专利名称：用于杏鲍菇遗传转化的重组质粒及其应用的制作方法杏鲍菇(Pleurotus eryngii)又名刺芹侧耳，隶属于担子菌亚门(Basidio mycotina),层菌纲(Hymenomycetes),无隔担子菌亚纲(Homobasidiomycetidae),伞菌目 (Agaricales)，侧耳科(Pleurotaceae)，侧耳属(Pleurotus)。杏鲍菇是近年来开发栽培成功、适于工厂化栽培的珍稀食用菌新品种，其风味独特、营养丰富，能够产生多种生物活性分子和酶，且其多糖具有较好的降血糖、增强肌体免疫功能、抗肿瘤和抗氧化活性，因此杏鲍菇具有很高的食用、药用、经济和生态价值，市场前景广阔。杏鲍菇在北京市场上已经占食用菌总产量的5. 01 %。杏鲍菇生长周期较长、生物转化率较低，限制了杏鲍菇及其生物活性物质的开发应用，因此基于杏鲍菇遗传发育机理的基础研究亟待加强。高效的食用菌遗传转化体系的建立是从事分子生物学和遗传学研究的基础。杏鲍菇高效遗传转化体系的建立，将为其遗传发育机理的研究奠定基础，为其分子育种提供技术支持，为新型生物反应器的研发提供储备，为杏鲍菇及其生物活性物质的开发利用提供前提条件，具有十分重要的意义。
本发明的目的是提供一种用于杏鲍菇遗传转化的重组质粒及其应用。本发明提供了一种DNA片段，自上游至下游依次包括启动子和终止子(杏鲍菇三磷酸甘油醛脱氢酶基因终止子)；所述启动子的核苷酸序列如序列表的序列1所示；所述终止子的核苷酸序列如序列表的序列2所示。所述DNA片段还包括抗性筛选基因。所述抗性筛选基因具体可为序列表的序列3 自5’末端第763-1793位核苷酸所示的hph基因。所述DNA片段可用于制备转基因杏鲍菇。含有所述DNA片段的重组质粒也属于本发明的保护范围。所述重组质粒(重组质粒甲)具体可为在PUC19质粒的多克隆位点间自上游至下游依次插入所述启动子和所述终止子得到的重组质粒。所述重组质粒优选为将PUC19质粒 Sph I和Ml I酶切识别序列之间的小片段取代为所述启动子，BamH I和Mc I酶切识别序列之间的小片段取代为所述终止子得到的重组质粒。所述重组质粒(重组质粒乙)具体还可为在以上所述重组质粒(重组质粒甲)的所述启动子和所述终止子之间插入含有外源基因的DNA片段得到的重组质粒。所述含有外源基因的DNA片段可包括所述外源基因和抗性筛选基因。所述抗性筛选基因具体可为序列表的序列3自5’末端第763-1793位核苷酸所示的hph基因。所述外源基因具体可为序列表的序列3自5’末端第1-7 位核苷酸所示的egfp基因。所述含有外源基因的DNA片段具体可为序列表的序列3所示的DNA片段。 所述重组质粒可用于制备转基因杏鲍菇。用所述重组质粒制备转基因杏鲍菇的方法可为将所述重组质粒(重组质粒乙) 转化杏鲍菇的原生质体，培育后得到转基因杏鲍菇。所述转化具体可通过PEG/CaCl2介导实现。用所述重组质粒制备转基因杏鲍菇的方法可包括如下步骤(1)用溶壁酶裂解平菇菌丝，得到原生质体；(2)将所述重组质粒导入所述原生质体，培养后得到转基因平菇。所述步骤(1)具体可为将平菇菌丝悬浮于1.5g/100mL的溶壁酶溶液，32°C、 60rpm温浴30小时，过滤并收集滤液，然后将所述滤液3000rpm离心IOmin并收集沉淀，然后将所述沉淀洗涤后悬浮于MMC缓冲液中，即为原生质体溶液。MMC缓冲液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为50mM马来酸缓冲液(pH 5. 5)；所述溶质及其在MMC缓冲液中的浓度如下0. 5M甘露醇、5mM CaCl20所述步骤( 可为将步骤(1)的原生质体和所述重组质粒在PTC缓冲液中混合均勻，依次进行冰浴和室温静置，离心收集沉淀。所述步骤⑵具体可为将70μ 1步骤⑴得到的原生质体溶液和20 μ g重组质粒 (具体可为10 μ 1 2yg μ Γ1的重组质粒溶液)震荡混勻，然后加入50 μ 1 PTC缓冲液并震荡混勻(Is X 6次)，然后冰浴25min，然后加入Iml PTC缓冲液后室温静置20min，3000rpm 离心lOmin，收集沉淀。PTC缓冲液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为IOmM Tris-HCl缓冲液(pH7. 5)；所述溶质及其在PTC缓冲液中的浓度如下0. 4g/mL PEG3350、100mM CaCl20所述培养可包括再生培养和选择性培养。所述再生培养可为先用液体再生培养基25°C静置培养M小时，然后倾注于固体再生平板(含100yg/ml潮霉素)25°C培养10-14天。所述选择性培养可为将再生培养中的单菌落转接于固体MCM平板(含100 μ g/ml 潮霉素)上25°C培养10-14天；采用相同的方法连续转接3-5代，获得纯培养的菌株。液体MCM培养基的制备方法将酵母提取物2g、胰蛋白胨2g、葡萄糖20g、硫酸镁 0. 5g、磷酸二氢钾0. 5g和磷酸氢二钾Ig溶于水并用水定容至1L。液体再生培养基的制备方法在液体MCM培养基中添加山梨醇，使其终浓度为1M。固体MCM平板在液体MCM培养基中添加琼脂，使其浓度为20g/L。固体再生平板的制备方法在液体再生培养基中添加琼脂，使其浓度为20g/L。本发明还保护序列表的序列1所示的启动子。所述启动子可以用于启动目的基因表达。所述目的基因可为序列表的序列3自5’末端第1-7 位核苷酸所示的egfp基因。 所述目的基因也可为所述egfp基因和hph基因的融合基因。所述hph基因如序列表的序列3自5’末端第763-1793位核苷酸所示。所述融合基因具体可为序列表的序列3所示的 DNA片段。所述启动子具体可在杏鲍菇中启动所述目的基因表达。本发明还保护序列表的序列2所示的终止子。本方法的转化效率可以达到119-155个转化子/ μ g DNA,并具有较好的传代稳定性。本发明所建立的杏鲍菇遗传转化方法，为杏鲍菇生长发育机理的基础研究和分子育种奠定了理论基础和技术支持，为新型生物反应器的研发提供储备，为杏鲍菇资源及其生物活性物质的开发利用开辟了广阔的应用领域。 图1为pUC19质粒的结构示意图。图2为pEGFP-Cl质粒的结构示意图。图3为重组质粒pUEGFP-hph的结构示意图。图4为阳性转化子的PCR鉴定；M=Ikb plus DNA ladder ；P 质粒pEGFP-Cl (阳性对照)；1-4:阳性转化子。图5为阳性转化子的RT-PCR鉴定；M =Ikb plus DNA ladder ； 1-4 阳性转化子。图6为荧光显微镜下观察阳性转化子的绿色荧光蛋白的表达情况；A 在放大400 倍明视野下的图像；B 在放大400倍，蓝光激发状态下的图像。
(1)参照Hirano等于2000年发表的香菇的gpd基因的全序列设计用于扩增杏鲍菇三磷酸甘油醛脱氢酶基因终止子的引物对如下Tgpd-F(上游引物)5’ -TAAGGATCCGAAAGGGCTGTGCATCTCGAACT-3’ (下划线标注 BamH I识别序列)；Tgpd-R(下游引物):5，-TCAGAGCTCTCATCATACCCCCTACCGACATCT-3，(下划线标注 Sac I识别序列)。(2)以步骤1提取的基因组DNA为模板，用Tgpd-F和Tgpd-R组成的引物对进行 PCR扩增，得至Ij PCR扩增产物(约IOOObp)。PCR体系和PCR扩增程序同步骤2的⑵。(3)回收PCR扩增产物并进行测序，测序结果表明，BamH I识别序列和Mc I识别序列之间的核苷酸序列如序列表的序列2所示。4、用限制性内切酶Sph I和Ml I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。5、用限制性内切酶Sph I和Ml I双酶切pUC19质粒(结构示意图见图1)，回收载体骨架(约2674bp)。6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒pUC19_Pgpd。7、用限制性内切酶BamH I和I双酶切步骤3的PCR扩增产物，回收酶切产物。8、用限制性内切酶BamH I和I双酶切重组质粒pUC19_Pgpd，回收载体骨架 (约 3730bp)。9、将步骤7的酶切产物和步骤8的载体骨架连接，得到重组质粒 pUC19-Pgpd-TgpcL10、根据测序结果，对重组质粒pUC19-Pgpd_Tgpd进行结构描述如下将pUC19质粒Sph I和Ml I酶切识别序列之间的小片段取代为了序列表的序列1所示的启动子，BamH I和I酶切识别序列之间的小片段取代为了序列表的序列2所示的终止子。二、重组质粒pUEGFP-hph的构建1、以pAN7-l质粒为模板，用hph-up和hph-down组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(约IOOObp)。hph-up (上游引物)5，-ACGCTCGAGCTATGAAAAAGCCTGAACTC-3’ (下划线标注 Xho I识别序列)；hph-down (下游引物)5 ’ -AATGGATCCCGGTCGGCATCTACTCTAT-3 ’ (下划线标注 BamH I识别序列)。PCR体系同步骤一的2的O)。PCR 扩增程序:95°C 5min(预变性)；30 个循环(95°C 30s, 56°C 30s, 72°C lmin)； 72V IOmin ；降至 4°C结束。回收PCR扩增产物并进行测序，测序结果表明，Bio I识别序列和BamH I识别序列之间的核苷酸序列如序列表的序列3自5’末端第763-1793位核苷酸所示。hph基因为潮霉素抗性筛选的标记基因。2、用限制性内切酶Bio I和BamH I双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。3、用限制性内切酶Ml I和BamH I双酶切pEGFP_Cl质粒(结构示意图见图2)， 回收载体骨架(约4590bp)。
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pEGFP-hph (将质 SpEGFP-Cl Sal I和BamH I酶切识别序列之间的小片段取代为序列表的序列3自5’末端第763-1793位核苷酸所示的hph基因)。5、以重组质粒pEGFP-hph为模板，用EGFP-F (上游引物)和hph-down (下游引物) 组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(EGFP-hph片段，约1700bp)。将PCR扩增产物进行测序，EGFP-hph片段的核苷酸序列如序列表的序列3所示。序列表的序列3中， 自5’末端第1-7 位核苷酸为egfp基因、第727至762位核苷酸为载体中原有的多克隆位点区域、第763-1793位核苷酸为hph基因。PCR体系同步骤一的2的⑵。EGFP-F :5，-AAGTCGACATGGTGAGCAAGGGC-3，(下划线标注I 识别序列)。PCR 扩增程序95°C 5min(预变性)；30 个循环(95°C 30s,56°C 30s, 72°C 2min)； 72°C IOmin ；降至 4°C结束。6、用限制性内切酶Ml I和BamH I双酶切步骤5的PCR扩增产物，回收酶切产物。7、用限制性内切酶Ml I和BamH I双酶切重组质粒pUC19-Pgpd_Tgpd，回收载体骨架(约4715bp)。8、将步骤6的酶切产物和步骤7的载体骨架连接，得到重组质粒pUEGFP-hph (结构示意图见图3)。实施例2、PEG/CaCl2介导的杏鲍菇原生质体转化MMC缓冲液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为50mM马来酸缓冲液(pH 5. 5)；所述溶质及其在MMC缓冲液中的浓度如下0. 5M甘露醇、5mM CaCl20液体MCM培养基将酵母提取物2g、胰蛋白胨2g、葡萄糖20g、硫酸镁0. 5g、磷酸二氢钾0. 5g和磷酸氢二钾Ig溶于水并用水定容至1L。固体MCM平板在液体MCM培养基中添加琼脂，使其浓度为20g/L。PTC缓冲液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为IOmM Tris-HCl缓冲液(pH7. 5)；所述溶质及其在PTC缓冲液中的浓度如下0. 4g/mL PEG3350、100mM CaCl20STC缓冲液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为IOmM Tris-HCl缓冲液(pH7. 5)；所述溶质及其在STC缓冲液中的浓度如下1M山梨醇、IOOmM CaCl20液体再生培养基在液体MCM培养基中添加山梨醇，使其终浓度为1M。固体再生平板的制备方法在液体再生培养基中添加琼脂，使其浓度为20g/L。一、杏鲍菇原生质体的制备1、菌丝扩大培养取杏鲍菇菌丝于液体MCM培养基中，160rpm、25°C培养4天(3_5天均可)，用3层无菌擦镜纸过滤并收集菌丝，然后用0. 6M甘露醇水溶液洗涤2-3次。2、将步骤1的杏鲍菇菌丝(约Ig)悬浮于1. 5%溶壁酶溶液(将1. 5g溶壁酶用 0. 6M甘露醇水溶液溶解并定容至IOOmL;溶壁酶购自广东碧德生物科技有限公司，产品目录号Bd_8110001023)，在水浴摇床(32°C、60rpm)中温浴30小时，用3层无菌擦镜纸过滤并收集滤液。3、将步骤2的滤液3000rpm离心IOmin并收集沉淀。4、将步骤3的沉淀用MMC缓冲液洗涤三次后，悬浮于100 μ 1 MMC缓冲液中，即为原生质体溶液。二、原生质体转化1、将90μ 1步骤一制备的原生质体溶液与10μ 1实施例1制备的重组质粒 pUEGFP-hph(2yg μ Γ1 ；即10 μ 1中共含有20 μ g重组质粒)在涡旋震荡器上震荡混勻 (18父10次)，加入5(^1 PTC缓冲液后在涡旋震荡器上震荡混勻(lsX6次)，然后冰浴 25min,然后加入Iml PTC缓冲液后室温静置20min，3000rpm离心lOmin，收集沉淀(原生质体)。2、将步骤1的原生质体用STC缓冲液洗涤两次后，悬浮于液体再生培养基中，25°C 静置培养M小时后倾注于固体再生平板(含100yg/ml潮霉素)中，25°C培养10-14天。 共倾注了 25个固体再生平板。三、阳性转化子的筛选及验证1、阳性转化子的筛选随机选取1个固体再生平板，分别挑取平板上的单菌落，转接于固体MCM平板(含 100 μ g/ml潮霉素)上25°C培养10-14天；采用相同的方法连续转接3_5代，获得纯培养的菌株，从获得的纯培养的菌株中随机选取四分之一(79个纯培养的菌株)。2、阳性转化子的PCR鉴定将步骤1获得的各个纯培养的菌株分别进行如下鉴定(1)取七日龄的菌株的菌丝，提取基因组DNA。(2)以基因组DNA为模板，用EGFP-F (上游引物)和EGFP-R(下游引物)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。EGFP-R :5，-AATTAACCATCGACTG CAGAATT-3，。PCR体系同实施例1的步骤一的2的⑵。PCR 扩增程序:95°C 5min(预变性)；30 个循环(95°C 30s, 56°C 30s, 72°C lmin)； 72V IOmin ；降至 4°C结束。部分结果见图4。egfp基因已经成功导入了菌株。3、阳性转化子的RT-PCR鉴定将步骤1获得的各个纯培养的菌株分别进行如下鉴定(1)取七日龄的菌株的菌丝，采用北京百泰克生物技术有限公司的《高纯总RNA快速提取试剂盒》提取其总RNA。(2)以步骤(1)的总 RNA 为模板，采用 MBI Ferments 公司《RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit》试剂盒进行反转录，得到cDNA。(3)将步骤(2)的cDNA作为模板，用EGFP-F(上游引物)和EGFP-R(下游引物) 组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR体系同实施例1的步骤一的2的⑵。PCR扩增程序同步骤2的⑵。部分结果见图5。在序列表的序列1所示的启动子的驱动下，egfp基因成功进行了转录。4、阳性转化子的荧光检测将步骤1获得的各个纯培养的菌株分别进行如下鉴定
挑取5-7日龄的菌株的菌丝于载玻片上，盖上盖玻片，在倒置荧光显微镜(1X71 ； Olympus, Tokyo, Japan)下用40倍目镜观察，并用DP2-BSW软件进行照相。部分结果见图6。步骤2、步骤3和步骤4同时鉴定为阳性的阳性转化子即为EGFP基因转化成功的菌株。共获得了 31株转化成功的菌株，转化率为39. 24% (31 + 79X100%)。转化效率为 31X25X4 + 20 = 155 个转化子 / μ g DNA。重复进行三次实施例2，三次的转化率分别如下38. 71%、37.96%、39. 53%。三次的转化效率分别为126个转化子/ μ g DNA、119个转化子/ μ g DNA、148个转化子/ μ g DNA。


本发明公开了一种用于杏鲍菇遗传转化的重组质粒及其应用。本发明提供了一种DNA片段，自上游至下游依次包括序列1所示启动子和序列2所示终止子。本发明还提供了含有所述DNA片段的重组质粒。本发明所建立的杏鲍菇遗传转化方法，为杏鲍菇生长发育机理的基础研究和分子育种奠定了理论基础和技术支持，为新型生物反应器的研发提供储备，为杏鲍菇资源及其生物活性物质的开发利用开辟了广阔的应用领域。