专利名称：一种快速分离辣椒疫霉菌的方法及其专用培养基的制作方法辣椒疫病是辣椒最重要的真菌性病害，在辣椒的整个生育周期内都可发病，除危害辣椒的根、茎、枝、叶和果实外，还危害番茄、茄子、黄瓜、甜瓜等作物，常引起大面积死株，一般田块死株率为20% 30%，严重的达90%以上，可造成毁灭性损失，并在各种植区均有发生，高温、高湿地区尤其猖獗，局部地区危害严重，减产率严重的高达60%，严重影响到农民的经济收益和辣椒产业的发展。辣椒疫病是由疫霉属(Phytophthora)卵菌，辣椒疫霉菌力ora capsiciLeonian)引起的辣椒病害。表现为叶水渍斑、幼苗猝倒、根茎腐、冠腐、枝干、果实溃疡和腐烂等，植株受害部位产生边缘不明显的黑褐色水渍状病斑，可迅速引起病部的坏死和腐烂，潮湿时，病部尤其是叶背面产生疏松的白色霉层，即病菌的孢囊梗和孢子囊。在对辣椒疫病的研究中，首先需对病原菌进行分离和培养，现有技术采用病茎处理分离培养方法存在所用时间长，分离到的菌株率低(61. 82%)，且易受杂菌污染，费工费时等问题。研究出新的简便快速的分离方法是提高辣椒疫病基础研究的重要环节，也是本领域急待解决的一个技术问题。本发明人历经3年，做了大量的试验研究，发明了一种快速分离辣椒病霉菌的方法及专用培养基，用于辣椒疫病的基础研究。
本发明要解决的技术问题是克服现有辣椒疫霉菌的分离培养过程中分离率低、费工费时的技术问题，其目的是提供一种经济、简易、快捷，且分离率高的一种快速分离辣椒疫霉菌的方法及其对辣椒疫霉菌分离培养效率高的专用培养基。为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下1、一种快速分离辣椒疫霉菌的方法，按以下步骤进行(1)病样编号分离前将采集辣椒植株上感染了辣椒疫病的病茎或病叶按不同采样的地点、品种进行编号；(2)病样切取将编号后的病茎，以病样的病部与健康部的交界处为中心，切取病健部分共长度为9 Ilcm的病样，并使病样中病部组织的长度和健康部组织的长度各占病样长度的1/2，用自来水清洗后晾干表面水分；(3)病样消毒将上述切取的病样用质量分数为75%酒精喷雾，再用质量分数为1%次氯酸钠液浸泡30秒，用无菌水清洗后晾干水分；(4)专用培养基的配制将蒸馏水1000ml、黑麦60g、蔗糖20g和琼脂18g混合制成基本培养基，将所述的基本培养基高压灭菌后冷至40 50°C时，加入IOmg的利福平和IOOmg剂型为70%五氯硝基苯粉剂，摇勻，即制成所述的专用培养基，然后倒入灭菌培养皿中备用；(5)无菌操作室分离将步骤(3)的病样在无菌操作台内进行剪取分离培养，先剪去该病茎的四周，再以病样的病部与健康部的交界处为中心，剪成长度为0. 4 0. 5cm的病茎块，并使每块病茎中病部组织的长度和健康部组织的长度各占病茎块长度的1/2，再用镊子将所剪的0. 4 0. 5cm病样接入步骤(4)配制的专用培养基中，每皿接入5块病样，放在20°C恒温箱中培养，3-5天后长出辣椒疫霉菌菌丝再进行转接纯化。2、一种分离培养辣椒疫霉菌的专用培养基，通过下述方法制备得到
将蒸馏水1000ml、黑麦60g、蔗糖20g和琼脂18g混合制成基本培养基，将所述的基本培养基高压灭菌后冷至40 50°C时，加入IOmg的利福平和IOOmg剂型为70%五氯硝基苯粉剂，摇勻即制成所述的专用培养基。本发明的原理及其有益效果
本发明通过实验研究发现常规分离方法在病样切取和病样分离培养时均采用小块病茎(0. 5cm)，在消毒的过程中，如果消毒过重、病块太小，消毒药剂易渗透到病样的内部，不但杀死了病样表面的杂菌，也杀死了病样内部需要分离和培养的疫霉菌，使疫霉菌难以培养，因此分离率较低；另外，如消毒不够，在切取时伤口带有杂菌等没有消毒干净，分离易受杂菌感染，难以分离纯化；如果切取病样晾干后放置时间过长，周围伤口收缩，难以分离出来疫霉菌。本发明方法采用大块处理，小块分离的操作，先切取大块病样(9 Ilcm长病茎)、适宜的消毒时间，病样晾干并即在无菌操作台内将消毒处理的大块病样切成小块病样(0. 4 0. 5cm长病茎)随即接种入培养基，使在消毒的过程中，消毒药剂难于渗透到病样的内部，只能杀死病样表面的杂菌，疫霉菌很好的保存在组织内，在无菌操作台内的操作使新伤口具有纯度的辣椒疫霉菌，疫霉菌就能很好的生长起来，提高了分离培养率，在加之本发明适宜的专用培养基，使本发明的辣椒疫霉菌的分离率平均达到81. 99%，比对照方法分离率平均提高32. 6% ；(对照处理方法分离率平均为61. 82%)，分离用时平均仅需31. 6分钟，分离时间比对照处理方法平均缩短了 31. 7分钟(对照处理方法分离用时平均63. 3分钟)，分离时间平均缩短50. 1%，效果特别显著，并且操作简便易行，易被同领域技术人员掌握。

(1)病样的采集和编号
本实施例作10个病样，采样地是云南省玉溪市澄江县，品种为本地辣椒。编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 ；病样材料均为新鲜病茎，各病样处理设3次重复，每次重复4皿，每皿接5块病样，共60块即总接种点数为60。(2)病样切取将编号后的病茎，以病样的病部与健康部的交界处为中心线，切取病健部分共长度为9 Ilcm的病样，并使病样中病部组织的长度和健康部组织的长度各占病样长度的1/2，用自来水清洗后晾干表面水分。(3)病样消毒将上述切取病样用质量分数为75%酒精喷雾，再用质量分数为1%次氯酸钠液浸泡30秒，用无菌水清洗后晾干水分。
(4)专用培养基的配制
将蒸馏水1000ml、黑麦60g、蔗糖20g和琼脂18g混合制成基本培养基，将所述的基本培养基高压灭菌后冷至40 50°C时，加入IOmg的利福平和IOOmg剂型为70%五氯硝基苯粉剂，轻轻摇勻，即制成所述的专用培养基，然后倒入灭菌培养皿中备用。(5)无菌操作室分离
将步骤(3)消毒晾干的的病样在无菌操作台内进行剪取分离培养，先剪去该病茎的四周，再以病样的病部与健康部的交界处为中心，剪成长度为0. 4 0. 5cm的病茎块，并使每块病茎中病部组织的长度和健康部组织的长度各占病茎块长度的1/2，再用镊子将所剪的0. 4 0. 5cm病样接入步骤(4)配制的专用培养基中，每皿接入5块病样，放在20°C恒温箱中培养，3-5天后长出辣椒疫霉菌菌丝再进行转接纯化。对照采用常规方法，病样材料及编号与实施例1相同，其中切取的病样与分离培养的病样均是0. 4 0. 5cm病样。计算公式
分离率=(辣椒疫霉菌落数/总接种点数)X100%
表1 本发明方法与对照辣椒疫霉菌的分萬试验效巢比较
本細(^mm,小躲对照( ! 的小麵分萬耗时(分钟〉病mm小 mm本发明比样菌落数(个)分离率菌落数(个)分萬对照分离本发对照本发明总接辣椒(%)总接辣椒率(%)率提高明方比对照号种点疫霉菌菌种点疫蕃菌(%)法缩短时数落数数菌落^fc间H、1605083. 3603253. 3303565302604778. 3604066. ？11.630582B3604676-7603253. 323.42360324605083. 3603558. 3253165345605085604168. 316.73671356604168.3803456. 11.63268367604981.760396516.73064348605388. 3604473. 3153258369605591.7604168. 323. 428583010605083.360335528.3346632.平- 均81.9961.8220.1731.663. 331·
从表1表明，本发明的大块消毒处理，小块分离方法处理的疫霉菌分离率平均达到81. 99%，而对照(常规方法的小块消毒处理，小块分离)处理的疫霉菌分离率平均为61. 82%，比对照平均提高了 32. 6% ；分离时间平均缩短31. 7分钟(对照处理平均需63. 3分钟)，分离时间平均缩短了 50. 1%,效果特别显著，并且操作简便易行。


本发明提供一种快速分离辣椒疫霉菌的方法及其专用培养基，属植物病理学研究技术领域。该分离方法由病样处理、消毒、培养基配制等步骤组成。病样选用新鲜采集的病茎，以病样的病部与健康部分的交界处为中心，取9～11cm的病样组织，用自来水清洗后晾干表面水分，用75%酒精均匀喷雾，再用1%次氯酸钠液浸泡30秒后用无菌水清洗，晾干后在无菌操作台内将该大块消毒处理的病样剪成小块，利用专用培养基进行分离培养。本发明方法使辣椒疫霉菌的分离率平均达到81.99%，比常规(小块消毒处理，小块分离)处理方法分离率平均提高32.6%；分离用时平均仅需31.6分钟，分离时间平均缩短50.1%，并且操作简便易行。