用于生产己二酸的重组质粒、基因工程菌、其制备方法及用途[0002]当今世界能源问题成为世界经济发展的瓶颈，利用生物材料等可再生资源进行物质的生产成为当今科学研究的热点。[0003]己二酸又名己烷二羧酸，是脂肪族二元酸中最有应用价值的二元酸，广泛应用于塑料、树脂、食品等领域，可用于制造尼龙、增塑剂、润滑脂、聚氨酰泡沫塑料，少量用于食品的增酸剂，以及医药、香料等方面的生产。[0004]目前己二酸的生产工艺主要采取石油路线以环己醇及其混合物为原料的硝酸氧化法，该方法使用强氧化性的硝酸，设备腐蚀严重，而且产生的N2O是引起全球变暖和臭氧减少的污染物之一，给环境造成了极大的污染。随着人们环保意识和可持续发展意识的提高，发酵法生产己二酸成了新的研究热点。一旦实现了己二酸发酵大规模生产，就可以取代石油化工产品苯及基于石油化工中间产品的多种商品，大大降低对环境的污染。己二酸发酵消耗Imol的葡萄糖，同时固定Imol的CO2,消耗温室效应气体，因此发酵法产的己二酸将是一种绿色平台化学品。然而目前发酵法生产己二酸的难度大，底物转化率低，成本偏高，因此，迫切需要寻找或构建能代谢多种廉价碳源，发酵条件简单，己二酸高产的新菌株。[0005]与乳酸、乙醇等有`机物的发酵研究相比，己二酸的发酵研究起步较晚，。综合已有文献来看，菌种研究方面，比较有应用前景的包括能够降解己二酸的产黄青霉菌、经基因改造的假单胞菌和经基因改造的大肠杆菌。其中大肠杆菌的培养条件简单，菌种本身有己二酸代谢途径，具有代谢灵活性，易于基因工程改造。对大肠杆菌己二酸代谢的研究表明，在以葡萄糖为底物的混合酸的发酵中，己二酸生成过程如下:(I)通过丁二酸合成途径，合成丁二酸，并在由葡萄糖发酵生成丁二酸的过程中固定了 C02 ;(2)在乙酰辅酶A转移酶(paaj)作用下由丁二酸生成六碳化合物3-羰基-己二酰辅酶A(3-0xoadipyl_CoA) ； (3)3-羰基-己二酰辅酶A在羟酰脱氢酶的作用下生成3-羟基-己酰辅酶A ; (4)3-羟基-己酰辅酶A脱水酶脱水形成5-羧基-2-戊烯基辅酶A ; (5)5-羧基-2-戊烯基辅酶A还原酶生成己二酰辅酶A ; (6)己二酰辅酶A在水解酶的作用下水解为己二酸。[0006]目前国内外对大肠杆菌生产己二酸的代谢网络途径改造有两种:1、表达异源的 Klebsiella pneumoniae aroZ 酶、aroY 酶和 Acinetobacter calcoaceticus catA酶；2、过量表达大肠杆菌的paaj酶、paaH酶、maoC酶、sucO)酶、异源的Clostridiumacetobutylicum bed 酶、etfA 酶和 etfB 酶。(Journal of the American ChemicalSociety, 1994，116 (1):399 ;美国专利第US2010/0330626号)第一种改造的出发点是将由葡萄代谢产生粘糠酸途径的三个酶在大肠杆菌进行异源表达；第二种改造的出发点是在大肠杆菌内过量表达经3-羟基-己酰辅酶A产己二酸代谢途径的所有酶。第一种改造的缺陷是生成的粘糠酸需要经过进一步的化学催化才能生成己二酸。第二种改造的缺陷是大肠杆菌本身产生的丁二酸的量很低，仅仅过量表达由丁二酸开始的下游基因，对己二酸的最终产量影响不大。[0007]在发明人已经获得授权的专利ZL200710121399.9中，通过将蓝藻鱼腥藻碳酸酐酶经由基因重组转入大肠杆菌对大肠杆菌的丁二酸代谢途径进行了改造，成功获得了丁二酸高产的大肠杆菌基因工程菌。这为在此基础上对大肠杆菌的己二酸代谢途径进行改造并获得己二酸高产的大肠杆菌基因工程菌提供了良好的技术基础。

[0008]为了充分利用大肠杆菌本身具有的己二酸代谢途径，同时去除不利的代谢途径，并且发挥外源基因提高二氧化碳利用率的作用，本发明将蓝藻鱼腥藻(Cyanobacteriumanabaena)碳酸酐酶(CA)基因和大肠杆菌(Escherichia coli)乙酰辅酶A转移酶paaj基因同时转入不含有丙酮酸甲酸裂解酶(Pfl酶)基因的大肠杆菌中，从而提高大肠杆菌生产
己二酸的产量。
[0009] 本发明的目的在于提供一种用于生产己二酸的重组质粒和一种己二酸高产的基因工程菌。本发明的目的还在于提供本发明的重组质粒以及基因工程菌的制备方法。本发明的目的还在于提供本发明的重组质粒以及基因工程菌用于基因工程发酵生产己二酸的用途。本发明的目的还在于提供使用本发明的基因工程菌发酵多种碳源生产己二酸的方法。
[0010]针对本发明的发明目的，本发明提供如下技术方案:
[0011]在第一方面，本发明提供了一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒携带有蓝藻鱼渥藻(Cyanobacterium anabaena)7120碳酸酐酶的基因和大肠杆菌(Escherichia coli)K12-MG1655乙酰辅酶A转移酶paaj的基因。
[0012]本发明的所述重组质粒可为PET-CAPA。
[0013]在第二方面，本发明提供了一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌通过将如权利要求1或2所述的重组质粒转入敲除丙酮酸甲醇裂解酶基因的大肠杆菌BL21 (DE3)P中获得。
[0014]本发明的所述基因工程菌可为BLPCAPA。
[0015]在第三方面，本发明提供了第一方面所述的重组质粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括:设计引物并以大肠杆菌为模板克隆获得两端带有不同限制性酶切位点的包含所述大肠杆菌乙酰辅酶A转移酶paaj的基因序列的DNA片段，将所述DNA片段和携带有所述蓝藻鱼腥藻7120碳酸酐酶的基因的质粒经所述限制性内切酶酶切并连接，其中优选地，所述引物为:PAF:CGCGGATCCCGTGAAGCCTTTATTTGTGACGG,划线处为 BamH I 酶切位点，PAR:AGGGTCGACTCAAACACGCTCCAGAATCATGG划线处为Sal I酶切位点；所述限制性内切酶为BamH I 和 Sal I 。
[0016]在第四方面，本发明提供了第二方面所述的基因工程菌株的制备方法，其特征在于，所述方法包括将如权利要求1或2中任一项所述的重组质粒转入所述敲除丙酮酸甲醇裂解酶基因的大肠杆菌BL21(DE3)P中。
[0017]在第五方面，本发明提供了第一方面所述的重组质粒在制备用于基因工程菌发酵生产己二酸的生物产品中的用途。
[0018]在第六方面，本发明提供了第二方面所述的基因工程菌在制备用于基因工程菌发酵生产己二酸的生物产品中的用途。
[0019]在第七方面，本发明提供了第二方面所述的基因工程菌发酵多种碳源生产己二酸的方法，其特征在于，所述方法包括在生长过程中生物量的积累及加入不同的诱导剂时，在完全厌氧或先有氧积累菌体量，再无氧进行酸发酵的双阶段培养而生产己二酸。
[0020]在本发明的发酵多种碳源生产己二酸的方法中，所述碳源可为葡萄糖和/或所述诱导剂可为乳糖或IPTG。
[0021]所述蓝藻鱼腥藻7120碳酸酐酶的基因序列为SEQ ID NO:1。
[0022]所述大肠杆菌K12-MG1655乙酰辅酶A转移酶paaj的基因为SEQ ID NO:2。
[0023]所述重组质粒PET-CAPA的序列为SEQ ID NO:3。
[0024]本发明产生如下的技术效果:
[0025]本发明的菌株和质粒能够提高原始大肠杆菌的己二酸产量，获得生长速率提高、具有更高己二酸产量的重组基因工程菌。
[0026]通过对比实验证明，构建出来的工程菌相对于原始菌来说，在生物量的积累速率上，在不同浓度IPTG或乳糖的诱导下以及在单纯厌氧发酵和先有氧，后无氧的双阶段发酵时己二酸产量都有很大的提高。表明这株工程菌存在着较大的应用潜力。



[0027]下面结合附图对本发明作进一步的说明。
[0028]图1是大肠杆菌产丁二酸的代谢途径。
[0029]图2是PEPC酶的三步催化反应机制及CA酶的催化反应机理示意图。
[0030]图3大肠杆菌Pfl酶敲除示意图。
[0031]图4大肠杆菌丁二酸合成己二酸代谢途径。
[0032]图5重组质粒PET-CAPA构建过程示意图。

[0033]一、培养基的配制
[0034]LB培养基成份为每升水中含有5g酵母粉，IOg胰蛋白胨和lOgNaCl。固体培养基为液体基中加入1.5%的琼脂粉。为了增加培养基的选择性，氨苄青霉素(Amp)的使用浓度是 50 μ g/ml。
[0035]二、蓝藻鱼腥藻7120总DNA的提取
[0036]用SDS-蛋白酶K裂解菌体十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀细胞碎片和多糖，再用异丙醇沉淀来提取总DNA。
[0037]I)取单菌落接种于100ml含氮培养基BGll中，在合适的温度下培养8天。
[0038]2)取20ml菌液于离心管中，13, OOOrpm离心2min,弃上清。
[0039]3)沉淀重悬于 1.0ml 0.85%NaCl 中。[0040]4)室温 13，OOOrpm 离心 2min,弃上清。
[0041]5)沉淀重悬于550 μ I IXTE中。
[0042]6)加 17 μ I 溶菌酶(3511^/1111)，371:温育 30min。
[0043]7)加 3μ1 蛋白酶 K (20mg/ml)，37°C温育 30min。
[0044]8)加 30 μ I 10% 十二烷基磺酸钠 SDS，37°C温育 30min。
[0045]9)加 100 μ I 5Μ NaCl 充分混匀。
[0046]10)加 80 μ I CTAB/NaCl 溶液，混匀，65°C水浴 lOmin。
[0047]11)加等体积(0.7-0.8ml)氯仿/异戊醇(24: 1)，轻轻振荡混匀。
[0048]12)室温，13, OOOrpm 离心 lOmin。
[0049]13)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25: 24: I)轻轻振荡混匀。
[0050]14)重复第 12)步。
[0051]15)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24: I)轻轻振荡混匀。
[0052]16)重复第 12)步。
[0053]17)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入0.6体积异丙醇，混匀后室温静置60mino
[0054]18) 20°C 13, OOOrpm 离心 20min。
[0055]19)弃上清，加500μ I 70%乙醇，轻轻颠倒数次(洗盐)。
[0056]20) 4°C 15, OOOrpm 离心 20min。
[0057]21)重复洗盐两次。
[0058]22)倒置离心管，干燥DNA沉淀l(Tl5min。
[0059]DNA沉淀溶于30 μ I I X TE缓冲液，_20°C保存备用。
[0060]三、重组质粒pET - CA的构建
[0061]CA基因的克隆
[0062]以提取的蓝藻鱼腥藻7120总DNA为模板进行PCR反应
[0063]PCR反应体系为:
[0064]ddH20 14 μ I
[0065]dNTP I μ I
[0066]缓冲液2 μ I
[0067]引物F I μ I:GGGAAGCTTATGAGTAGTAC
[0068]引物R I μ I:AGGACTCGAGTTAAATGGCTTC
[0069]模板0.5 μ I
[0070]taq 酶 0.5 μ I
[0071]PCR 反应程序为:94°C 4min
[0072]94°C 30s,45°C 30s,72°C Imin 35cycles, 72°C 5min
[0073]包含CA酶基因的DNA片段的酶切体系按如下配比组成:
[0074]