenconversionofcarbondioxidetofattyalcoholsandhydrocarbonsincyanobacteria,MetabolicEngineering13,169176)作为抗性标记。合成的Ω片段的序列如SEQIDNo.6所示。将Ω片段，启动子Prbc和pdc基因顺次连接克隆到pET28b载体上，通过抗性筛选得到质粒PXT117。pXT117结构见图1。通过PCR核查，确认得到带有Ω-Prbc-pdc的插入片段的质粒。质粒pXT117转化大肠杆菌DH5α(大肠埃希氏菌，Escherichiacoli),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2011年10月14日，保藏号为CGMCCNO.5348。实施例2将PDC蛋白的290Tyr进行点突变通过点突变技术，把编码PDC的pdc基因上的TAC突变为ACC，从而将PDC的290位的酪氨酸Tyr置换为苏氨酸Thr。利用步骤I得到的pXT117质粒作为模板进行overlapPCR(重叠PCR)，采用的引物包括I号引物5，-ATGAGTTATACTGTCGGTACC-3，；2号引物3，-TTCGGACAATTGTTCGAGGAGATC-5，；3号引物3’-AGAAGTTGCTGTGGAGGTGGTGACCAA-5，；4号引物5’-TCTTCAACGACACCTCCACCACTGGTT-3’。其中下划线部分即用于产生TAC(编码Tyr)突变为ACC(编码Thr)点突变的位置。先利用I和3号引物，2和4号引物分别PCR，扩增出上片段和下片段。然后利用上片段和下片段同时做模板，用I和2号引物合成全长片段，合成全长片段后通过凝胶电泳进行DNA片段回收。利用XhoI对PXT117载体酶切，然后利用T4DNA聚合酶补平，通过凝胶电泳进行DNA片段回收。将合成片段与酶切后的PXT117载体用T4DNA连接酶连接，然后转化大肠杆菌。用抗生素筛选出阳性克隆，然后提取质粒，用kpnl酶切进行鉴定。得到的阳性克隆载体命名为PXT117-T290。pXT117结构见图1。利用类似的方式构建其它具有Υ290位点的点突变的质粒，包括(l)pXT117_G290，其采用的引物为3号引物3，-AGAAGTTGCTGCCTAGGTGGTGACCAA-5，；4号引物5’-TCTTCAACGACGGATCCACCACTGGTT-3’。(2)pXT117_S290，其采用的引物为3号引物3’-AGAAGTTGCTGAGGAGGTGGTGACCAA-5，；4号引物5’-TCTTCAACGACTCCTCCACCACTGGTT-3’。(3)pXT117_Q290，其采用的引物为3号引物3，-AGAAGTTGCTGGTTAGGTGGTGACCAA-5，；4号引物5’-TCTTCAACGACCAATCCACCACTGGTT-3’。实施例3带有抗生素标记、启动子和具有290Tyr点突变的运动单胞菌pdc基因的用于转化蓝藻的穿梭质粒的获得用SphI和NotI双酶切PXT117-T290，补平粘性接口，回收Ω-Prbc-pdc的片段。用EcoRI酶切用于转染蓝藻的穿梭载体PKW1188SL，该质粒转化大肠杆菌DH5α(大肠埃希氏菌，Escherichiacoli),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2011年10月14日，保藏号为CGMCCNo.5349。其构建和结构参见XiaomingTan,LunYaoetc.,2011,Photosynthesisdrivenconversionofcarbondioxidetofattyalcoholsandhydrocarbonsincyanobacteria,MetabolicEngineering13，169-176),用T4DNAPolymerase补平，回收约5.4kb的片段。将获得的Ω-Prbc-pdc的片段与前述pKW1188SL经EcoRI酶切后得到的片段连接，经筛选得到穿梭质粒PXT122-T290。pXT122_T290结构参见图1。利用类似的方式构建其它具有Υ290位点的点突变的质粒，包括pXT122-G290、PXT122-S290、pXT122_Q290。实施例4聚球藻的adhB序列的获得根据已报道的聚球藻的adhB序列的DNA序列(如Genebank的AP008231.1，X04616.2)，合成带有SEQIDNo.4的核酸序列。为了克隆到pXT117，在合成时在该序列的5’和3’端分别添加SpeI位点和NotI位点。实施例5带有抗生素标记、启动子、具有290Tyr点突变的运动单胞菌pdc和聚球操的adhB基因的载体的获得对实施例2获得的pXT117系列质粒(包括pXT117_T290、pXT117_G290、PXT117-S290、pXT117-Q290)和实施例4得到的adhB片段分别用SpeI和NotI进行双酶切，连接后得到PXT119系列质粒(包括pXT119-T290、pXT119_G290、pXT119_S290、pXTl19-Q290)。其中pXTl19-T290结构见图1。通过凝胶电泳和测序，确认得到带有Ω-Prbc-pdc-adhB插入片段的质粒。实施例6带有抗生素标记、启动子、运动单胞菌pdc基因和聚球藻的adhB基因的用于转化蓝藻的穿梭质粒的获得用SphI和NotI双酶切ρΧΤ119-Τ290，补平粘性接口，回收约5.8kb的片段(即Ω-Prbc-pdc-adhB的片段)。用EcoRI酶切质粒PKW1188SL，该质粒转化大肠杆菌DH5a，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.5349。其构建和结构参见XiaomingTan,LunYaoetc.,2011,Photosynthesisdrivenconversionofcarbondioxidetofattyalcoholsandhydrocarbonsincyanobacteria,MetabolicEngineering13,169176)，T4DNAPolymerase补平，回收约5.4kb的片段。将获得的Ω-Prbc-pdc-adhB的片段与pKW1188SL经EcoRI酶切后得到的片段连接，经筛选得到如图1所示的质粒PXT123-T290。利用类似的方式构建其它具有Y290位点的点突变的质粒，包括pXT123-G290、PXT123-S290、pXT123_Q290。以上步骤中PCR、酶切、补平、连接等分子克隆技术操作按照常规方法进行，其中典型操作包括以下方法。PCR:反应条件为94°C先变性5min;然后94°C变性lmin，62°C退火30s，72°C延伸2min，共25个循环；最后72°C反应lOmin。DNA片段连接反应，其中IOul连接体系，以TA连接为例外源DNA8ulT载体0.5ulIOX缓冲液IulT4DNA连接酶O.5ul混匀体系后，16°C连接过夜。对一般性连接反应，片段载体摩尔比为31-10I。实施例7蓝藻细胞的转化转化野生型集胞藻PCC6803为宿主，将实施例中6获得的带Ω-Prbc-pdc-adhB的PXT123质粒系列和将实施例3中获得的带Ω-Prbc-pdc的pXT122质粒系列转化到集胞藻中。其中，按照以下条件培养野生型集胞藻PCC6803:培养温度30°C;光照强度50μE.m_2.s.1;培养方式500ml三角瓶培养，通5%C02，接种浓度OD730=O.5;培养基配制BG-1I培养基300ml，高压蒸汽灭菌后，温度降低到室温，加入壮观霉素，浓度20μg.mL—1。然后把质粒pXT123-T290通过以下步骤转化到PCC6803。5000g离心5分钟收集藻细胞；用新鲜BG-1l液体培养基洗涤细胞两次后，按IXIO9Cells.mr1(0D730=2.5)的浓度将细胞重悬于BG-1l培养基中;温育，取O.4mL浓缩后的藻液到新的无菌EP管，加入质粒pXT123-T290(终浓度10μg.mL_l)混匀，30μE.m_2·s—1光照30°C温育45hr;涂膜将藻-DNA混合物涂在含有硝酸纤维素膜的BG-1l平板上，光照条件下，30μΕ.ΠΜ.ηΓ2.S-1JOO温育1824hr;转膜将NC膜转移到含有抗生素的BG-1l平板上，于30μEm_2.培养约一周左右即有转化子长出。挑取转化子在带壮观霉素的BG-1l平板上划线，待藻落富集后再接入液体培养基中进一步分离筛选。得到带有pXT123-T290的集胞藻(Synechocystissp.),命名为PCC6803-pXT123-T290。其中一个菌株(送保藏名pXT123_T290)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏时间为2011年12月02日，保藏号为CGMCCNO.5533。得到带有ρΧΤ122-Τ290的集胞藻(Synechocystissp.)，命名为PCC6803-pXT122-T290。其中一个菌株(送保藏名pXT122_T290)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2011年12月02日，保藏号为CGMCCNO.5532。利用类似的方式得到带有其它点突变的质粒的集胞藻菌株，所述质粒包括PXT123-G290、pXT123_S290、pXT123_Q290、pXT122_G290、pXT122_S290、pXT122_Q290等。实施例7转基因蓝藻生产乙醇的活性检测如实施例7中描述的培养基和培养条件下培养实施例7中获得的上述PCC6803-pXT122-T290和PCC6803-pXT123_T290菌株，以PCC6803为空白对照。每两天取样一次，每次500ul,使用可见光分光光度计测量培养液的0D730,以获得蓝藻的生物量数据。使用山东省科学院生物研究所生物传感分析仪SBA-40D测定蓝藻培养液中的乙醇浓度。SBA-40D型生物传感分析仪利用酶促反应来进行定量分析，测定的关键传感器是固定化酶和H202电极复合传感器，分析过程基于以下生化反应底物+O2+H2O-固赵七_莫——^产物+Η2θ2谷氨酸谷氨酸氧化酶α-酮戊二酸十NH4+葡萄糖葡萄糖氧化酶葡萄糖酸乳酸乳酸氧化酶丙酮酸乙醇乙醇氧化酶乙酸把转基因蓝藻培养液12000rpm离心2min，取上清液测量乙醇浓度。按生物传感分析仪操作指南清洗仪器、定标后，使用生物传感分析仪配套的取样针取上清液25ul，注入进样孔，仪器给出乙醇浓度读数。上述PCC6803-PXT122-T290和PCC6803-pXT123_T290菌株的生长和生产乙醇与时间的关系如图3所不。本发明以蓝藻为宿主，将外源乙醇代谢途径基因导入染色体，形成具有稳定遗传性状和较高乙醇产率的基因工程菌株。本发明的基因工程菌株能够利用阳光、二氧化碳生产乙醇这种替代能源产品。本发明为解决传统生物能源技术的规模、产量和成本瓶颈提供了新的方法，有助于达到节能减排目标。本申请中提到的论文或专利申请的全文或部分通过引用到本申请中而公开，但不形成对本发明的现有技术。对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化涵括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。此夕卜，显然“包括”一词不排除其他单元或步骤，单数不排除复数。权利要求1.一种利用光合作用生产乙醇的基因工程蓝藻，其含有整合到染色体上的外源基因，所述外源基因为丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因，其中所述丙酮酸脱羧酶基因编码的丙酮酸脱羧酶具有对应于SEQIDNO.1的氨基酸序列，并且其中自N端第290位的苏氨酸Thr具有突变，以及所述乙醇脱氢酶基因编码的乙醇脱氢酶具有对应于SEQIDNO.3的氨基酸序列，其中所述第290位的苏氨酸Thr突变为酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)，优选为酪氨酸(Tyr)。2.权利要求1所述的基因工程蓝藻，其中所述丙酮酸脱羧酶基因具有SEQIDNO.2的碱基序列的多核苷酸，并且其中编码对应于SEQIDNO.1氨基酸序列中自N端第290位的苏氨酸的碱基序列由TAC改变为编码酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)的碱基序列，优选的，所述编码对应于SEQIDNO.1氨基酸序列中自N端第290位的苏氨酸的碱基序列由TAC替换为ACC、ACA、ACT或ACG，优选替换为ACC。3.权利要求1-2中任一项所述的基因工程蓝藻，其中所述乙醇脱氢酶的基因具有SEQIDNO.4的碱基序列的多核苷酸。4.权利要求1-3中任一项所述的基因工程蓝藻，其中所述丙酮酸脱羧酶基因来源于运动发酵单胞菌，以及所述乙醇脱氢酶基因来源于聚球藻。5.权利要求1-9中任一项的基因工程蓝藻，其选自集胞藻属、隐球藻属、鱼腥藻属、念珠藻属、颤藻属、聚球菌属、球藻属、阿格藻属、双歧藻属、鞭枝藻属，优选为集胞藻，最优选的是集胞藻PCC6803。6.权利要求1-5中任一项的基因工程蓝藻，其生产的乙醇由细胞中扩散到培养液中，溶液中乙醇浓度达到O.lg/L，优选的，达到O.5g/L，更优选的，达到1.5到5g/L。7.权利要求1-6任一项的基因工程蓝藻，其保藏号为CGMCCNo.5533。8.制备权利要求1-7中任一项的基因工程蓝藻的方法，其包括将外源丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因，以及表达丙酮酸脱羧酶所需启动子导入蓝藻，并整合到蓝藻染色体上。9.用权利要求1-7中任一项的基因工程蓝藻制备乙醇的方法。10.一种载体，其包括(a)核酸，其包含丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因，其中所述丙酮酸脱羧酶基因编码的丙酮酸脱羧酶具有对应于SEQIDNOI的氨基酸序列，并且其中自N端第290位的苏氨酸Thr具有突变，以及其中所述乙醇脱氢酶基因编码的乙醇脱氢酶具有对应于SEQIDNO3的氨基酸序列。和(b)启动子，所述启动子与所述丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶基因可操作地连接，优选的，其中所述第290位的苏氨酸Thr突变为酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)，最优选为酪氨酸(Tyr)，更优选的，所述载体中所述丙酮酸脱羧酶基因(I)具有SEQIDNO.3的碱基序列的多核苷酸，并且其中编码对应于SEQIDNO.1氨基酸序列中自N端第290位的苏氨酸的碱基序列由TAC改变为编码酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)的碱基序列。全文摘要本发明提供了一种利用光合作用生产乙醇的基因工程蓝藻，其含有整合到染色体上的外源丙酮酸脱羧酶基因和外源乙醇脱氢酶，所述丙酮酸脱羧酶基因编码的丙酮酸脱羧酶具有点突变。本发明还提供了制备所述基因工程蓝藻的载体和制备方法，以及使用所述基因工程蓝藻制备乙醇的方法。文档编号C12P7/06GK102994391SQ20111044362公开日2013年3月27日申请日期2011年12月27日优先权日2011年9月19日发明者范文俊,郑晓光申请人:浙江齐成碳能科技有限公司