专利名称：一种高密度乳酸细菌悬液的制备方法乳酸细菌是动物益生菌中最具代表性的菌群，因此，在工业、农业、医药、食品、饲料等与人类生活密切相关的重要领域应用价值很高。 在乳酸细菌的广泛应用中迫切的要求是能够获得高密度的乳酸细菌悬液，目前采用的方法是菌体先经液体培养基培养后(其中乳酸细菌数量一般为108cfu/ml)，必须采用高速离心或微孔滤膜过滤的方法收集菌体(因为细菌菌体很小，一般为O.几-一几个um)，最后再将收集的菌体悬浮于液体中，以获得高密度的菌悬液。而高速离心或微孔滤膜过滤的设备复杂昂贵、操作要求高、使用成本高、应用受限。 目前获得微生物高密度悬液的方法主要是采用高速离心法和微孔滤膜过滤法。其操作过程是先将菌体置于液体培养基中培养，待菌体数量增加至最高时(一般为108cfu/ml)，再将菌体以3500-10000r/min高速离心或以小于0.几 一-几个um孔径的微孔滤膜过滤，收集菌体，再将收集的菌体洗涤，并悬浮于液体中，以获得高密度的菌悬液。由于细菌菌体很小(一般为O.几-一几个um)，收集菌体时必须采用高速离心或微孔滤膜过滤，其操作要求高、设备复杂昂贵，使用成本高，应用受限。 微生物固定化技术及其应用已日渐成熟，目前，国内外有关乳酸菌固定化方面的研究报道主要集中于载体选择、包埋方法优化、包埋后菌体的保存、包埋菌体抗逆性、以及用包埋的菌体生产各类发酵产品的工艺技术等方面，这些研究的关键不在于载体中的菌数能达到多高。
本发明的目的在于克服上述现有技术不足，提供一种高密度乳酸细菌悬液的制备方法，该方法制备高密度乳酸细菌悬液，简便、易行、设备要求低，易规模化推广应用，市场前景广阔。 本发明的技术方案是这样实现的 (1)菌种活化将乳酸细菌以0. 5-5ml/100ml的接种量接入MRS液体培养基中，35°C _451:培养12-24小时后，即得活化的乳酸细菌菌种； (2)菌体包埋将2-4g/100ml的海藻酸钠溶液，经118°C _121°C 15_25min灭菌后与上述活化的乳酸细菌菌种液以0.5-2 : l体积比混合，即得混合液，然后滴加到已灭菌的0. 1M CaCl2溶液中，固化0. 5-1小时后，即可形成包埋好的乳酸菌载体颗粒，将此载体颗粒滤出，并用无菌水冲洗，即可得到包埋好的直径2-3mm的球形乳酸菌载体颗粒。 (3)载体培养将包埋好的直径2-3mm的球形乳酸菌载体颗粒，以6% (g/100ml)的接种量接入到加有1% (g/100ml)CaC03的灭菌牛奶中，35。C -45。C 100-150r/min培养12-24后，滤出载体，并用无菌水冲洗。3 (4)菌体释放将用无菌水冲洗后的载体置于0. 5-2% (g/100ml)柠檬酸钠溶液 中，35t:-45t: 100-150r/min 0. 5-2小时后，即可获得高密度乳酸细菌悬液(乳酸细菌数量 可达10"cfu/ml)。 本发明采用的方法是先将乳酸细菌包埋在海藻酸钙载体中；然后将此载体置于含 0.5-2g CaC03/100ml的牛奶中培养，让乳酸细菌在载体中生长繁殖(载体中乳酸细菌数量 可达10"cfu/g);最后将载体置于0. 5-2g/100ml柠檬酸钠溶液中，即可获得高密度乳酸细 菌悬液(乳酸细菌数量可达10"cfu/ml)。 其优点是(l)包埋后的菌体限于在载体中增殖，且乳酸细菌属于厌氧细菌，在培 养包埋菌体的过程中不需要像培养包埋的好氧微生物那样解决供氧的问题，培养过程比较 简单；(2)培养液中加入了 1%的&0)3，这样可以维持载体的机械强度，防止培养过程中产 生的乳酸与维持载体形态的Ca2+结合而使载体破裂溶解，且CaC03可以与乳酸结合以降低 乳酸浓度过高对菌体的抑制作用；(3)乳酸细菌在载体中生长，载体颗粒较大，培养后极易 从培养液中滤出，从而可取代高速离心或微孔滤膜过滤方法；(4)将载体置于1%柠檬酸钠 溶液中，即可获得高密度的乳酸细菌悬液(乳酸细菌数量可达10"cfu/ml)。—种高密度乳酸细菌悬液的制备方法是指采用此方法通过常规的微生物固定化
和微生物培养方法即可获得浓度很高的乳酸细菌悬液(可达10"cfu/mL)，不需要采用复杂
昂贵的离心或过滤设备，因此该发明方法易规模化推广应用，市场前景广阔。 乳酸细菌是动物益生菌中最具代表性的菌群，因此，在工业、农业、医药、食品、饲
料等与人类生活密切相关的重要领域应用价值很高。由于乳酸细菌为益生菌，所以其众多
加工产品中乳酸细菌数量的高低已成为评价其产品优劣的重要标志。因此，在乳酸细菌的
广泛应用中迫切的要求是能够获得高密度的乳酸细菌悬液。 本发明包括以下步骤 (1)菌种活化将乳酸细菌以0. 5-5ml/100ml的接种量接入MRS液体培养基中， 35°C _451:培养12-24小时后，即得活化的乳酸细菌菌种； (2)菌体包埋将2-4g/100ml的海藻酸钠溶液，经118°C _121°C ， 15_25min灭菌后 与上述活化的乳酸细菌菌种液以0.5-2 : l体积比混合，即得混合液，然后滴加到已灭菌的 0. 1M CaCl2溶液中，固化0. 5-1小时后，即可形成包埋好的乳酸菌载体颗粒，将此载体颗粒 滤出，并用无菌水冲洗，即可得到包埋好的直径2-3mm的球形乳酸菌载体颗粒；
(3)载体培养将包埋好的直径2-3mm的球形乳酸菌载体颗粒，以6% (g/100ml) 的接种量接入到加有1% (g/100ml)CaC03的灭菌牛奶中，35。C -45。C 100-150r/min培养 12-24后，滤出载体，并用无菌水冲洗； (4)菌体释放将用无菌水冲洗后的载体置于0. 5-2% (g/100ml)柠檬酸钠溶液
中，35t: _45°C 100-150r/min 0. 5_2小时后，即可获得高密度乳酸细菌悬液。 本发明方法的创新点在于不采用高速离心或微孔滤膜过滤方法收集菌体，而是借
鉴微生物固定化技术，将乳酸细菌包埋在载体中，并通过培养基的选择和培养条件的优化，
让乳酸细菌限于在载体中高密度生长繁殖；同时通过包埋载体的选择，使得该载体能根据
需要在不同条件下处于凝胶状态或溶液状态，这是最后能否获得高密度乳酸细菌悬液的关键。 菌体包埋本发明选择的包埋载体物质为海藻酸盐，其中海藻酸钠为溶液状态，海 藻酸钙为凝胶状态。海藻酸盐所形成的凝胶为离子型凝胶，包埋菌体时通常是在海藻酸钠 中加入二价离子，如Ca2+，通过Ca2+取代Na+来形成凝胶网络；但如果载体中的Ca2+被Na+取 代之后，其凝胶网络被破坏，载体就会被溶解，变成溶液状态。海藻酸钙作为一种天然高分 子凝胶载体，具有固化、成型方便、对无毒、网络空隙多、固定化细胞密度高等优点。本发明 就是根据海藻酸盐的特性，将2-4g/100ml的海藻酸钠溶液，经118°C _121°C 15_25min灭菌 后与活化的乳酸细菌菌种液以0.5-2 : 1体积比混合，得到0.5-2%的海藻酸钠与乳酸菌的 混合液，然后滴加到已灭菌的0. 1M CaCl2溶液中，固化0. 5-1小时后，即可形成包埋好的乳 酸菌载体颗粒，将此载体颗粒滤出，并用无菌水冲洗，即可得到包埋好的直径2-3mm的球形 乳酸菌载体颗粒。 载体培养本发明选择的载体培养基为鲜牛奶中加入1% CaC(V其目的有三个 ①维持载体的机械强度。海藻酸盐所形成的凝胶为离子型凝胶，海藻酸钙载体中的&2+是 形成凝胶网格的必要条件，对凝胶的机械强度有较大的影响，但培养过程中乳酸细菌产生 的代谢物乳酸能与Ca2+结合，就会与海藻酸盐和Ca2+的结合发生竞争，使载体的机械强度 减弱，导致载体变软或溶解，加入的CaC03可以维持培养液中的Ca2+浓度以维持载体的机械 强度，防止载体变软或溶解导致载体中菌体泄漏或损失；②中和乳酸细菌产生的代谢物乳 酸对菌体的抑制作用。培养乳酸细菌的过程中会产生大量的乳酸，使培养液的PH值急剧降 低，影响菌体的增殖，而加入的&0)3可以与乳酸反应，中和乳酸，降低其对乳酸细菌生长的 抑制作用。③降低氧的传递。因为乳酸菌属于微需氧菌或厌氧菌，乳酸菌在包埋载体中培 养生长，可以阻断部分氧，降低氧的传递速率，更利于菌体的生长。 菌体释放海藻酸钙载体中的Ca2+被Na+取代后，其凝胶网络被破坏，载体就会被 溶解。因此，将培养后的载体海藻酸钙凝胶，置于1%的柠檬酸钠溶液中，其&2+被柠檬酸钠 中的Na+取代，海藻酸钙凝胶即可变为海藻酸钠溶液，即溶解于1 %的柠檬酸钠溶液中，从而 可把包埋在载体中的菌体释放出来，即可获得高密度的乳酸细菌悬液(可达10"cfu/mL)。 同时，由于乳酸菌集中在载体中生长，载体颗粒较大(2-3mm)，培养结束时，很容易从培养液 中滤出，不需要进行高速离心或微孔滤膜过滤即可获得高密度的乳酸细菌悬液。因此，操作 简便、易行、设备要求低，易规模化推广应用。


本发明公开了一种高密度乳酸细菌悬液的制备方法，该方法是先将乳酸细菌包埋在海藻酸钙载体中；然后将此载体置于含0.5-2g CaCO3/100ml的牛奶中培养，让乳酸细菌在载体中生长繁殖(载体中乳酸细菌数量可达1011cfu/g)；最后将载体置于0.5-2g/100ml柠檬酸钠溶液中，即可获得高密度乳酸细菌悬液(乳酸细菌数量可达1011cfu/ml)。该方法操作简便、易行、设备要求低，易规模化推广应用。