癌症治疗中的免疫刺激剂细菌膜组分制作方法

C·里邦, N·科瓦伊亚, A·贝克, J－Y·邦尼福伊

2002年4月3日

2000年3月15日

1999年3月15日

皮埃尔法博赫药品公司

A61K9/107GK1343125SQ00805050

免疫刺激 癌症 组分 细菌 治疗

1.革兰氏阴性细菌膜组分在制备能够诱导抗肿瘤免疫应答的免疫刺激剂型药物组合物中的用途2.根据权利要求1的用途，其特征在于该膜组分含有肺炎克氏杆菌的膜组分3.根据权利要求1或2的用途，其特征在于该膜组分含有至少两种不同细菌菌株的膜组分4.根据权利要求1-3之一项的用途，其特征在于该膜组分是采用包括以下步骤的方法制备的a)在允许所述细菌生长的培养基中对所述细菌进行培养，然后离心所述培养物；b)如果适当的话，失活步骤a)获得的细菌沉淀中的分解酶，之后离心获得的悬浮液；c)通过在抽提溶液中对步骤a)或b)获得的沉淀进行至少一个循环的洗涤，从该沉淀中抽提并除去非膜结合蛋白质和核酸；d)在存在蛋白酶时消化步骤c)获得的膜沉淀，然后离心；e)在生理溶液和/或蒸馏水中对步骤d)获得的沉淀进行至少一个循环的洗涤；和f)超声处理步骤e)获得的沉淀5.根据权利要求1-3之一项的用途，其特征在于该膜组分是采用包括以下步骤的方法制备的a)在允许所述细菌生长的培养基中对所述细菌进行培养，之后，如果适当的话，进行离心；b)冷冻步骤a)获得的该培养基或沉淀，之后融化并干燥这些细胞；c)利用DNase从重新悬浮起来的步骤b)获得的干燥细胞中除去核酸；d)研磨步骤c)获得的细胞，然后澄清获得的悬浮液；e)在酸性介质中沉淀步骤d)获得的悬浮液，并除去沉淀；f)中和步骤e)获得的含有膜悬浮物的上清液，之后透析并浓缩该膜悬浮液；和g)对步骤f)获得的浓缩膜悬浮液进行灭菌6.根据权利要求2的用途，其特征在于该膜组分是具有SEQ ID NO.2序列的肺炎克氏杆菌P40蛋白质、其片段、或序列表现出与SEQ IDNO.2序列有至少80％的一致性百分数的蛋白质7.根据权利要求1-6之一项的用途，其特征在于该药物组合物还含有以能够提高其稳定性和/或其免疫刺激剂活性和/或其诱导抗肿瘤免疫应答的能力的形式运载所述膜组分的药剂8.根据权利要求7的用途，其特征在于所述药剂是水包油或油包水乳剂类型的9.根据权利要求7的用途，其特征在于所述药剂是脂质体、微球体或纳球体类颗粒形式，或使得所述膜组分能够以颗粒形式封装和呈递的任何结构类型的颗粒形式10.根据权利要求1-9之一项的用途，其特征在于该药物组合物还含有用于加强所述膜组分的免疫刺激剂活性和/或抗肿瘤免疫应答的药剂11. 根据权利要求10的用途，其特征在于用于加强所述膜组分的免疫刺激剂活性和/或抗肿瘤免疫应答的药剂是细胞因子12.根据权利要求10的用途，其特征在于用于加强所述膜组分的免疫刺激剂活性和/或抗肿瘤免疫应答的药剂是选自激素的调节剂13.根据权利要求10的用途，其特征在于用于加强所述膜组分的免疫刺激剂活性和/或抗肿瘤免疫应答的药剂是选自生长因子的调节剂14.根据权利要求10的用途，其特征在于用于加强所述膜组分的免疫刺激剂活性和/或抗肿瘤免疫应答的药剂是细胞化合物15.根据权利要求14的用途，其特征在于所述细胞化合物是选自DNA和RNA的核酸16.根据权利要求14的用途，其特征在于所述细胞化合物是核糖体家族的化合物17.根据权利要求14的用途，其特征在于所述细胞化合物是热休克蛋白家族的蛋白质18.根据权利要求1-17之一项的用途，用于制备旨在与抗癌治疗联合施用的药物组合物19.根据权利要求18的用途，其特征在于该抗癌治疗是化学治疗和/或放射治疗20.根据权利要求18或19的用途，用于制备旨在与抗癌治疗同时、分开或相隔一段时间施用的药物组合物21.根据权利要求20的用途，其特征在于该药物组合物通过肠道或肠道外途径施用22.根据权利要求18-21之一项的用途，其特征在于所述联合的抗癌治疗是包含蛋白酶抑制剂或具有抗血管生成活性的化合物的化学治疗23.根据权利要求1-22之一项的用途，用于预防和/或治疗癌症24.根据权利要求23的用途，用于预防和/或治疗膀胱癌、前列腺癌、结肠癌、肝癌和恶性黑素瘤25.制备革兰氏阴性细菌膜组分的方法，其特征在于它包括以下步骤a)在允许所述细菌生长的培养基中对所述细菌进行培养，然后离心所述培养物；b)如果适当的话，失活步骤a)获得的细菌沉淀中的分解酶，之后离心获得的悬浮液；c)通过在抽提溶液中对步骤a)或b)获得的沉淀进行至少一个循环的洗涤，从该沉淀中抽提并除去非膜结合蛋白质和核酸；d)在存在蛋白酶时消化步骤c)获得的膜沉淀，然后离心；e)在生理溶液和/或蒸馏水中对步骤d)获得的沉淀进行至少一个循环的洗涤；和f)超声处理步骤e)获得的沉淀26.制备革兰氏阴性细菌膜组分的方法，其特征在于它包括以下步骤a)在允许所述细菌生长的培养基中对所述细菌进行培养，之后，如果适当的话，进行离心；b)冷冻步骤a)获得的该培养基或沉淀，之后融化并干燥这些细胞；c)利用DNase从重新悬浮起来的步骤b)获得的干燥细胞中除去核酸；d)研磨步骤c)获得的细胞，然后澄清获得的悬浮液；e)在酸性介质中沉淀步骤d)获得的悬浮液，并除去沉淀；f)中和步骤e)获得的含有膜悬浮物的上清液，之后透析并浓缩该膜悬浮液；和g)对步骤f)获得的浓缩膜悬浮液进行灭菌27.根据权利要求25或26的方法，其特征在于所述革兰氏阴性细菌是肺炎克氏杆菌28.采用根据权利要求25-27之一项的方法能够获得的膜组分29.含有根据权利要求28的膜组分的药物组合物30.含有革兰氏阴性细菌，尤其是肺炎克氏杆菌，的膜组分的药物组合物，或根据权利要求29的药物组合物，其特征在于它与通过化学治疗和/或放射治疗进行的抗癌治疗相联合31.根据权利要求30的药物组合物，其特征在于它含有抗癌化合物，作为同时、分开或相隔一段时间施用的组合产品32.根据权利要求30的药物组合物，其特征在于所述抗癌化合物选自蛋白酶抑制剂或具有抗血管生成活性的化合物

本发明涉及革兰氏阴性细菌，尤其是肺炎克氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)膜组分在制备旨在尤其是用于治疗和预防癌症的免疫刺激剂型和/或能够诱导抗肿瘤免疫应答的药物组合物中的用途本发明还包含制备所述膜组分，以及含有，尤其是与抗癌化合物联合的，这些膜组分的药物组合物的方法正常细胞转化成恶性细胞是许多可能自然发生的(例如突变或基因重排)或由化学、物理或病毒剂诱导的不同事件的结果肿瘤会被免疫活性细胞，尤其是淋巴细胞、树突细胞和巨噬细胞浸润肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)起源于血液循环，并被细胞因子募集至肿瘤位置在肿瘤位置，TAMs通过糖蛋白、糖和磷脂与肿瘤细胞结合并增殖(J.Natl.Cancer Inst.1998，901583)在该处它们分泌许多促进其抗肿瘤活性的细胞因子其中最重要的是TNF-α和IL-12TNF-α的抗肿瘤活性已在小鼠实验模型中得到阐明(Beyaert R.和Fiers W.，细胞因子(Cytokines)，第24章，335-360，Academic Press，1998)，并且已在人膀胱癌的治疗中进行过测试单独地，TNF-α具有中等活性(Steinberg等，Ann.Oncol.，1992，3，741-745；欧洲泌尿学(Eur.Urol.)1992，22112)由激活的巨噬细胞产生的IL-12通过促进产生IL-2和IFN-γ的Th1型CD4+ T淋巴细胞的形成起到调节免疫应答的作用IL-12对血管发生和肿瘤退化的抑制活性是公知的，并且看来与刺激产生IP-10(干扰素可诱导的蛋白10)和MIG(IFN-γ诱导的单核因子)的IFN-γ的诱导相联(J.Natl.Cancer Inst.，1998，901583)BCG(卡介苗)治疗被用于预防某些类型膀胱癌的复发目前认为该作用机制是以细胞因子的产生为基础的早期释放炎性细胞因子(TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8)，接着产生IL-2和IFN-γ(Th1应答)，之后产生IL-4、IL-5和IL-10(Th2应答)最后，达到伴随细胞毒性群体扩增的细胞激活阶段(Patard等，Progres en Urologie，1998，8，415-421)然而，由于有时所观察到的BCG治疗效果的代价是同样更高的发病率，所以BCG治疗并非仅具有优点此外，BCG治疗存在禁忌征活动性结核(但非原初(prior)结核)、免疫抑制(HIV、移植等)、对BCG的原初系统反应(肝炎、肺炎、BCG炎症(BCGitis))、类固醇治疗而且，BCG治疗之后会出现抗性或复发肺炎克氏杆菌I145的膜组分被加入防止细菌来源的呼吸道感染的发生和复发的药物制剂组合物中，并且已经在人类中使用了20年由于此原因，所以已有足够的时间来评价该产品的无毒性以上列出的该组资料显示，目前对新的无毒性免疫刺激剂存在需求这些免疫刺激剂将在某些类型癌症的治疗中具有很大的价值令人惊奇的是，本发明作者阐明，革兰氏阴性细菌尤其是肺炎克氏杆菌的膜组分(命名为FMKp)，尤其是采用下文实施例中所述的方法获得的膜组分，具有期望的免疫刺激剂性质令人惊奇的是，发明人显示，FMKp或其主要成分之一，即称作P40的OmpA外膜蛋白(描述于专利申请WO95/27787和WO96/14415)，不仅能够刺激人血液单核的细胞(mononucleated cell)的增殖，从而显示了其免疫刺激剂活性，而且能够诱导，尤其是通过单核细胞(monocyte)诱导，参与抗肿瘤免疫应答的细胞因子TNF-α和IL-12的产生因此，本发明的主题是革兰氏阴性细菌尤其是肺炎克氏杆菌的膜组分作为免疫刺激剂型化合物和/或能够诱导抗肿瘤免疫应答的化合物的用途，或在制备免疫刺激剂型和/或能够诱导抗肿瘤免疫应答的药物组合物中的用途，而且这与所选择的体内施用方式(经肠道的或不经肠道的途径)无关在本发明中，术语“免疫刺激剂型化合物”或“免疫刺激剂型药物组合物”是指能够增强非特异免疫应答的化合物或药物组合物在本发明中，词语“能够诱导抗肿瘤免疫应答的化合物”或“能够诱导抗肿瘤免疫应答的药物组合物”是指能够尤其是增强抗癌化合物的有效性或增强抗癌治疗例如通过放射治疗进行的治疗的有效性的化合物或药物组合物本发明还涉及本发明所要求保护的用途，其特征在于该膜组分含有至少两种不同细菌菌株的膜组分在本发明中，词语“细菌的膜组分”是指从所述细菌的培养物获得的并且其制备方法至少包含了如下步骤的任何纯化或部分纯化的膜组分或提取物，该步骤是一个裂解培养后获得的该细菌的步骤，和一个从该裂解步骤后获得的总裂解物中分离含有所述细菌膜的组分，尤其是通过离心或过滤来进行分离的步骤在本发明中，当所述细菌是肺炎克氏杆菌时，词语“细菌的膜组分”还应理解为是指具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的P40蛋白，即肺炎克氏杆菌膜组分中的活性组分，或其片段根据本发明，这些膜组分可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如Haeuw J.F等(欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)255，446-454，1998)所描述的方法根据一个具体实施方案，本发明涉及本发明所要求保护的用途，其特征在于该膜组分是通过包括以下步骤的方法制备的a)在允许所述细菌生长的培养基中对所述细菌进行培养，之后离心所述培养物；b)如果适当的话，失活步骤a)获得的细菌沉淀中的分解酶，之后离心所获得的悬浮液；c)通过在抽提溶液中对步骤a)或b)中获得的沉淀进行至少一个循环的洗涤，从该沉淀中抽提并除去非膜结合的蛋白质和核酸；d)在存在蛋白水解酶的情况下消化步骤c)中获得的膜沉淀，之后离心；e)在生理溶液和/或蒸馏水中对步骤d)中获得的沉淀进行至少一个循环的洗涤；和f)超声处理步骤e)中获得的沉淀步骤b)，对步骤a)获得的细菌沉淀中的分解酶的失活，可以通过任何已知的酶失活方法，例如尤其是通过将该重新悬浮的细菌沉淀加热至优选近100℃的温度，或通过加入这些酶的活性的抑制剂，来实现步骤c)，从步骤a)或b)获得的沉淀中抽提并除去非膜结合的蛋白质和核酸，可以通过例如在抽提溶液中对该沉淀进行至少一个如下循环的洗涤来实现，即加入高渗溶液(抽提溶液)，优选摩尔浓度接近1M的盐水溶液，在足以达到期望效果的接触期之后，离心获得的悬浮液，并除去在所述离心后获得的上清液，可以将此洗涤循环重复几次步骤d)，消化步骤c)中获得的膜沉淀，可以在存在蛋白水解酶例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或任何已知的具有蛋白水解活性的酶的溶液时进行，其中反应条件、溶液的pH、反应温度和持续时间均优选调节至对于所选酶而言最佳的条件，之后进行离心，该消化循环可以采用相同的酶、相同的酶组合、或针对进行的每个消化循环而言采用不同的酶重复几次步骤e)，洗涤步骤d)中获得的沉淀，是通过将该沉淀放入生理溶液或蒸馏水中，在足够的接触期后进行离心来实现的，可以将该洗涤循环重复几次最后步骤f)，沉淀的超声处理，其目的在于尤其是破碎和匀浆步骤e)结束时获得的膜组分该超声条件(持续时间和强度)将由本领域技术人员根据例如待处理的膜组分的量来确定根据另一个具体实施方案，本发明涉及本发明所要求保护的用途，其特征在于该膜组分是通过包含以下步骤的方法制备的a)在允许所述细菌生长的培养基中对所述细菌进行培养，之后，如果适当的话，进行离心；b)冷冻步骤a)获得的该培养基或沉淀，之后融化并干燥细胞；c)利用DNase从重新悬浮起来的步骤b)获得的该干燥细胞中除去核酸；d)研磨步骤c)获得的细胞，然后澄清获得的悬浮液；e)在酸性介质中沉淀步骤d)获得的悬浮液，并除去沉淀；f)中和步骤e)获得的含有膜悬浮物的上清液，之后透析和浓缩该膜悬浮液；和g)对步骤f)获得的浓缩膜悬浮液进行灭菌该方法步骤b)中的冷冻条件当然应由本领域技术人员根据待处理的沉淀的初始量来确定，优选对于1kg干燥细胞的等同物在4℃进行至少48个小时步骤c)中，核酸的去除通过例如向浓度等同于5％干燥细胞的细胞悬浮液中加入DNase至终浓度5mg/ml来实现对步骤c)获得的细胞的研磨可以利用本领域技术人员已知的用于研磨细胞的任何系统或装置，例如压机或优选例如在Manton Gaulinet loop中研磨30分钟来进行研磨后获得的悬浮液的澄清可以利用本领域技术人员已知的用于澄清细菌细胞研磨物的任何系统或装置，例如Sharpless系统来进行步骤e)，在酸性介质中沉淀步骤d)获得的悬浮液，可以用例如乙酸来实现该沉淀之后通过例如Sharpless类系统除去沉淀，并回收上清液步骤f)包括步骤对在酸性介质中沉淀后获得的上清液进行中和、稀释、透析和浓缩最后，最后步骤包括通过例如于121℃加热约35分钟，对前面步骤获得的膜组分浓缩物灭菌本发明尤其涉及本发明所要求保护的用途，其特征在于该膜组分是具有SEQ ID NO.2序列的肺炎克氏杆菌P40蛋白，其片段，或序列表现出与SEQ ID NO.2序列有至少80％、优选90％、95％和99％的一致性百分数的同源蛋白质，其中所述片段或所述同源蛋白质能够诱导免疫刺激和/或抗肿瘤活性为了本发明的目的，术语两个核酸或氨基酸序列之间的“一致性百分数”、“一致性程度”或“一致性水平”是指在最佳比对后获得的待比较的两个序列之间一致的核苷酸或氨基酸残基的百分数，该百分数是纯粹的统计学结果，而且这两个序列之间的差异随机地分布在它们的全长范围内常规地，两个核酸或氨基酸序列之间的序列比较是在以最佳方式比对这些序列之后通过比较它们来进行的，而为了鉴定和比较局部区域的序列相似性，所述比较是通过片段或“比较窗”来进行的用于比较的序列最佳比对除了通过手工方式来进行外，还可以利用Smith和Waterman(1981)(Ad.App.Math.2482)的局部同源性算法、Neddleman和Wunsch(1970)(分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48443)的局部同源性算法、Pearson和Lipman(1988)(美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)852444)的相似性搜索方法、或应用这些算法的计算机软件(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Wisconsin遗传学软件包，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI；或比较软件包BLAST N或BLAST P)来完成两个核酸或氨基酸序列之间的一致性百分数通过比较比较窗中最佳比对的这两个序列来确定，对于这两个序列之间的最佳比对而言，在所述比较窗中待比较的核酸或氨基酸序列区域相对于参考序列可以含有添加或缺失该一致性百分数通过以下方式计算确定这两个序列之间核苷酸或氨基酸残基一致的一致位置的数目，用该一致位置数目除以比较窗中位置的总数，然后将所获结果乘以100，即获得这两个序列之间的一致性百分数例如，可以采用在网址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bls.html上可获得的BLAST程序，“BLAST 2序列”，和给出的默认参数(尤其是参数“开始空缺罚分”5，和“延伸空缺罚分”2；所选矩阵是例如由该程序提议的矩阵“BLOSUM 62”)，待比较的两个序列之间的一致性百分数可以通过该程序直接计算获得词语“P40蛋白的片段”旨在尤其是指P40蛋白氨基酸序列中所包含的、能够增加非特异性免疫应答和/或能够诱导抗肿瘤免疫应答、并且含有至少5个氨基酸、优选至少10个氨基酸、或更优选至少15个氨基酸的任何氨基酸序列片段当然，所述P40蛋白或其片段，可以通过化学合成或以重组肽的形式获得目前，制备重组肽的方法是本领域技术人员所熟知的，因此在本发明说明书中不作详细描述在可以用于产生这些重组肽的细胞中，当然应提及细菌细胞(Olins P.O.和Lee S.C.，1993，大肠杆菌中异源基因表达的最新进展(Recent advances in heterologous gene expression in E.coli)，Curr.Op.Biotechnology 4520-525)，和酵母细胞(Buckholz R.G.，1993，用于异源基因产物表达的酵母系统(Yeast Systems for theExpression of Heterologous Gene Products)，Curr.Op.Biotechnology4538-542)，以及动物细胞，尤其是哺乳动物细胞培养物(Edwards C.P.和Aruffo A.，1993，基于COS细胞的瞬时表达系统的当前应用(Currentapplications of COS cell based transient expression systems)，Curr.Op.Biotechnology 4558-563)，和其中可以采用以例如杆状病毒作为工具的方法的昆虫细胞(Luckow V.A.，1993，用于人类基因产物表达的杆状病毒系统(Baculovirus systems for the expression of human geneproducts)，Curr.Op.Biotechnology 4564-572)本发明的主题还是本发明所要求保护的用途，其特征在于该药物组合物还含有以使得可以增加其稳定性和/或其免疫刺激剂活性和/或其诱导抗肿瘤免疫应答的能力的形式运载所述膜组分的药剂，这些形式例如水包油或油包水型乳剂的形式，脂质体、微球体或纳球体(nanosphere)类的颗粒形式、或使得所述膜组分能够以颗粒形式封装和呈递的任何类型结构的颗粒形式本发明还包括本发明所要求保护的用途，其特征在于该药物组合物还含有加强所述膜组分的免疫刺激剂活性和/或抗肿瘤免疫应答的药剂用于加强所述膜组分的免疫刺激剂活性和/或抗肿瘤免疫应答的所述药剂中，优选细胞因子和细胞化合物在细胞因子中，可以提及但不限于IL-2、IL-12、IL-18、IFN-γ和IFN-α在细胞化合物中，尤其优选核酸、核糖体家族的化合物、或热休克蛋白质家族的蛋白质本发明还包括本发明所要求保护的用途，其特征在于该药物组合物还含有使得可以调节所述膜组分的免疫刺激剂活性和/或抗肿瘤应答的增强剂在使得可以调节所述膜组分的免疫刺激剂活性和/或抗肿瘤应答的所述增强剂中，优选激素和生长因子在激素中，可以提及但不限于β-hCG在生长因子中，可以提及但不限于EGF、IGF-1、IGF-2、GM-CSF和G-CSF本发明的主题还是在制备旨在联合抗癌治疗，尤其是通过化学治疗(单一或综合化学治疗)和/或放射治疗进行的抗癌治疗，一起施用的药物组合物中的本发明所要求保护的用途根据本发明，该药物组合物制剂旨在通过肠道或肠道外途径，与抗癌治疗同时，分开或相隔一段时间施用本发明还包含在制备含有抗癌活性化合物与所述膜组分的药物组合物中的本发明所要求保护的用途许多具有抗癌活性的化合物由此可以与免疫刺激剂型和/或能够诱导抗肿瘤免疫应答的所述膜组分联合在这些化合物中，可以提及尤其是，但不限于蛋白酶抑制剂或具有抗血管生成活性的化合物，例如-TIMPs等蛋白酶抑制剂；或下列具有抗血管生成活性的化合物制管张素、endostatin、MCP-1、IP-10和PF-4，以及抗VEGF、抗血管生成素、抗aFGF和抗bFGF的抗体、反义序列或肽因此，本发明涉及本发明所要求保护的用途，其特征在于所述联合的抗癌治疗是包含了蛋白酶抑制剂或具有抗血管生成活性的化合物的化学治疗本发明的主题还是在制备旨在预防或治疗癌症，尤其是膀胱癌、前列腺癌、结肠癌、肝癌或恶性黑素瘤的药物组合物中的本发明所要求保护的用途另一方面，本发明涉及制备革兰氏阴性细菌，尤其是肺炎克氏杆菌的膜组分的方法，其特征在于它包括如下步骤a)在允许所述细菌生长的培养基中对所述细菌进行培养，然后离心所述培养物；b)如果适当的话，失活步骤a)获得的细菌沉淀中的分解酶，之后离心获得的悬浮液；c)通过在抽提溶液中对步骤a)或b)获得的沉淀进行至少一个循环的洗涤，从该沉淀中抽提并除去非膜结合的蛋白质和核酸；d)在存在蛋白酶时消化步骤c)获得的膜沉淀，然后离心；e)在生理溶液和/或蒸馏水中对步骤d)获得的沉淀进行至少一个循环的洗涤；和f)超声处理步骤e)获得的沉淀本发明还包括制备革兰氏阴性细菌，尤其是肺炎克氏杆菌的膜组分的方法，其特征在于它包括如下步骤a)在允许所述细菌生长的培养基中对所述细菌进行培养，之后，如果适当的话，进行离心；b)冷冻步骤a)获得的该培养基或沉淀，之后融化并干燥这些细胞；c)利用DNase从重新悬浮起来的步骤b)获得的干燥细胞中除去核酸；d)研磨步骤c)获得的细胞，然后澄清获得的悬浮液；e)在酸性介质中沉淀步骤d)获得的悬浮液，并除去沉淀；f)中和步骤e)获得的含有膜悬浮物的上清液，之后透析并浓缩该膜悬浮液；和g)对步骤f)获得的浓缩膜悬浮液进行灭菌当然采用所述这些方法能够获得的膜组分形成了本发明的一部分采用所述方法能够获得的膜组分的蛋白聚糖，即FMKp的活性要素，的效价，当用半乳糖总含量和蛋白质总含量表示时，优选是-对于半乳糖1.2g/l-3.4g/l；-对于蛋白质7.5g/l-14.9g/l更优选地，该效价为-对于半乳糖1.8g/l-2.6g/l；-对于蛋白质9.3g/l-11.7g/l本发明还涉及含有采用本发明所要求保护的方法能够获得的膜组分的药物组合物本发明还包括含有革兰氏阴性细菌尤其是肺炎克氏杆菌的膜组分的药物组合物，其特征在于它与通过化学治疗和/或放射治疗进行的抗癌治疗相联合术语“膜组分”在本文中是指任何如上所定义的革兰氏阴性细菌的膜组分，包括那些采用本发明所要求保护的方法能够获得的膜组分，以及P40蛋白质或其片段优选地，本发明涉及本发明所要求保护的药物组合物，其特征在于它含有抗癌化合物，尤其是选自蛋白酶抑制剂或选自具有抗血管生成活性的化合物的抗癌化合物，作为同时、分开、或相隔一段时间施用的组合产品优选地，本发明所要求保护的所述药物组合物还可以含有药剂，例如载体、能够加强和/或调节以上所定义的所述膜组分的免疫刺激剂活性和/或抗肿瘤免疫应答的药剂 以下的