专利名称：一种海绵共生放线菌的分离筛选方法放线菌属于好氧革兰氏细菌，通常具有类似真菌的孢子丝，它们在自然环境中广 泛分布。放线菌是一大类有益次级代谢产物的生产者。目前所使用的抗生素中，70%是由 放线菌产生。而已知的微生物来源的抗肿瘤化合物，都源自于放线菌。另外放线菌的次级 代谢产物还表现在抗病毒、抗感染、抗寄生、酶抑制剂等。就海洋中放线菌而言，在海水、海泥和海洋生物中也广泛存在。国际上报道的来源 于海洋微生物活性物质中，其中有一半以上来自放线菌，这说明了在海洋微生物资源和相 关产物开发过程中，放线菌仍是主力军。而且从海洋放线菌分离得到的化合物具有不同于 陆地放线菌的特殊结构，其活性也是令人欣喜。海绵是一种原始的无脊椎动物，属于底栖滤食性动物，生活在海洋中的岩石上，在 海绵滤食过程中，许多微生物尤其是不能被消化的微生物得以在海绵体内保留，这样在海 绵体内和体表就富集了大量的微生物。这些微生物分布在海绵宿主细胞的胞外和胞内，如 海绵外层的胞外共生微生物和海绵中胶层的胞内共生微生物。胞内(包括细胞质内和细胞 核内)的微生物可以长久的存在于细胞和细胞核内。通过传统培养和分子生物学方法发现 海绵中存在大量丰富的共生放线菌资源，仅有少部分放线菌获得了纯培养，绝大部分放线 菌用目前分离培养方法不能获得纯培养，尤其是一些胞内的共生微生物，分离和培养的难 度较大。为了提高海绵共生放线菌的可培养性，本方法在筛选方法上做了改进，包括样品前 处理和选择性培养基两方面。
本发明的目的在于提供一种简便易行、快速有效的海绵共生放线菌的分离筛选新 方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为将采集海绵样品，通过改进的方法对样品前处理后，将它们涂布在特定的培养基 中培养。样品前处理包括将采集的海绵样品室温干燥后研成粉末，放入60 80°C干燥箱 干燥，取出样品凉至室温后，加入含0. 1 0. 2%脱脂奶粉IOmM的MOPS(3-吗啉丙磺酸)， 27 28°C振荡培养1 2小时，离心，保留上清，分成两份备用。以HVA为基础培养基，向 其中加入微量元素作为培养基组成成份之一(微量元素的应用是模拟海绵微环境元素组 成的含量配制微量元素加入到培养基中)，基质选择以胶凝糖代替琼脂，碳源选择用腐殖酸 或几丁质配制成海绵放线菌液体(或固体)培养基。取一份上清直接均勻涂布于海绵放线 菌固体培养基进行培养观察，将另一份上清先用海绵放线菌液体培养基进行富集培养，然 后再涂布于海绵放线菌固体培养基进行培养观察。用此方法筛选得到多个种属的放线菌菌株，说明本发明方便有效性。一种海绵共生放线菌的分离筛选方法，经过上述的海绵样品前处理和培养基的改 进，分离筛选到了多样性的海绵共生放线菌，具体工艺步骤如下1)取采集的海绵样品，用无菌手术刀切块后称重，样品块于装有无菌海水的烧杯 中洗涤3 5次，洗去样品表面附着的微生物和其它杂质；2)将样品室温干燥后研成粉末，放入60 80°C干燥箱中干燥彡1小时，取出样品凉至室温； 3)取凉至室温的样品，每800 IOOOmg样品加入8 IOml含质量浓度0. 脱 脂奶粉的IOmM的MOPS (3-吗啉丙磺酸)，27 28°C振荡培养彡1小时，1000 1200Xg离 心10 15分钟，取0. 1 0. 2mL的上清均勻涂布于海绵放线菌固体培养基平板上，27 28°C培养箱中倒置培养，观察菌株生长情况；4)另取8 IOml上清加入IOOml海绵放线菌液体培养基中，在三角烧瓶中摇瓶富 集培养彡24小时，温度为27 28°C，转速为150 250转/分钟；5)取富集培养后的海绵放线菌液体培养基0. 5ml，加入装有4. 5ml无菌海水的试 管中涡旋混勻作为原液，原液进行10_10_2、10_3系列稀释作为备用菌液；6)分别取上述稀释操作中各步的备用菌液0. 1 0. 2ml均勻涂布于海绵放线菌固 体培养基平板，每种稀释度的备用菌液涂5 10个平板；27 28°C培养箱中倒置培养，观 察菌株生长情况；当平板上出现螺旋形气生菌丝或坚硬光滑的典型放线菌菌落后，挑取单 菌落在海绵放线菌固体培养基平板上划线；划线后的平板再于27 28°C培养箱中倒置培 养5 7天，挑取单菌落继续在海绵放线菌固体培养基平板上划线培养，重复这一过程3 5次；直到菌落长成纯的单菌落；7)挑取纯的单菌落接种海绵放线菌液体培养基在试管中27 28°C，150 250 转/分钟培养48 72小时，观察培养液出现明显菌丝体成球后，取菌液加入装有体积浓度 15 20%甘油水溶液的冻存管中，颠倒混勻，_70°C放置保存备用。所述海绵样品为大连黄渤海海域潮间带的繁茂海绵(Hymeniacidonperleve)或 肾指海绵(Reniochalina sp.)，海南三亚小轴海绵(Axinella sp.)，采自50 4800米深的 南极海域海绵Myxilla mollis,Rossella nuda,Rossellaracovitzae,Homaxinella sp.或 Polymastia sp.。所述海绵放线菌液体培养基配制过程如下将腐殖酸或几丁质0.5 lg、 MgSO4O. 5g、KCl 1. 7g、CaCl2O. 02g、Na2HPO4O. 5g、微量元素 1 2ml、NaCl 20g 加入到 IL 去 离子水中，调PH值到7. 0 7. 2，110 120°C蒸汽灭菌15 20分钟，放置冷却到50 60°C，加入经0. 22uM滤膜过滤除菌的复合维生素液1 2ml。所述海绵放线菌固体培养基配制过程如下将腐殖酸或几丁质0.5 lg、 MgSO4O. 5g、KCl 1. 7g、CaCl20. 02g,Na2HPO4O. 5g、微量元素 1 2ml、胶凝糖 18g、NaCl 20g 力口 入IL去离子水中，调pH值到7. 0 7. 2，110 120°C蒸汽灭菌15 20分钟，放置冷却到 50 60°C，加入经0. 22uM滤膜过滤除菌的复合维生素液1 2ml，倒平板。所述微量元素是模拟海绵体内元素组成配制，其成份为于0. IN HCl溶液中， Na2Si035Mm ；FeCl3 ‘ 6H20 ImM ；MnSO4 ‘ H2O 2. 5mM ；KAL (SO4)2O. 2mM ；CaCl ‘ 2H20 IOmM ； MgSO4ImM ；CoCl · 6H20 0. ImM ；TiCl3O. 5mM ；禾口 Na2MoO4 · 2H20 0. ImM0所述复合维生素的组成为去离子水中含0. 5mg/ml VB1、0. 5mg/mlVB2、0. 5mg/ml VB6、对氨基苯甲酸0. 5mg/ml、烟酸0. 5mg/ml、肌醇0. 5mg/ml、泛酸钙0. 5mg/ml和生物素 0. 25mg/ml。本发明的优点在于由于放线菌是一类具有分枝菌丝的特殊细菌，其生长比一般细菌缓慢，在筛选当中它的生长常会受到快速生长菌的抑制，因此放线菌的分离筛选比较 困难。对于海绵共生放线菌，尤其是一些胞内的共生菌，分离和培养的难度就更大。现有和 经典的分离、培养技术还不能满足对海绵共生放线菌的分离。因此本方法在富集培养阶段 采用了创新设计的海绵放线菌培养基，以HVA为基础培养基，加入模拟海绵体内元素组成 配制的微量元素作为培养基组成成份之一，并加复合维生素做为生长因子以利于放线菌的 生长。在样品预处理时采用室温与干燥箱干燥相结合，可以很大程度地抑制一般的细菌孢 子，而对抗逆性较强的放线菌孢子抑制较小，方法简便易行。本发明适用于不同环境的海绵共生放线菌的分离培养，为医药中间体、农药化学 等工业领域提供活性化合物。Ce 11u1 οsimicrobium, Gordonia, Nocardia, Prauseria, PseudonOcardia, Saccharomonospora, Microbacteriu ；这些分离到的海绵共生放线菌菌株分别与NCBI上发 表的来源于海洋的菌株相似性为99 100%，它们广泛分布于海洋环境中。实施例2与实施例1不同之处在于，其所选用的海绵样品为热带南海小轴海绵。分离获得 菌株15株。包括方文线菌的三个属Streptomyces, Nocardiopsis, Pseudonocardia0这些分 离到的海绵共生放线菌菌株分别与NCBI上发表的来源于海洋的菌株相似性为99 100%， 它们广泛分布于海洋环境中。实施例3与实施例1、2不同之处在于，其所选用的海绵样品为南极海域50 4800米 深的海绵。分离获得菌株42株，包括放线菌的五个属Str印tomyces，Nocardiopsis, Pseudonocardia，Nocardia，Dietzia 禾口 Brevibacterium。这些分离至Ij的海绵共生放线菌菌 株分别与NCBI上发表的来源于海洋的菌株相似性为99 100%，它们广泛分布于海洋环境中。

本发明涉及放线菌，具体地说是一种海绵共生放线菌的分离筛选方法，其以海绵样品为分离源，通过样品前预处理和模拟海绵体内元素组成配制微量元素作为培养基配方之一，以复合维生素作为生长因子促进放线菌生长，配制海绵放线菌液体(或固体)培养基，通过富集培养、平板筛选、菌株的分离纯化等步骤可以最终得到海绵共生放线菌。本发明适用于不同环境的海绵共生放线菌的分离培养，为医药中间体、农药化学等工业领域提供活性化合物。