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葡萄品种黑比诺抗病、抗逆醛脱氢酶基因序列制作方法

  • 专利名称
    葡萄品种黑比诺抗病、抗逆醛脱氢酶基因序列制作方法
  • 发明者
    张玉成, 王西平
  • 公开日
    2012年7月11日
  • 申请日期
    2011年11月18日
  • 优先权日
    2011年11月18日
  • 申请人
    西北农林科技大学
  • 文档编号
    C12N15/53GK102559712SQ201110368919
  • 关键字
  • 权利要求
    1.葡萄品种黑比诺抗病、抗逆醛脱氢酶基因序列,其特征在于,包括葡萄黑比诺醛脱氢酶基因ALDH2B8的编码区序列和启动子序列2.如权利要求1所述的葡萄品种黑比诺抗病、抗逆醛脱氢酶基因序列,其特征在于,所述的葡萄黑比诺醛脱氢酶基因ALDH2B8的编码区序列是1ATGACTATTCCTAGGATCTCATCGCTGCTCTCTCGCTCTTTCACTTCTTCTGCTTCTTCT61GCTTTGCTTTCTTCCATAGGGAGGAATTCATCCCGGAGGGGCGGGATCTTTAGATATAGC121ACTGCTGCAGTTGTTGAAGAACCAATCAATCCTTCTGTTAATGTCAATTATACTCAGCTT181TTAATCAATGGACAATTTGTGGATGCCGCAACGGGGAAAACTTTTGAGACATTGGACCCC241AGGACAGGGAATGTGATTGCCAGTGTTGCTGAAGGTGACGCAGAAGATGTTAATCGAGCT301GTCTCGGCTGCTCGCAAGGCGTTTGATGAGGGACCATGGCCTAGGATGAGTCCTTATGAG361AGATCCAAGATACTCTTGCGTTTTGCTGATTTGCTTGAAAAGCACAATGATGAGATTGCA421GCACTCGAGACTTGGGATAATGGGAAACCATTTGAACAGGCTGCAAAGGCTGAAGTACCA481TTGGTGATACGTTTGATGCGGTACTATGCGGGTTGGGCAGATAAGATTCATGGTCTCACG541GTTCCTGCTGATGGATTGCATCAAGTGCAAACCTTGCATGAACCCATTGGCGTTGCTGGA601CAGATTATCCCCTGGAATTTCCCACTTCTCATGTATGCTTGGAAGATTGGACCTGCATTA661GCATGTGGTAACACTATCGTTCTAAAGACAGCAGAGCAGACACCATTGTCTGCTTTATAT721GCATCGAAGTTATTGCATGAGGCCGGGCTTCCTCCAGGTGTTCTAAATGTGGTTTCTGGT781TATGGTCCAACTGCTGGTGCAGCACTTGCCAGCCATATGGATGTGGACAAGCTTGCTTTC841ACTGGATCAACTGCAACTGGAAAAATTGTACTTCAATTGGCTGCAAGGAGCAATCTTAAG901CCAGTGACTTTAGAGCTTGGAGGGAAATCCCCTTTCATTGTGTGTGAGGATGCTAATGTA961GATGAGGCTGTTGAGCTAGCCCACTTTGCTTTATTCTTTAATCAGGGGCAATGTTGTTGT1021GCTGGCTCCCGTACATTTGTACATGAAAGTATATACGATGAGTTTGTAGAGAAGGCGAAA1081GCACGTGCTTTAAGACGCACCGTTGGTGATCCATTCAAGGCAGGCATTGAGCAAGGCCCC1141CAGATTGATTCAGATCAATTTGAGAAGATCCTGAGATACATAAGATCTGGTGTCGAAAAT1201GGAGCCACCCTTGAAACCGGAGGTGAGAGATTTGGCAAAGAGGGCTTCTTCATTAAGCCT1261ACAGTTTTCTCTAATGTTCAGGACGGCATGTTGATAGCACAGGACGAGATATTTGGACCA1321GTGCAGTCCATCCTGAAATTCAAGGACCTTGGTGAGGTGATAAGAAGGGCAAACGCCACT1381AGTTATGGGCTGGCCGCAGGAGTCTTTACCCAGAACTTAGACACAGCCAACACCTTGACC1441CGCGCACTAAAGGTGGGCACAGTATGGATTAACTGCTTTGATGTGTTTGATGCAGCGATT1501CCTTTTGGTGGGTACAAGATGAGTGGGCATGGCAGAGAAAAGGGTATTTACAGTCTTCAA1561AACTACCTGCAAGTGAAGGCTGTTATTACTCCCTTGAAGAACCCCGCGTGGTTATAAo3.如权利要求1所述的葡萄品种黑比诺抗病、抗逆醛脱氢酶基因序列,其特征在于,所述的葡萄黑比诺醛脱氢酶基因ALDH2B8的启动子序列是1CCACGCTAGGGTTATGAAAGAGGCACCTGTAATGATGTGACACTGAAACTGGGCCACGAA61ATATGACGTGGAACTGTTGTATAAATTGGAATTAGCCTTTTCCCAACTCATTCCTCCACT121TGAAGTAAGTGGGTATCTTTATCTTCTGTACCTGATGACCATTAAGAAAAAGCTTTTTTT181TTATAGCCACAGAGATTAGCAACAATTGATATTTGATATGAGGTGTCGGTCAAGCACGAG241GCAGCAGCTGCGTATAGTTTTTTCCATCTCACAAGTCCTCCTTCCCTCTTTGTCTTTTTT301ATATTCAGAAGTTAATCACACGGCACAAAATGTTAGAAGAAGAAAAAACTGATTTGATGG361TTGTTGGCAAAATGCGTGCGTTCGCAGAAAAATGGCAAGTTGCAGCATAAAAGGAAGCCT421CCCCATTGGGTAGGCCTTAGCAACTTGTCCTCGATTATAGCACCTCCTTGATTAAAGCTC481CTCCGCTCACCTTTTACTTTCTACTTCCACATTTTCCTTCGCTATCGCCGTCTGAATGGC541GACTCTTCTTTGAATTGGCTTTTATGCCAACAAAGCGCATACGTGTTAAAAAAGAAGTCA601AATTTATTAAATCCTAACTTTAATAAATATATTATTTAAAAATTATTGTCTTTGACCAAT661CGAGTATTACTTTTTTAATAAAATAATTCTTATCTTTAGTGCTGTCTTCAGATTCTTATT721TTCTGTTTTTGACATGCCTATAAAAACTTACTTTTCTAAATTTAAATTAACTTCAAATCA781TGTTTTAAATGAAGGAAACTCTTTTTGTTACACAATCATGTCACTCTAAAAATGGCAACT841CAATATGGATTATCCACTTACAACAATAAATAAGAAAAACTTTTATATTATATTATTTGA901ATATGATTACACGTGATTATATTGAGATGCCAATGAGACAGACTCACATCACTTACTTTC961ATTCAAATTTACATCAATTCTCATTCATTGTAACAAAAAAAATTAAACTATGGAATGAAC1021CCTTTATTTTATTTATTTTTAAAATATTAAATTCTATTAAAAATAAATATAATTTATTAT1081TAAATAAATATCATATATATTTATAATTTATTTTTATAAAAAATCCTATTTTGTATATAC1141ATTTAAAAAGTTAATAAAAAATCAATTAAAATAAATTTTCATTTGATATTATATATAATT1201TAGGTGGACAAGGTAAGAAAAAGTCATATCCAAACCTACCCGAAACTTATCCTAAATTTT1261AAAAGAATTTTCAAATTCATCCCAAACATGTTTATGTCCTTAAAAATTCATATCATTAAA1321CATATTTGGAAAAAAGGTTCAATATTGAATCTTTTCATATTTAATTTTTGATTTTTTTAA1381ATATAATGTTTTGATTCTTATTTAACAAAAGAAATAAACATTAAAGACTAAAAAATAATT1441GATGAATTTTAAAAAATAAAAATTAATACTTGAAAAAACTAAAAAACAAATTATTTTTTT1501TTTTGAAAGTTAGACAAAATGATGAATGAAGAAATTAGTTAAAATGAGAATAGGGATGGC1561AAATCACATTTTTAATATAAATTATTATTTAAAAAAAAAAGAAATAAAAAGTATATCCAA1621TCAATCCATTCGTGTTTTCCAAATTTGCATCCAAAAATCTCCACGAATCTCGTGCTGTCG1681ACATCTCTAGTGTGGATGACATCGCCATCATAACTTGAAAAGGAAAAAAAATACTATTAT1741TTTATTGATCGGGATAGGATTAGAATAAATAATACAGCCAGGTTGGAAAATGAATCCACA1801GTAGGAGGGGAAAAACGGATGATCCGTCGGGAAGTAGGTGGTGAATGCGTTTTCCTCTCT1861ATCGTTTTTTCAAACCGGAATGCTGAGGTGGCAGGTCAAGAGAGGGAATTCATATTCTGA1921AACTCAGACGGAAGCTCCTTGTATGCTTATATAAGTAGAATCACACAAGAGAAAGAGAAA1981GAGAAGAATTGTTTGCAGTGt)
  • 技术领域
    本发明涉及植物抗病、抗逆基因鉴定及基因工程技术领域,特别涉及葡萄品种黑比诺抗病、抗逆醛脱氢酶基因序列
  • 背景技术
  • 具体实施例方式
    本发明获得的抗病和抗各种非生物胁迫的葡萄品种黑比诺的ALDH2B8基因的编码区和启动子序列的具体操作步骤如下A、以拟南芥的醛脱氢酶序列和醛脱氢酶的保守结构域Pfam结构域PF00171,PS00070, PS00687, K0G2450, K0G2451, K0G2453 和 K0G2456 查询 NCBI 数据库和葡萄基因组数据库(http//WWW. genoscope. ens. fr),找到了 23个葡萄醛脱氢酶基因然后根据醛脱氢酶国际命名组织(AGNC)的标准对葡萄醛脱氢酶基因进行了命名根据这个标准,如果蛋白质的序列与以前鉴定的序列有超过40%的相似性,那么将它们归入一个家族;如果相似性超过60%,则将它们归入一个亚家族;如果相似性低于40%,则重新建立一个家族葡萄的醛脱氢酶基因被归入10个家族B、申请人从ArrayExpress和PLEXdb数据库下载了葡萄Affymetrix微列阵数据总共有17个实验可用于葡萄ALDH基因在各种病原菌侵染和非生物胁迫下的表达分析图1就是葡萄ALDH基因在各种处理下表达的Heatmap聚类分析图C、参见图2,申请人鉴定了在几乎所有病原菌侵染和非生物胁迫下都上调表达的ALDH2B8 基因为了揭示其表达特性的机理,申请人鉴定并研究了 ALDH2B8的启动子从葡萄基因组数据库中(http//WWW. genoscope. ens. fr)确定了 ALDH2B8基因的位置,然后找到了从起始密码子开始上游21Λ的启动子序列φ if A 禾1J ffi PlantCARE(http//bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/)在线程序对获得的启动子序列进行了顺式作用元件分析,发现在该序列上有很多跟植物抗逆、抗病相关的顺式作用元件(图幻,例如LTR(冷胁迫诱导响应元件),TC-rich repeats (防卫和胁迫响应元件),MBS (干旱胁迫响应元件)和Boxil (病原菌侵染和损伤响应元件)另外启动子区还发现了大量光诱导响应元件,如Β0Χ-Ι,Β0Χ4,I-box和ACE等这些元件表明ALDH2B8基因在病原菌侵染、干旱和低温等逆境条件下都会被诱导表达,极有可能对植物的抗病、抗逆性具有重要作用以下是申请人给出的具体实施例实施例1 葡萄醛脱氢酶基因家族基因的克隆及序列分析表1 葡萄品种黑比诺的ALDH家族基因的统计分析
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  • 法律状态
专利名称:葡萄品种黑比诺抗病、抗逆醛脱氢酶基因序列的制作方法醛类物质是生物体内众多重要生理生化代谢过程中存在的具有高度活性的分子。在高盐、缺水、寒冷、热刺激等环境胁迫下醛类物质也会产生。虽然不同的醛类在分子长度和烷基链存在差异,但由于其化学活性,都会对生物体系统产生毒害作用。因此清除过多的醛对于维护生物体的功能具有重要作用。植物体中存在着很多代谢途径能将醛类物质转化为活性较低的分子。其中一个很重要的途径就是在醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase,ALDH)的催化下醛不可逆的氧化为相应的羧酸。醛脱氢酶在生物体内是以一个超级家族存在。不同的ALDH之间差异很大。ALDH基因命名委员会(AGNC)已经建立起特别的标准来对醛脱氢酶进行分类。根据这个标准,如果蛋白质的序列与以前鉴定的序列有超过40%的相似性,那么将它们归入一个家族;如果相似性超过60%,则将它们归入一个亚家族;如果相似性低于40%,则重新建立一个家族。迄今为止,真核生物中的ALDHs已经被划分为超过M个家族。而植物中的 ALDHs 存在于 14 个家族ALDH2,ALDH3, ALDH5, ALDH6, ALDH7, ALDHlO, ALDHl 1,ALDHl2,ALDH18, ALDH19, ALDH21, ALDH22, ALDH23 和 ALDH24。基因芯片技术是20世纪90年代发展起来的一门新型技术,其汇集了分子生物学、微电子技术、高分子化学合成技术和计算机科学技术。1991年,Mfymatrix公司运用半导体照相平板技术,对原位合成制备的DNA芯片做了首次报道,这是世界上的第1块基因芯片。1995年,Stanford大学Brown实验室发明了第1块以玻璃为载体的基因微矩阵芯片,标志着基因芯片技术进入了广泛的生物医学研究领域。目前基因芯片技术已广泛应用于医药开发与研究、疾病诊断治疗、农作物良种选育及环境保护等多个领域。近年来,随着植物抗逆机理研究的深入,研究植物抗逆的方法也趋于完善,基因芯片因其信息量大、操作简单、可靠性好、重复性强以及可以反复利用等诸多特点。在植物抗逆过程中发挥了重要的作用。
本发明的目的在于,提供葡萄品种黑比诺抗病、抗逆醛脱氢酶基因序列。为了实现上述任务,本发明采用如下的技术解决方案葡萄品种黑比诺抗病、抗逆醛脱氢酶基因序列,其特征在于,包括葡萄黑比诺醛脱氢酶基因ALDH2B8的编码区序列和启动子序列。葡萄黑比诺醛脱氢酶基因ALDH2B8的编码区序列如下1ATGACTATTC CTAGGATCTC ATOGCTGCTC TCTCGCTCTT TCACTTCTTC TGCTTCTTCT61 GCTTTGCTTT CTTCCATAGG GAGGAATTCA TCCCGGAGGG GOGGGATCTT TAGATATAGC 121 ACTGCTGCAG TTGTTGAAGA ACCAATCAAT CCTTCTGTTA ATGTCAATTA TACTCAGCTT181 TTAATCAATG GACAATTTGT GGATGCCGCA ACGGGGAAAA CTTTTGAGAC ATTGGACCCC241 AGGACAGGGA ATGTGATTGC CAGTGTTGCT GAAGGTGAOG CAGAAGATGT TAATOGAGCT301 GTCTOGGCTG CTCGCAAGGC GTTTGATGAG GGACCATGGC CTAGGATGAG TCCTTATGAG361 AGATCCAAGA TACTCTTGCG TTTTGCTGAT TTGCTTGAAA AGCACAATGA TGAGATTGCA421 GCACTCGAGA CTTGGGATAA TGGGAAACCA TTTGAACAGG CTGCAAAGGC TGAAGTACCA481 TTGGTGATAC GTTTGATGCG GTACTATGCG GGTTGGGCAG ATAAGATTCA TGGTCTCAOG541 GTTCCTGCTG ATGGATTGCA TCAAGTGCAA ACCTTGCATG AACCCATTGG OGTTGCTGGA601 CAGATTATCC CCTGGAATTT CCCACTTCTC ATGTATGCTT GGAAGATTGG ACCTGCATTA661 GCATGTGGTA ACACTATOGT TCTAAAGACA GCAGAGCAGA CACCATTGTC TGCTTTATAT721 GCATOGAAGT TATTGCATGA GGCCGGGCTT CCTCCAGGTG TTCTAAATGT GGTTTCTGGT781 TATGGTCCAA CTGCTGGTGC AGCACTTGCC AGCCATATGG ATGTGGACAA GCTTGCTTTC841 ACTGGATCAA CTGCAACTGG AAAAATTGTA CTTCAATTGG CTGCAAGGAG CAATCTTAAG901 CCAGTGACTT TAGAGCTTGG AGGGAAATCC CCTTTCATTG TGTGTGAGGA TGCTAATGTA961 GATGAGGCTG TTGAGCTAGC CCACTTTGCT TTATTCTTTA ATCAGGGGCA ATGTTGTTGT1021 GCTGGCTCCC GTACATTTGT ACATGAAAGT ATATACGATG AGTTTGTAGA GAAGGCGAAA1081 GCACGTGCTT TAAGAOGCAC OGTTGGTGAT CCATTCAAGG CAGGCATTGA GCAAGGCCCC1141 CAGATTGATT CAGATCAATT TGAGAAGATC CTGAGATACA TAAGATCTGG TGTCGAAAAT1201 GGAGCCACCC TTGAAACOGG AGGTGAGAGA TTTGGCAAAG AGGGCTTCTT CATTAAGCCT1261 ACAGTTTTCT CTAATGTTCA GGACGGCATG TTGATAGCAC AGGACGAGAT ATTTGGACCA1321 GTGCAGTCCA TCCTGAAATT CAAGGACCTT GGTGAGGTGA TAAGAAGGGC AAACGCCACT1381 AGTTATGGGC TGGCCGCAGG AGTCTTTACC CAGAACTTAG ACACAGCCAA CACCTTGACC1441 OGOGCACTAA AGGTGGGCAC AGTATGGATT AACTGCTTTG ATGTGTTTGA TGCAGCGATT1501 CCTTTTGGTG GGTACAAGAT GAGTGGGCAT GGCAGAGAAA AGGGTATTTA CAGTCTTCAA1561 AACTACCTGC AAGTGAAGGC TGTTATTACT CCCTTGAAGA ACCCCGCGTG GTTATM。葡萄黑比诺醛脱氢酶基因ALDH2B8的启动子序列如下1CCAOGCTAGG GTTATGAAAG AGGCACCTGT AATGATGTGA CACTGAAACT GGGCCACGAA61ATATGACGTG GAACTGTTGT ATAAATTGGA ATTAGCCTTT TCCCAACTCA TTCCTCCACT121TGAAGTAAGT GGGTATCTTT ATCTTCTGTA CCTGATGACC ATTAAGAAAA AGCTTTTTTT181TTATAGCCAC AGAGATTAGC AACAATTGAT ATTTGATATG AGGTGTOGGT CAAGCACGAG241GCAGCAGCTG OGTATAGTTT TTTCCATCTC ACAAGTCCTC CTTCCCTCTT TGTCTTTTTT301ATATTCAGAA GTTAATCACA CGGCACAAAA TGTTAGAAGA AGAAAAAACT GATTTGATGG361TTGTTGGCAA AATGOGTGOG TTCGCAGAAA AATGGCAAGT TGCAGCATAA AAGGAAGCCT421CCCCATTGGG TAGGCCTTAG CAACTTGTCC TOGATTATAG CACCTCCTTG ATTAAAGCTC481CTCOGCTCAC CTTTTACTTT CTACTTCCAC ATTTTCCTTC GCTATCGCOG TCTGAATGGC541GACTCTTCTT TGAATTGGCT TTTATGCCAA CAAAGOGCAT ACGTGTTAAA AAAGAAGTCA601AATTTATTAA ATCCTAACTT TAATAAATAT ATTATTTAAA AATTATTGTC TTTGACCAAT661 OGAGTATTAC TTTTTTAATA AAATAATTCT TATCTTTAGT GCTGTCTTCA GATTCTTATT721 TTCTGTTTTT GACATGCCTA TAAAAACTTA CTTTTCTAAA TTTAAATTAA CTTCAAATCA781 TGTTTTAAAT GAAGGAAACT CTTTTTGTTA CACAATCATG TCACTCTAAA AATGGCAACT841CAATATGGATTATCCACTTACMCMTMATMGMMACTTTTATATTATATTATTTGA901ATATGATTACA0GTGATTATATTGAGATGCCAATGAGACAGACTCACATCACTTACTTTC961ATTCAAATTTACATCAATTCTCATTCATTGTMCMMMAATTAAACTATGGAATGAAC
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1921AACTCAGA0GGAAGCTCCTTGTATGCTTATATAAGTAGAATCACACAAGAGAAAGAGAAA1981 GAGAAGAATT GTTTGCAGTG本发明首次研究了葡萄品种黑比诺抗病、抗逆醛脱氢酶基因25个序列在各种病原菌侵染,干旱、高盐、低温、高温等非生物胁迫和激素诱导条件下的表达情况,从而鉴定了在几乎各种逆境胁迫下都上调表达的ALDH2B8基因。以该核苷酸序列为基础,通过挖掘葡萄基因组数据库搜寻ALDH2B8基因的上游启动子区域,获得了启动子区域21Λ的葡萄黑比诺醛脱氢酶基因ALDH2B8的启动子序列,并在启动子区域鉴定了抗病顺式作用元件box-wl,逆境胁迫元件TC-rich repearts和冷胁迫元件LTR。表明ALDH2B8基因和其启动子在葡萄抗病和非生物胁迫中起着重要作用。通过申请人的研究表明,本发明的葡萄品种黑比诺抗病、抗逆醛脱氢酶基因序列能把对生物体有毒性作用的醛类氧化成相应的羧酸,对生物体抵抗病原菌侵染和非生物胁迫有重要作用。可以将葡萄黑比诺醛脱氢酶基因ALDH2B8的编码区序列和启动子序列结合其他抗病和抗逆基因通过基因聚合技术转入感病的葡萄品种、苹果、小麦、番茄、水稻、玉米、大豆或油菜等植物,来提高抗病、抗干旱、抗盐碱和抗寒等胁迫的能力。


图1是通过分析公共葡萄芯片数据库ArrayExpress和PLEXdb研究的葡萄醛脱氢酶在病原菌诱导、非生物胁迫和激素处理等条件下的表达分析图。图2是葡萄醛脱氢酶基因ALDH2B8的启动子区域的顺势元件分析图。图3通过分析公共葡萄芯片数据库ArrayExpress和PLEXdb研究的葡萄醛脱氢酶基因的病原菌诱导表达分析图。
图4通过分析公共葡萄芯片数据库ArrayExpress和PLEXdb研究的葡萄醛脱氢酶基因的非生物胁迫下表达分析图。图5总结葡萄醛脱氢酶基因的生物胁迫、非生物胁迫和激素处理条件下对葡萄醛脱氢酶基因具有明显调节作用的处理。以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述。



本发明涉及葡萄品种黑比诺抗病、抗逆醛脱氢酶基因序列,包括葡萄黑比诺醛脱氢酶基因ALDH2B8的编码区序列和启动子序列。通过申请人的研究表明,该葡萄品种黑比诺抗病、抗逆醛脱氢酶基因序列能把对生物体有毒性作用的醛类氧化成相应的羧酸,对生物体抵抗病原菌侵染和非生物胁迫有重要作用。可以将葡萄黑比诺醛脱氢酶基因ALDH2B8的编码区序列和启动子序列结合其他抗病和抗逆基因通过基因聚合技术转入感病的葡萄品种、苹果、小麦、番茄、水稻、玉米、大豆或油菜等植物,来提高抗病、抗干旱、抗盐碱和抗寒等胁迫的能力。



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