专利名称：一种烟草真空渗透直接遗传转化的方法植物细胞的遗传转化是植物遗传工程的一个关键环节。自Abel等(1986)将烟草花叶病毒(TMV)衣壳蛋白cDNA导入烟草细胞，获得抗TMV病毒的转基因烟草植株后，先后发展了许多植物遗传转化方法和技术。这些遗传转化方法和技术可以分为两大类，一是生物载体介导的遗传转化，另一类是非生物载体，即DNA直接导入的遗传转化。生物载体介导的遗传转化主要是根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens,简称农杆菌)介导的遗传转化，De Cleene和De Ley (1976)报道，有138科，588属，1193种双子叶植物和裸子植物对农杆菌敏感。虽然曾有用DNA病毒(如花椰菜花叶病毒，CaMV)和RNA病毒(如烟草花叶病毒，TMV)为生物载体转化植物细胞，但因其宿主局限和转化植株发生病症的缺陷，已不再使用病毒为生物载体转化植物细胞。农杆菌介导的遗传转化法的优点是经济、且操作技术简单，容易在一般实验室中实施；缺点是对单子叶植物不敏感，并需要在筛选培养基中加入抑制农杆菌生长的抗生素，而这些抗生素对转基因细胞的分离和生长有影响。在DNA直接导入的遗传转化中，又分为化学和物理的方法。化学方法有聚乙二醇(PEG)法(Golovkin等，1993)、脂质体法(Antonelli等，1990)、磷酸I丐共沉淀法(Hain等，1985)、多聚阳离子二甲亚讽(The polycation DMS0)技术(Antonelli 和 Stadler, 1989)和二乙基氨乙基葡聚糖(diethyl amino ethyl dextran,DEAE)方法。理论上,化学方法不受植物种类的限制，但由于化学方法使用的受体是原生质体，一般需要建立原生质体培养和再生体系，而许多植物的原生质体再生体系尚未建立，使这些方法的应用受到阻碍。虽然Naqvi等(2012)将芥菜(Brassica juncea)下胚轴浸入含有包裹pCAMBIA 1300质粒DNA的磷酸钙纳米粒子的缓冲液中，温育后筛选得到转基因植株，但制备纳米粒子的技术复杂。物理方法有微粒轰击法或基因枪法(Klein等，1987)、微量注射法(Crossway等，1986)、电击穿孔法(Fromm等，1985)、碳化娃纤维介导转化法(Kaeppler等，1992)、激光介导法(Guo等，1995)和花粉管通道法(周光宇，1978)。物理方法遗传转化的优点是不受植物种类的限制，缺点是大多数方法要求的设备昂贵，且操作技术不容易掌握；虽然其中也有不需要昂贵仪器、技术简单的方法，如电击穿孔法和花粉管通道法，但是电击穿孔法一般需要原生质体为受体，其应用也受到建立原生质体培养和再生体系的限制；花粉管通道法需要精确掌握受体的受精过程及其转化时间，迄今该方法仅仅在陆地棉遗传转化中获得成功
本发明所要解决的技术问题在于克服现有烟草(Nicotiana tabacum)遗传转化技术存在的不足，即在筛选培养转基因细胞过程中减少抑制农杆菌生长的措施，从而减少抑制农杆菌生长的抗生素对转基因细胞生长的影响；避免利用原生质体作为遗传转化的受体；减少所使用仪器的费用，使实验操作技术容易在普通实验室进行，而提出的一种烟草真空渗透直接遗传转化的方法。本发明所提供的技术方案包括以下步骤 (I)提取携带目的基因的重组pAHC25质粒将含有重组pAHC25质粒的大肠杆菌JM109接种到含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37°C、转速为190rpm的摇床上过夜培养；碱裂法提取重组pAHC25质粒DNA后，将质粒DNA溶液的浓度调整为0. 5 I. g/yl。酶切鉴定重组pAHC25质粒。(2)预培养幼叶外植体从高20cm左右的烟草盆栽苗上剪取幼叶，按常规方法进行表面消毒，将表面消毒的幼叶剪成0. 3 0. 5cm2的叶块，接种在MSl培养基(MS基本培养基中添加0. 2mg/L6-苄氨基嘌呤、0. 02mg/La-萘乙酸、3%蔗糖和0. 65%琼脂；pH为5. 6 5. 8)上，在温度26+1 °C、光照强度40001x、光周期为16小时光照和8小时黑暗的条件下预培养3 8天。 (3)准备遗传转化使用的叶外植体取预培养后的叶块，用解剖刀切取叶块边缘长3 5_、宽Imm左右的叶外植体，将20个叶外植体浸入0. 5ml、浓度为0. 5 I. 5 ii g/ ill的重组pAHC25质粒DNA溶液中。(4)真空渗透处理将幼叶外植体与重组pAHC25质粒DNA溶液放置在玻璃罩或玻璃干燥器中，用橡皮胶管将其与真空泵的真空吸气口连接；接通电源，调节负压旋钮使真空表指针移到到所需的负压刻度，在压强为80kPa 20kPa的条件下持续处理6 15分钟，然后调节负压旋钮使真空表指针回复到零位，即玻璃罩或玻璃干燥器内的气压恢复到大气压状态，在大气压状态下保持30秒，再调节负压旋钮使真空表指针移到相同的负压刻度，持续处理相同的时间，然后使玻璃罩或玻璃干燥器内的气压恢复到大气压状态。重复相同的真空渗透处理2 5次。(5)筛选培养转基因细胞、诱导抗性愈伤组织形成和植株再生将真空渗透处理后的幼叶外植体接种到MSl培养基上，黑暗条件下培养3天，然后把幼叶外植体转移到MS2筛选培养基(MSl培养基中加入I. 5mg/L草丁膦，pH为5. 6 5. 8)上，在温度26±1°C、光照强度40001x、光周期为16小时光照和8小时黑暗的条件下培养，培养初期2周内每隔3 4天继代一次，以后每隔两周继代一次；在MS筛选培养基上培养3 5周后，外植体上形成的抗草丁膦抗性的愈伤组织分化不定芽，不定芽继续生长形成试管苗。(6)提取叶总DNA和PCR扩增鉴定转基因植株用CTAB法提取再生植株的叶总DNA，以目的基因序列设计正义引物和反义引物；以叶总DNA为模板，用所设计的目的基因片段的引物进行PCR扩增，根据PCR扩增产物鉴定转基因植株。与已有技术相比，本发明具有如下优点(I)有利于转基因细胞分裂和生长。烟草真空渗透直接遗传转化的方法属于非生物载体的遗传转化方法，与农杆菌介导的遗传转化相比，不需要在筛选培养基中加入抑制农杆菌生长的抗生素，可只在MS筛选培养基中加入草丁膦，筛选转基因细胞，有利于转基因细胞的分裂和生长。(2)容易获得转基因再生植株。烟草真空渗透直接遗传转化的方法所使用的受体是离体培养的烟草组织或细胞，而不是其原生质体。与烟草原生质体培养相比，烟草叶片组织或细胞更容易诱导植株再生。因此，与化学方法导入外源DNA相比，本方法容易获转基因再生植株。(3)所需的设备简单，操作技术容易掌握。烟草真空渗透直接遗传转化的方法又可归入物理方法类。对其他物理方法诸如基因枪法、碳化硅纤维介导转化法和激光介导法来说，需要复杂和昂贵的仪器设备，如基因枪、显微镜、激光发射仪等，且操作技术不容易掌握。本方法需要的主要设备为真空泵，其价格低，容易操作，且不需要制备外源DNA微粒等复杂的技术处理。图I为Sac I和Xma I双酶切携带DFR基因的重组pAHC25质粒的产物；M =DNA分子量标记；泳道I :Sac I和Xma I双酶切重组pAHC25质粒后产生的两条DNA片段，分子量较大的片段(7892bp)是pAHC25质粒DNA片段(泳道上方)，分子量较小的片段(1054bp)是两端具有Sac I和Xma I部分碱基序列的DFR基因片段(泳道下方)图2为在MS2筛选培养基上培养45天的对照外植体(左)和真空渗透处理的外植体上形成的愈伤组织及其再生植株(右)图3为PCR扩增方法鉴定转基因植株；WT :非转基因植株；p25 :携带DFR基因的重组pAHC25质粒；H20 :反应液中无DNA模板，加入等量重蒸水；1 7 :再生植株编号，再生植株1、2、5和7具有与重组pAHC25质粒相同的388bp DNA片段，而从非转基因对照和再生植株3、4和6，以及无模板DNA的反应液中没有出现388bp DNA片段，表明再生植株1、2、5和7是转基因植株，而再生植株3、4和6是假阳性的非转基因植株；M DNA分子量标记，单位bp

采用常规碱裂法提取重组pAHC25质粒，得到纯化的重组pAHC25质粒后，用NanoVue超微量紫外分光光度计测定质粒DNA溶液的浓度，将质粒DNA溶液的浓度调整为I. O Ii g/ Ii Io在20ia酶切反应体系中，加入0 5ilg重组pAHC25质粒、15U Sac I、15U Xma I和双酶切Tango 缓冲液，37°C水浴中反应6小时。取5 yl酶切液，在含溴化乙锭的I %琼脂糖凝胶板中电泳，TAE电泳缓冲液，电压4V/cm。将琼脂糖凝胶板置于凝胶成像仪下，观察到两条大小为7892bp和1054bp的DAN片段(图I)，表明实验中使用的重组pAHC25质粒携带的目的基因是DFR基因。实施例2，烟草遗传转化(I)预培养幼叶外植体以烟草K326品种为材料，从高20cm左右的盆栽苗上剪取幼叶，用自来水洗净晾干。在超净工作台上，将叶片放入无菌烧杯中，用70%酒精浸泡叶片30秒，然后用10%次 氯酸纳溶液浸泡叶片，表面消毒6分钟，无菌水清洗5次。然后，将无菌叶片剪切成大小为
0.3 0. 5cm2的叶块，接种到MSl培养基(MS基本培养基添加0. 2mg/L 6-苄氨基嘌呤、
0.02mg/La -萘乙酸、3%蔗糖和0. 65%琼脂；pH为5. 6 5. 8)上，在温度26± 1°C、光照强度40001X、光周期为16小时光照和8小时黑暗的条件下，培养6天。(2)准备遗传转化使用的叶外植体取预培养后的叶块，用解剖刀切取叶块边缘长3 5mm、宽Imm左右的叶外植体；吸取0. 5ml、浓度为I. 0 ii g/ ill的重组pAHC25质粒DNA溶液于内径为I. 2cm的平底指形玻璃管(指形管)中，将20个叶外植体浸入质粒DNA溶液，用有透气孔的封口膜(上海稼丰园艺用品有限公司)封闭管口，将指形管放置在IOOml烧杯内。(3)真空渗透处理用橡皮胶管将AP-9925无油真空泵(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)的真空吸气管与玻璃罩下方的托盘侧面的出气管连接，将放置指形管的烧杯置于托盘中央，盖上玻璃罩。接通电源，调节负压旋钮使真空表指针移到_70kPa时(即玻璃罩内压强为30kPa)计时，持续处理lOmin，然后调节负压旋钮使真空表指针回复到零位，即玻璃罩内的气压恢复到大气压状态，在大气压状态下保持30秒；再调节负压旋钮使真空表指针移到_70kPa时计时，持续处理lOmin，然后调节负压旋钮使真空表指针回复到零位，使玻璃罩内的压强恢复到大气压状态，关闭电源。真空渗透处理重复2次。(4)筛选培养转基因细胞、诱导抗性愈伤组织形成和植株再生将真空渗透处理后的幼叶外植体接种到MSl培养基上，在温度26土 1°C的黑暗条件下培养3天，然后将幼叶外植体转移到MS2筛选培养基(MSl培养基加入I. 5mg/L草丁膦，pH为5. 6 5. 8)上，在温度26±1°C、光照强度40001x、光周期为16小时光照和8小时黑暗的条件下培养，培养初期2周内每隔3 4天继代一次，以后每隔两周继代一次；在MS2筛选基上培养3 5周后，外植体上形成的抗草丁膦抗性的愈伤组织分化不定芽，不定芽继续生长形成试管苗(图2)。根据接种外植体数和产生抗性愈伤组织的外植体数，在压强为30kPa的条件下烟草真空渗透直接遗传转化的转化率为13. 75%。实施例3，PCR扩增鉴定转基因植株(I) CTAB法提取叶片总DNA取0. 05 0. Ig再生植株叶片，置于I. 5ml离心管中，浸泡液氮后快速研磨成粉，加入0. 5ml、65°C预热的CTAB提取液，颠倒混匀，65°C水浴中提取30min ;再按照常规CTAB方法纯化DNA，最后将纯化的DNA溶于20 30 ill TE缓冲液中，取2 DNA溶液电泳，估计DNA溶液的浓度。(2) PCR 扩增以DFR基因序列设计正义引物5 ’ -AACCGCCTGACCCTCTGGAA-3 ’和反义引物5’-CGATGTTGTTCTTCTCCGCG-3’，扩增片段大小为388bp。在50 y I的PCR扩增反应体系中，加入IOOng叶总DNA或20ng重组pAHC25质粒DNA，20 P mo I/L正义和反义引物，200 u mol/L dNTP，2U DNA聚合酶和5 ill 10XDNA聚合酶反应缓冲液。PCR扩增条件为94°C预变性4分钟，然后94°C变性I分钟，55°C退火I分钟，72°C延伸2分钟，35次循环，最后在72°C下延伸10分钟。PCR扩增产物在含溴化乙锭的I. 2%琼脂糖凝胶板中电泳，TAE电泳缓冲液，电压4V/cm。电泳结果表明(图3)，再生植株1、2、5和7植株的PCR产物具有与重组pAHC25质粒一样的388bp DNA片段，表明DFR基因整合到1、2、5和7植株的基因组中，它们是转基因植株；而再生植株3、4和6的PCR产 物没有388bp DNA片段，表明它们是假阳性的非转基因植株。


本发明公开了一种烟草真空渗透直接遗传转化的方法，本方法将预培养后的烟草幼叶外植体浸入携带目的基因的pAHC25质粒DNA溶液中，进行真空渗透处理后，将叶外植体培养在含草丁膦的筛选培养基上，诱导外植体上形成的抗草丁膦抗性的愈伤组织分化不定芽，不定芽继续生长形成试管苗，利用PCR扩增方法鉴定携带目的基因的转基因植株。采用本发明提供的技术方案，可将目的基因直接导入烟草细胞，与农杆菌介导的遗传转化相比，减少了抑制农杆菌生长的措施；与聚乙二醇等化学方法的遗传转化相比，减少了从原生质体分离和培养的环节；与基因枪等物理方法的遗传转化相比，不需要昂贵的仪器设备，且操作技术简单。