普罗地芬在制备治疗或预防流感病毒感染药物中的应用的制作方法【技术领域】[0001]本发明涉及医药【技术领域】，具体涉及一种普罗地芬在制备治疗或预防流感病毒感染药物中的应用。[0002]流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae),流感病毒属。根据病毒粒子核蛋白(NP)和基质蛋白(M)的抗原特性及基因特性的不同，流感病毒分为A、B、C三型，也称甲、乙、丙三型。A型流感病毒全基因组由8条大小不等的单股负链RNA组成，分别以节段I至节段8命名。病毒基因组全长约13.6kb，编码10种结构蛋白(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、PB1-F2和NS2/NEP)和非结构蛋白(NSl)。根据病毒粒子表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同，A型流感病毒可进一步分为17个H(H1-H17)和10个N(Nl-NlO)亚型。人流感病毒主要是H1、H2和H3亚型。而目前危害严重的高致病性禽流感多为H5、H7和H9亚型，其中以H5N1亚型致死率最高。B型流感病毒常引起流感局部流行，不引起世界性流感大爆发，仅在人和海豹中发现。C型流感病毒多以散在形式存在，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行，可感染人类和猪。[0003]流感病毒的整个生活周期需要在细胞质和细胞核内完成。感染的起始是病毒颗粒表面的刺突HA识别 和结合宿主细胞表面含唾液酸的受体。唾液酸与次末端半乳糖的连接键，决定了病毒的宿主特异性，该连接键在禽类中为α (2-3),在人类中为α (2_6)。病毒吸附细胞后，细胞通过网格蛋白受体介导的胞饮作用摄入病毒。在细胞内，网格蛋白分子解离，病毒与内涵体融合形成吞噬体，使得病毒粒子周围的PH值下降至5.0左右。在此pH条件下，病毒HA蛋白的构象发生变化，使位于轻链(HA2) N端的融合肽暴露，从而引起病毒囊膜与细胞膜融合。低PH环境也致使大量H+经由M2离子通道进入病毒粒子内部，导致Ml蛋白与vRNPs的解离。两者的共同结果致使病毒粒子的vRNPs释放到被感染细胞的胞浆。vRNPs随后转到细胞核内进行基因组的复制和转录，复制时病毒首先以自身RNA为模板合成互补RNA(cRNA)，然后以cRNA为模板再合成vRNA。转录生成的mRNA由核内转移到胞浆，翻译出病毒的结构蛋白和非结构蛋白。一部分合成蛋白如NP需要重新转移到核内与新生成的vRNA组装成vRNP，vRNP出核后与其余的病毒蛋白开始组装成新的病毒粒子，新生成的子代病毒通过神经氨酸酶(NA)水解细胞表面的糖蛋白，释放N-乙酰神经氨酸，促使病毒粒子从出芽位点释放出来。病毒成熟的最后一步是HA在宿主蛋白酶的作用下裂解为HAl和HA2多肽，这样的病毒粒子才具有感染性，从而开始新一轮病毒的复制。[0004]流感病毒自20世纪初发现以来已在全球范围内造成五次大流行，十年左右会产生一次暴发流行，在全球范围内造成了巨大的损失。流感流行每年可导致25万~50万例死亡，300万~500万重病例，全球约共有5~15%的人被感染。接种疫苗和使用抗病毒药物是应对流感大流行的重要手段，然而由于流感病毒抗原变异能力强，在大流行前基本上不可能大规模生产疫苗。目前，经美国食品和药物管理局(FDA)批准正式上市的抗流感病毒药物有两类:(1)以金刚烷胺和金刚乙胺为代表的M2离子通道阻断剂。此类药只对甲型流感病毒有预防和治疗作用，研究表明此类药物具有神经毒性等毒副作用，而且由于耐药株的普遍存在，所以CDC建议此类药物不再用于预防流感病毒感染。(2)神经氨酸酶抑制剂，此类药的代表是奥斯他韦和扎拉米韦。此类药物对所有已知的人流感病毒及高致病性禽流感病毒均有效。但是近年来关于奥斯他韦耐药株的确不断有报道。因此，研究并开发新型抗流感病毒药物有重要意义。[0005]普罗地芬(Proadifen)，或盐酸普罗地芬，又名盐酸丙基解痉素。英文别名SKF-525A Hydrochloride。作为细胞色谱P450酶抑制剂，能够竞争代谢途径导致药物代谢酶被抑制。临床上作为一种助吸收药物使用。目前为止，并未发现任何关于普罗地芬抗流感病毒的相关报道。
[0006]本发明的目的在于弥补现有技术中存在的不足，提供一种小分子化合物普罗地芬在制备治疗或预防流感病毒感染药物中的应用，从而为临床上流感的治疗提供一种安全有效的小分子化合物。普罗地芬在无毒性范围内能够有效地抑制流感病毒的复制，可进一步开发为治疗或预防流感病毒感染疾病的药物，具有广泛的应用前景。
[0007]为了证明普罗地芬在制备治疗或预防流感病毒感染药物中的可行性，本发明采取了以下实验进行验证:[0008]普罗地芬对MDCK细胞的毒性实验:MDCK细胞按8 X IO3个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后，以250.0 μ M为最高浓度按照2梯度稀释共计8个梯度的普罗地芬进行处理，每组重复两个孔，置于37°C、5%C02培养箱中培养48小时后，Alamarblue法检测细胞的存活率。结果显示，普罗地芬对MDCK的CC5tl (半数致死浓度)约为107.4 μ M0
[0009]普罗地芬抗流感病毒活性的评价:将MDCK细胞按照1.5 X IO4细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，37°C、5%C02细胞培养箱中培养。18-24h后，用IOOTCID5q的病毒液(A/PuertoRico/8/34 (HlNl))感染细胞，同时加入不同浓度梯度药物。细胞于37°C细胞培养箱中培养48h后取各实验孔上清进行神经氨酸酶活性检测。结果显示普罗地芬能够明显抑制流感病毒的复制，其IC5tl为15.4 μ M0
[0010]普罗地芬抗流感病毒广谱性分析:将MDCK细胞按照1.5 X IO4细胞/孔接种于96细胞培养板中，37°C、5%C02细胞培养箱中培养。18-24后，用IOOTCID5q病毒液(分别为A/human/Hubei/3/2005 (H3N2)、A/WSN/S31N (HlNl)、A/Duck/Hubei/5/2010 (H6N6)、A/Duck/Hubei/216/1983 (H7N8))感染细胞，同时加入各浓度梯度药物。细胞于37°C细胞培养箱中培养48h后取各实验孔上清进行神经氨酸酶活性检测。结果显示普罗地芬能够明显抑制甲型流感病毒亚型H3N2株、甲型流感病毒亚型HlNl金刚烷胺耐药株、甲型流感病毒亚型H6N6株、甲型流感病毒亚型H7N8株，且均具有剂量依赖效应。
[0011]本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:
[0012]1.普罗地芬是小分子化合物，其CC5tl (半数致死浓度)为107.4 μ M。普罗地芬能够剂量依赖地抑制流感病毒复制，其IC5tl (半数抑制浓度)为15.4 μ Μ。选择指数(SI)约为7.0。而且普罗地芬已经在临床上有数十年的应用，安全性良好。这说明普罗地芬是低毒高效的抗流感病毒的药物。
[0013]2.普罗地芬能够剂量依赖地抑制甲型流感病毒亚型Η3Ν2株、甲型流感病毒亚型HlNl金刚烷胺耐药株、甲型流感病毒亚型H6N6株、甲型流感病毒亚型H7N8株，具有非常广谱的抗甲型流感病毒活性。
[0014]3.利用现代常用药物制剂手段，可将普罗地芬作为活性成分制成片剂、胶囊、颗粒齐?、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂或注射剂等任何一种药学上可接受的剂型。



[0015]图1为一种普罗地芬细胞毒性检测示意图。
[0016]图2为一种普罗地芬处理流感病毒复制水平示意图。
[0017]图3为一种普罗地芬抗流感病毒活性广谱性检测示意图，其中:
[0018]图3Α 为甲型流感病毒亚型 Η3Ν2 株(A/human/Hubei/3/2005 (H3N2))；
[0019]图3B为甲型流感病毒亚型HlNl金刚烷胺耐药株(A/WSN/S31N(HlNl))；
[0020]图3C 为甲型流感病毒亚型 H6N6 株(A/Duck/Hubei/5/2010 (H6N6))；
[0021]图3D 为甲型流感病毒亚型 H7N8 株(A/Duck/Hubei/216/1983(H7N8))。

[0022]为了更好地阐述本发明的内容，下面 申请人:将结合具体实施例对本
作进一步的详细说明，但本发明请求保护的范围不局限于以下实施例。
[0023]目前，抗流感病毒药物体外筛选模型分为细胞培养模型和病毒酶的无细胞系统筛选模型。酶反应筛选模型具有高通量的特点，但筛选的化合物仍需进行更多的细胞学、组织学和体内毒性、药效实验等以确定其效果。细胞培养模型是最常用的筛选模型，其优点在于:可提供大量遗传性状相同的细胞为研究对象，操作方便，可消除其它外界因素的影响，并可以检测药物的有效浓度和治疗指数，为后期机理研究提供更多基础。本发明采用MDCK细胞培养筛选法检测普罗地芬对流感病毒感染的影响，基于对上清中代表流感病毒复制水平的神经氨酸酶表达水平的检测，定量分析普罗地芬的抗流感病毒活性。
[0024]实施例1:普罗地芬抗流感病毒活性的评价
[0025]1.实验材料
[0026]1.1细胞、病毒和药物
[0027]MDCK细胞购自美国模式菌种保藏中心(ATCC);病毒株:A/PuertoRi co/8/34(HlNl);药物:普罗地芬(CAS:302-33-0)购于Sigma公司。
[0028]1.2实验仪器
[0029]多功能检测仪PerkinElmer,倒置显微镜Costar。
[0030]2.实验方法与结果
[0031]2.1细胞培养:37°C，5%C02加湿培养箱中培养。使用含有10% FBSU00U/mL的青霉素和链霉素的DMEM培养基。细胞至90%汇合度后传代，传代比例1/3 - 1/4。
[0032]2.2病毒培养:取9~11日龄SPF鸡胚，接种病毒前用验蛋器检查，并在远离胚胎的位置标记，消毒并打孔后按0.2ml/枚接种24血凝效价的病毒液，用指甲油封口，置37°C恒温箱孵育48h (接种24h后死亡的鸡胚一般为操作不当致死，弃之)。取出鸡胚置4°C冷胚12h。75%酒精消毒鸡胚气室，无菌操作剪去气室外壳，毛细吸管吸取鸡胚尿囊液和羊水，3000rpm4°C离心30min，检测血凝效价，200 μ I/管分装并置_70°C冻存备用。[0033]2.3普罗地芬的细胞毒性检测播0(细胞按8103细胞/孔(10(^1)接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用；用细胞维持液(DMEM+2%血清)将药物以250.0 μ M为最高浓度按照2梯度稀释共计8个梯度进行处理，每梯度2个复孔。培养48h后弃掉培养上清，于每孔中加入100 μ I含有10%Alamarblue试剂的新DMEM培养基，置细胞培养箱中继续培养lh，Ih后用多功能检测仪分别测量荧光和吸光值，计算细胞存活率。
[0034]结果显示(图1)普罗地芬在50.0μ M范围内对MDCK细胞完全没有细胞毒性，说明普罗地芬有比较安全的适用范围，即普罗地芬的给药剂量按照细胞实验用量为0.0~50.0 μ Mo
[0035]2.4普罗地芬对流感病毒株A/PuertoRico/8/34 (HlNl)的抗病毒活性评价
[0036]2.4.1.实验原理:MUNANA (4-methylumbelliferyl- a -N-acetyl-neuraminate)是流感病毒神经氨酸酶的特异性底物，在神经氨酸酶作用下产生的催化产物在355nm激发光照射下，可以产生460nm突光,突光强度的强弱代表了病毒神经氨酸酶表达量的多少，反映了培养细胞上清中的病毒量。
[0037]2.4.2.将MDCK细胞按1.5 X IO4细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，37°C细胞培养箱中培养14~18h后，待细胞长成单层后备用。将孔板中培养基弃去，PBS清洗两遍后，加入IOOTCID5q病毒液(100 μ I)和不同浓度药物(100 μ I)于37°C细胞培养箱中培养。药物以50.0 μ M为起始浓度，连续2倍梯度稀释6个梯度，每梯度设置两个复孔。培养48h后取各实验孔上清进行神经氨酸酶活性检测。实验设置空白对照组、阳性对照组(利巴韦林)、阴性对照组(病毒感染后无药物处理)和实验药物组。 [0038]2.4.3.黑色 96 孔微量板中加入 40 μ I 缓冲液(32.5mmol/L MES, ρΗ6.5,4mmol/L CaCl2)配制的底物20umol/L MUNANA，再加入各实验孔培养上清20 μ 1，37°C避光孵育60min，加入反应终止液(0.014 μ M NaOH, 83%乙醇)100 μ I/孔，微孔读板仪上测定荧光值(激发光波长355nm,发射光波长465nm)。
[0039]2.4.4.计算各检测孔中药物对神经氨酸酶的抑制率。
[0040]抑制率(％) =100-(样品孔-空白对照)/ (酶活对照-空白对照)*100%
[0041]结果显示:随着普罗地芬药物浓度的增加，药物对流感病毒复制的抑制率逐渐升高，呈现很明显的剂量依赖效果，在50.0y M浓度时达到接近100%抑制率。(见图2)。
[0042]实施例2:普罗地芬抗流感病毒作用广谱性的评价
[0043]在实施例1的基础上，本实施例进一步检测了普罗地芬对甲型流感病毒亚型Η3Ν2株、甲型流感病毒亚型HlNl金刚烷胺耐药株、甲型流感病毒亚型Η6Ν6株、甲型流感病毒亚型Η7Ν8株的抗病毒活性。
[0044]1.实验使用病毒株包括:A/human/Hubei/3/2005(H3N2)，A/WSN/S31N(HlNl)，A/Duck/Hubei/5/2010(H6N6)，A/Duck/Hubei/216/1983(H7N8)
[0045]2.将MDCK细胞按1.5 X IO4细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，37°C细胞培养箱中培养14~18h后，待细胞长成单层后备用。将孔板中培养基弃去，PBS清洗两遍后，加入IOOTCId50病毒液(100 μ I)和不同浓度药物(100 μ I)于37°C细胞培养箱中培养。药物以50.0 μ M为起始浓度，连续2倍梯度稀释6个梯度，每梯度设置两个复孔。培养48h后取各实验孔上清进行神经氨酸酶活性检测。
[0046]3.黑色 96 孔微量板中加入 40 μ I 缓冲液(32.5mmol/L MES, pH6.5,4mmol/L CaCl2)配制的底物20umol/L MUNANA，再加入各实验孔培养上清20 μ 1，37°C避光孵育60min，加入反应终止液(0.014 μ M NaOH, 83%乙醇)100 μ I/孔，多功能检测仪上测定荧光值(激发光波长355nm,发射光波长465nm)。
[0047]4.计算各检测孔中神经氨酸酶被抑制率。
[0048]抑制率(％) =100-(样品孔-空白对照)/ (酶活对照-空白对照)*100%
[0049]结果显示:普罗地芬在药物浓度范围内明显抑制了各种流感病毒毒株的复制，并且呈剂量依赖关系(见图3)。其对甲型流感病毒H3N2、甲型流感病毒亚型HlNl金刚烷胺耐药株、甲型流感病毒H6N6和甲型流感病毒H7N8的半数抑制浓度(IC50)分别为18.9 μ M、
8.7 μ Μ、12.5 μ M和26.3 μ Μ,对应的选择指数分别为5.7、12.3、8.6和4.1。表明普罗地芬是一个广谱的抗病毒药物。