专利名称：一种发酵乳多联发酵剂的制备方法及其产品的制作方法益生菌(Probiotic) —词起源于希腊语，意思是“专管生命”，是指通过机体免疫和粘膜免疫途径或改善宿主肠道的微生态平衡而对宿主显示保健效果的活的微生物。益生菌具有优良的功能性质。研究表明，益生菌可以调节人体肠道菌群平衡，增加肠道内益生菌的数量，治疗肠道菌群失调；促进人体对食物的消化吸收；提高机体免疫力，增进人体免疫功能；吸附致癌物及减少粪便中致癌突变物的浓度和某些酶的活性，抑制和减缓肿瘤的发病率；降低人体内毒素水平、帮助肝细胞生长而起到保护肝脏的作用；益生菌发酵产物(含菌体)具有抗高血压和(或)调节血脂浓度、降低血清中与低密度脂蛋白相结合的胆固醇的水平的功能，益生菌发酵还可以产生多种对人体健康有益的生理活性小肽。此外益生菌还可通过束缚抗原、破坏抗原而减轻过敏反应症状，并且提高机体抗氧化能力而有助于延缓衰老。由于益生菌具有优良的功能特性，并且牛乳与益生菌具有良好的相容性而成为益生菌的最佳天然载体。因此，益生菌乳制品成为世界各国科研机构和乳业公司的研究和产品开发热点。世界各国都投入了大量的人力、物力进行研究和开发，筛选了许多具有自主知识产权的益生菌菌株，其中一些益生菌发酵乳制品已经成功的推向市场。如芬兰Valio公司开发的L. GG,法国达能公司开发的L. casei Immunitas,法国罗地亚公司开发的L. acidophilus NCFM,日本Yakult公司开发的L. casei Shirota,日本雪印公司的 L. acidophilus SBT-2062,日本明治乳业开发的L. G21,丹麦汉森公司的L. acidophilus LA-I 和 LA-2,加拿大 Urex 公司的 L. rhamnasus GR-I,瑞士雀巢的 L. johnsonii Lal 和Ljl，德国Biogaia的L. reuteri SD2112、丽2，光明乳业股份有限公司的具降高血压功能的 Lactobacillus casei LC2W(EP1642963B1)、降血脂功能的 Lactobacillus casei BD-II (US Patent 7270994),降血清胆固醇功能的 Lactobacillus plantarum ST-III (ZL200410066891. 7、ZL03116377. 7)，内蒙古农业大学的 Lactobacillus casei Zhang 等。总体来看，在全球含益生菌的新产品中，益生发酵乳和益生菌饮料所占比例高达74.5%，年增长在30%左右。我国乳酸菌发酵食品市场发展迅猛，目前产业规模已经超过200亿元人民币，产量突破160万吨，发酵乳制品产销量年增长速度更是超过 25%，而且在今后相当长的时间内仍然会保持这一增长趋势。随着我国社会整体消费水平的提高，人们越来越关注食品的功能性，益生菌由于其优良的功能特性也越来越为消费者熟知和接受，含有益生菌的发酵乳制品的市场份额也呈逐年递增之势。因此，特别是具有一定生理功能的益生菌乳制品将是益生菌一个非常重要的发展方向。为此国外的发酵剂生产企业也开发了一些多菌种复合发酵剂，如Hansen公司的含有嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)的 AB 酸奶发酵剂；含有嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的 ABT 酸奶发酵剂；含有嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) 和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)的 ABY 酸奶发酵剂；Danisc0公司推出的YO-MIX发酵剂等。这些复合发酵剂产品的价格是常规发酵剂的数倍，许多国内企业还是选择以嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)作为基础发酵剂，再另选I 2株单株益生菌发酵剂添加。在制备复合发酵剂的方法中较为常用的是采用单株冻干菌粉进行混合，但是易造成批次间性能不稳定和后续污染。直投式发酵剂(DVS)以其高浓度、高活力以及稳定的生产性能(产香性、产粘性及产酸性等)而备受发酵乳制品生厂商的青睐。我国发酵乳制品行业直投式发酵剂市场长期为国外发酵剂公司所垄断，益生菌发酵剂市场更是为国外公司所完全占有。但值得庆幸的是，为打破我国发酵剂的市场被国外公司垄断的局面，自上世纪九十年代，国内高校和企业对益生菌的选育及产业化投入了大量的人力物力进行技术攻关，已经拥有了一些自主知识产权的专利菌种并掌握了乳酸菌发酵剂生产关键核心技术。由于国内的乳酸菌发酵剂处于刚刚起步的阶段，其产品形态也主要采用国外主流冻干菌粉形式，若菌株和制备方法上没有突破和创新，国内乳酸菌发酵剂市场又将陷入同质化和低价竞争的不利局面。因此开发并制备发酵乳多联乳酸菌发酵剂，对于国内直投式发酵剂企业而言，是一条差异化发展之路。
本发明针对国内发酵乳直投式发酵剂与国外发酵剂同质化严重的现象，以及国内发酵乳生产企业主要采用嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)作为基础发酵剂,在此基础上再另添加I 2株单株益生菌发酵剂制备发酵乳所引起的产品批次不稳定的技术问题，提供了一种发酵乳多联乳酸菌发酵剂的制备方法及其制得的发酵乳多联乳酸菌发酵剂。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案如下。本发明采取的技术方案之一是一种发酵乳多联乳酸菌发酵剂的制备方法，其中所述方法包括以下步骤(I)将需要组合的菌种种子液分别接入扩培培养基经二 三次扩培；(2)将步骤(I)所得的料液分别进行离心回收沉淀；(3)将步骤(2)所得的离心沉淀分别用无菌水洗涤并重新悬浮；(4)将步骤(3)所得的各重悬菌液与含有冻干保护剂的灭菌脱脂乳溶液按比例混合均匀；(5)将步骤(4)所得的料液进行真空冷冻干燥即可。本发明所述技术方案步骤(I)是将需要组合的菌种种子液分别接入扩培培养基经二 三次扩培。其中所述的乳酸菌菌种较佳地包括嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus),和一种或几种益生菌。其中所述益生菌(Probiotics)是指能以活菌状态到达胃肠道，通过调节肠道菌群组成，发挥对人体或动物健康起促进作用的单一或特定微生物的混合物益生菌及其代谢产物，包括双歧杆菌；部分革兰氏阳性球菌(如粪链球菌，乳球菌，中介链球菌等)；以及一些酵母菌等。本发明所述益生菌更佳地包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum ST-111, CGMCC No. 0847)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei BD-IIjCGMCC No. 0825)和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei LC2W, CGMCC No. 0828)中的一种或几种。其中所述的二 三次扩培是指将保存在一定介质中，处于休眠状态的生产菌种接入无菌培养基活化后，经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养，最终获得一定数量和质量的纯种微生物的过程，这些纯种培养物称为种子。本发明较佳地选用斜面培养基保藏的菌种；其中所述的扩培培养基，较佳地是MRS、M17或灭菌脱脂乳，扩培培养基更佳地是无菌脱脂乳。 培养条件较佳地为PH 6. 2 6. 8，发酵罐顶部充入氮气进行厌氧培养，接种量为I 5% (v/v)，发酵温度30 45°C，发酵时间6 24h，更佳地培养条件为接种量为体积百分比 2 3%，发酵温度32 44°C，发酵时间8 16h。本发明所述技术方案步骤(2)是将步骤(I)所得的料液进行离心并回收沉淀。其中较佳的离心条件为1500 5000g，离心时间是10 20min。本发明所述技术方案步骤(3)是将步骤(2)所得的离心沉淀分别进行无菌水洗涤，并重新悬浮。所述无菌水较佳地为无菌软水，所述无菌水的各项指标较佳地为有机物含量< 8mg/kg、污染物指数< 3、二氧化娃< 5mg/kg、#< O. 5mg/kgj|i< O. 5mg/kg, 其中所述无菌水洗涤方法较佳地为洗涤I 3次，各菌体重悬浓度较佳的为I. OXlO11 9.0X10ncfu/mL。本发明所述技术方案步骤(4)是将步骤(3)所得的各重悬菌液与含有冻干保护剂的灭菌脱脂乳溶液按比例混合均匀。其中所述组合重悬菌液中活菌数比例较佳地为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)菌数比例控制在I : I 1000 : I,每株益生菌与保加利亚乳杆菌菌数比例控制在I : I 10 : 1，所述的重悬菌液与含有冻干保护剂的灭菌脱脂乳混合比例为I : I 9 I。本发明所述的冻干保护剂较佳地包括蔗糖、乳糖、乳清粉和海藻糖中的一种或几种，所述的冻干保护剂在灭菌脱脂乳水溶液中较佳的含量为I 10%。其中所述的含有冻干保护剂的灭菌脱脂乳水溶液固形物较佳地含量为10 20%，上述百分比均为质量百分比。本发明所述技术方案步骤(5)是将步骤(4)所得的料液进行真空冷冻干燥。其中所述真空冷冻干燥，较佳地冷冻条件是板层极限温度< -60°C，冷阱极限温度-70°C，板层装料厚度0. 5 2. 0mm，真空度10 30Pa。本发明采取的技术方案之二是上述方法制得的发酵乳多联乳酸菌发酵剂。其中所述多联乳酸菌发酵剂较佳地为直投式发酵剂。本发明采取的技术方案之三是上述发酵乳多联乳酸菌发酵剂在制备发酵乳制品中的用途。其中所述的发酵乳多联乳酸菌发酵剂更佳地是作为直投式发酵剂在制备发酵乳制品中的应用。在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下本发明提供了一种发酵乳多联乳酸菌发酵剂的制备方法，采用该方法制备的发酵乳直投式发酵剂除了含有嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)这两种酸奶发酵所需的乳酸菌,还含有I 3株益生菌。 本发明制得的多联乳酸菌发酵剂同采用多型号、多菌种发酵剂共同发酵或采用单株冻干菌粉混合制得的多联发酵剂发酵的传统发酵方法相比具有更均匀、批次间产品性能更稳定， 使用更方便等优点。
本发明公开了一种发酵乳多联乳酸菌发酵剂的制备方法及其制得的发酵剂，所述的多联乳酸菌发酵剂为含有保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和益生菌的多联发酵剂。所述发酵剂制备方法包括下列步骤(1)将所需菌种二～三次扩培；(2)离心沉淀菌体；(3)无菌水洗涤并重悬；(4)将各菌悬液按比例与含有冻干保护剂的灭菌脱脂乳混合均匀；(5)真空冷冻干燥，制得多联乳酸菌发酵剂。采用该方法制备的发酵乳乳酸菌发酵剂可以实现益生菌菌种与发酵乳常规菌种(保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)的复合，相比常规方法制得的发酵剂而言，该产品使用方便、批次间产品更加稳定；同时避免发酵剂产品同质化现象，从而提升产品竞争力。