专利名称：一种白藜芦醇生物转化菌种筛选、菌种鉴定及利用该菌种进行白藜芦醇生物转化的方法白藜芦醇作为天然活性物，在自然界中含量低，而白藜芦醇与葡萄糖结合的糖甙类物质——白藜芦醇苷，则含量较高，研究有效提高白藜芦醇产量的途径具有重要的产业化意义。都建立等建立一种化学合成方法，白藜芦醇的总收率41.9%，仅三步就成功的合成了白藜芦醇(都建立，邹永，肖春芬.白藜芦醇的简便合成.精细化工，2009，26 (6)580-584)。丁刘刚等改进了 Wittig反应，产率可65. 3% (丁刘刚，晏日安，黄雪松等.白藜芦醇合成过程中双键形成方法的研究.现代食品科技，2007，23 (I) :48-49)。Moro等以重氮盐为离去基团用3步反应合成白藜芦醇，总收率达72% (Moro. et al. 2008)。虽然化学合成白藜芦醇的方法取得了较大的进展，但是所有的方法都存在着，合成成本高，污染大，产品安全性差等问题，均有待进一步改进。生物转化与化学催化相比，具有选择性及专一性强，催化效率高，反应过程条件温，应用范围广，绿色，天然等多项优点，生物转化中使用的是天然生物催化剂，包括微生物、植物、动物及其酶都是可再生的，并且使用后易被降解。从白藜芦醇转化菌种的筛选出发，获得具产有转化能力的菌种，并对其进行较准确的鉴定，保证其安全性，具有重要意义。
为克服上述缺点，本发明提供一种能高效将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇的菌种的筛选方法及菌种鉴定方法，还提供一种利用为该菌种进行白藜芦醇生物转化的方法，可以有效提高虎杖中白藜芦醇类似物的转化率，具有高效、安全及低成本的特点。为达到上述目的，本发明的实施方案为一种白藜芦醇生物转化菌种的筛选方法，包括以下步骤I)取打碎的虎杖置于烧杯中，向其中加入去离子水，料液重量体积比为lg/2ml，静置24h，得虎杖浸出液；2)取富集培养基分装至若干个三角烧瓶中，分别标号并加入虎杖浸出液20 iiL，封口于28°C、避光、200r/min下震荡培养4d后，采用TLC方法检测，得出转化效率最高的培养液；3)将转化效率最高的培养液于筛选培养基上做梯度稀释涂板，于28°C下培养，然后观察是否有能形成水解圈的菌种长出，挑出单菌落重复操作，48h后观察水解圈形成情况；4)取水解圈培养基，用甲醇提取，水解圈培养基/甲醇=lg/10ml，稀释后进行TLC分析，并对白藜芦醇生成的提取物进行HPLC分析，观察白藜芦醇生成情况，根据得到的水解圈及白藜芦醇生成情况得到具有高转化能力的菌种S-4。步骤2)中，所述富集培养基由以下方法制得a)称取硝酸钠0. 3g，磷酸氢二钾0. lg，MgSO4 *7H200. 05g，氯化钾0. 05g，硫酸亚铁0.OOlg于容量瓶，蒸馏水定容至IOOmL,即得基础培养基；b)将无菌白藜芦醇苷IOOmg加入基础培养基中，制得富集培养基。c)在步骤a)所得基础培养基中添加基础培养基重量I. 5%的琼脂固定，使用前加热溶解，冷却至50°C时称取无菌白藜芦醇苷IOOmg加入其中，充分混匀，即得筛选培养基。上述步骤中，所述无菌白藜芦醇苷是在无菌工作环境下将白藜芦醇苷加入无菌乙醇中，自然挥干所得，白藜芦醇苷无菌乙醇=0.5g 10ml。上述菌种S-4的鉴定方法包括以下步骤I)菌种的形态学观察，将PDA固体培养，察氏固体培养基倒平板，冷凝后用接种钩挑取菌丝少许，点接于平板，30°C培养箱中倒置培养48h以上，观察菌落形成的过程和形态；2)用水浸片法制片,在干净的载波片中央滴加一滴乳酸石炭酸蓝棉液,用解剖针从菌落边缘划取菌丝体一小块，放入乳酸石炭酸蓝棉液中，盖上盖玻片，在显微镜下观察菌株的菌丝有无横隔、足细胞，观察孢子的形状大小和着生方式及其孢子梗；3)参照真菌提取试剂盒附带提取方法操作提取菌种基因组DNA，配制好PCR扩增体系，然后在PCR仪上进行扩增，完成后经I %琼脂糖凝胶电泳后，观察与拍摄结果； 4)将得到的菌株ITS序列用GenBank中的Blast程序与数据库中的其它菌株进行比较分析，得出相似性。本发明的菌种鉴定为卡门培尔青霉。利用上述菌种转化白藜芦醇类似物为白藜芦醇的工艺，包括以下步骤I)取打碎的虎杖置于烧杯中，向其中加入去离子，料液重量体积比为lg/2ml，静置16-24h得虎杖浸出液；2)另取PDA培养基装容器中，加入虎杖浸出液，封口，得虎杖苷溶液；3)将菌液加入虎杖苷溶液中，菌液和虎杖苷溶液的体积比为0. 5 1，封口于28°C、避光、200r/min下震荡培养4d。采用高效液相色谱分析表明，该菌种的培养液具有很强的催化能力，能将白藜芦醇苷完全转化为白藜芦醇。同时菌株利用生成的葡萄糖作为碳源，不具有催化能力的菌种会在生长过程中慢慢消亡。选培养基。(3)白藜芦醇与白藜芦醇苷TLC与HPLC检测方法 标准品采用甲醇稀释5倍后，于展开剂为氯仿丙酮无水乙醇水=4 4 0. 5 0.2的TLC条件下测定Rf值。采用色谱条件迪马C18钻石柱(200 X 4. 6mm)；检测波长306nm;流动相A(0.05%磷酸水溶液)，B(乙腈)，A B = 65 35 ;流速ImL/min ;进样体积lOiiL。同时，使用外标法建立标准曲线，建立白藜芦醇与白藜芦醇苷同时检测的有效条件。(4)菌种的筛选取打碎的虎杖10. Og置于烧杯中，向其中加入20mL去离子，静置24h，得虎杖浸出液备用。另取富集培养基分装至5个三角烧瓶中，分别标号并加入虎杖浸出液20y L，封口于28°C、避光、200r/min下震荡培养4d后，采用TLC方法检测。将转化效率最高的培养液于筛选培养基上做梯度稀释涂板，于28°C下培养，然后观察是否有能形成水解圈的菌种长出，挑出单菌落重复操作，48h后观察水解圈形成情况。取水解圈培养基，用刀片切出lg，用IOmL甲醇提取后，稀释后进行TLC分析，并对白藜芦醇生成的提取物进行HPLC分析，观察白藜芦醇生成情况。根据得到水解圈及白藜芦醇生成情况得到具有高转化能力的菌种S-4。实施例2 :白藜芦醇生物转化菌种的鉴定方法。对待鉴定菌种S-4分别进行形态学观察及分子生物学鉴定，具体方法是I)菌种的形态学观察，将PDA固体培养，察氏固体培养基倒平板，冷凝后用接种钩挑取菌丝少许，点接于平板，30°C培养箱中倒置培养48h以上，观察菌落形成的过程和形态；2)用水浸片法制片,在干净的载波片中央滴加一滴乳酸石炭酸蓝棉液,用解剖针从菌落边缘划取菌丝体一小块，放入乳酸石炭酸蓝棉液中，盖上盖玻片，在显微镜下观察。观察菌株的菌丝有无横隔、足细胞，观察孢子的形状大小和着生方式及其孢子梗；3)参照真菌提取试剂盒附带提取方法操作提取菌种基因组DNA。按照表I所示配制好PCR扩增体系，然后在PCR仪上进行扩增。完成后经I %琼脂糖凝胶电泳后，观察与拍摄结果； 表I菌种18SrDNA片段PCR扩增体系
一种白藜芦醇生物转化菌种筛选、菌种鉴定及进行白藜芦醇生物转化的方法，筛选方法是将富集培养基加入虎杖浸出液中，封口于28℃、避光、200r/min下震荡培养4d后，将得出转化效率最高的培养液于筛选培养基上做梯度稀释涂板，于28℃下培养，得水解圈培养基，用甲醇提取，经TLC分析和HPLC分析，得到具有高转化能力的菌种S-4。经鉴定，该菌种为卡门培尔青霉。该菌种的培养液具有很强的催化能力，能将白藜芦醇苷完全转化为白藜芦醇，同时菌株利用生成的葡萄糖作为碳源，不具有催化能力的菌种会在生长过程中慢慢消亡。本发明为白藜芦醇的高效、安全及低成本的生产具有重要的意义。