专利名称：一种阻断乙肝病毒表达的方法 乙型肝炎由乙肝病毒(HBV)感染引起，是病毒感染性疾病中最普遍的一种，是一种世界性分布的疾病。在东南亚和非洲部分地区感染率高达20％，估计世界范围内有2-3亿的HBV携带者。慢性HBV在成人中有1-10％的发病率，儿童中更高，在HBeAg阳性的母亲所生的婴儿中感染率为100％。HBV是一种直径为42nm小型嗜肝DNA病毒(hepatotropic DNA virus)，由外面的包被和核心组成。表面抗原是HBV包被的主要成分，并作为诊断HBV感染的主要指标。HBV病毒的核心由核心抗原(HBcAg)、DNA聚合酶/反转录酶和病毒基因组组成。HBV基因组大小为3,200bp，其部分基因及其编码产物如表1所示。表1、HBV基因组部分基因及其编码产物 乙肝病毒(HBV)的感染是导致慢性肝炎、肝硬化并转化为肝癌的主要原因。对HBV感染的研究已经比较深入，这包括针对HBV急性和慢性感染的研究。目前在某些病人中对HBV感染的治疗方法主要是用干扰素-α和-β，或与合成的抗病毒药物或其它药物合用，也可用基因疗法。但是不同病人(包括急性和慢性乙肝病人)来源的HBV的基因组有较大程度的突变，这种基因差异给乙肝病毒的治疗带来了很大的困难。最近几年新兴的、特别是在哺乳动物抗病毒研究中应用的RNA干扰(RNAi)技术能高效阻断某个特定基因的表达，其研究成果，如对阻断HIV表达方面的研究(Lee，N，S.，Dohjima，T.，Bauer，G.，Li，H.，Li，M.J.，Ehsani，A.，Dalvaterra，P.and Rossi，J.(2002)Nature Biotechnology，19，500-505)，和另一类导致肝硬化的HCV的研究(Kapadia，S.B.，Brideau-Andersen，A.and Chisari，F.V.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100，2014-2018)等已经在RNAi领域引起了巨大反响。RNAi最初是在植物、线虫(Caenorhabditis elegans)和果蝇(Drosophila)中发现的一种抗病毒的机制，即转录后的基因沉默机制(PTGS)。它是由双链RNA(dsRNA)诱导出的现象。在这个过程中，1)dsRNA被一种类似于RNaseIII的酶(被称作Dicer)切成21-23nt(nucleotide)的双链RNA即siRNA(Cullen，B.R.(2002)Nat.Immunol.3，597-599；Hannon，G.J.(2002)Nature 418，244-251；Tuschl，T.(2001)Chembiochem 2，239-245；Sharp，P.A.(2001)Genes Dev.15，485-490；Moss，E.G.(2001)Curr.Biol.11，R772-R775)；2)这些siRNA小分子与一种蛋白质复合物，也被称为RNA-诱导的沉默复合物(RNA induced silencing complex，RISC)特异性结合；3)RISC直接结合于与此siRNA核酸序列同源的mRNA部位上(例如HBV转录后形成的mRNA上)；4)目的mRNA在与21-23nt同源部分的中间被切断，从而降解而失去功能(Cullen，B.R.(2002)Nat.Immunol.3，597-599；Hannon，G.J.(2002)Nature 418，244-251；Tuschl，T.(2001)Chembiochem 2，239-245；Sharp，P.A.(2001)Genes Dev.15，485-490；Moss，E.G.(2001)Curr.Biol.11，R772-R775)。RNAi作用的最大特点是它非常专一的抑制与其序列同源的基因序列，而对其它无关序列毫无影响。近年来，RNAi技术正在广泛地应用于特别是由于病毒引起的疾病，被称为“一种全新的、激动人心的新技术”(Song，E.，Lee，S.K.，Wang，J.，Ince，N.，Ouyang，N，Min，J.，Chen，J.，Shankar，P.，and Lieberman，J.(2003)Nature Medicine；10.1038/nm828)。RNAi在动物体中同样存在(Cullen，B.R.(2002)Nat.Immunol.3，597-599；Yu，J.Y.，DeRuiter，S.L.and Turner，D.L.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，6047-6052；Brummelkamp，T.R.，Bernards，R.and Agami，R.(2002)Science 296，550-553；Sui，G.，Soohoo，C.，Affarel，B.，Gay，F.，Y.andForrester，W.C.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，5515-5520)，例如它可以阻断HCV(hepatitis C virus)，HIV-1(human immunodeficiency virus-1)，FHV(flock house virus)，Rous sarcoma virus，dengue virus和poliovirus等病毒的表达(Kapadia，S.B.，Brideau-Andersen，A.and Chisari，F.V.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100，2014-2018)，但这些病毒多是RNA病毒，而HBV是双链DNA病毒。


本发明的目的是提供一种阻断乙肝病毒表达的方法。
本发明提供的阻断乙肝病毒表达的方法是使用RNAi技术阻断乙肝病毒HBV在人肝细胞中的表达。
本发明提供了四组siDNA序列1)siDNA-1SEQ ID № I(正义链1a)5’GGCTGCTATGCCTCATCTTCTA 3’SEQ ID № II(反义链1b)5’AGCTTAGAAGATGAGGCATAGCAGCC 3’SEQ ID № III(正义链2a)5’AGCTTAGAAGATGAGGCATAGCAGCCCTTTTTG 3’SEQ ID № IV(反义链2b)5’AATTCAAAAAGGGCTGCTATGCCTCATCTTCTA 3’2)siDNA-2SEQ ID № V(正义链1a)5’GGCCTATGGGAGTGGGCCTCAA 3’SEQ ID № VI(反义链1b)5’AGCTTTGAGGCCCACTCCCATAGGCC 3’SEQ ID № VII (正义链2a)5’AGCTTTGAGGCCCACTCCCATAGGCCCTTTTTG 3’SEQ ID № VIII(反义链2b)5’AATTCAAAAAGGGCCTATGGGAGTGGGCCTCAA 3’3)siDNA-3SEQ ID № IX(正义链1a)5’GGAAGCCTCCAAGCTGTGCCTA 3’SEQ ID № X(反义链1b)5’AGCTTAGGCACAGCTTGGAGGCTTCC 3’SEQ ID № XI(正义链2a)5’AGCTTAGGCACAGCTTGGAGGCTTCCCTTTTTG 3’SEQ ID № XII(反义链2b)5’AATTCAAAAAGGGAAGCCTCCAAGCTGTGCCTA 3’4)siDNA-4SEQ ID № XIII(正义链1a)5’GGAAGAAGAACTCCCTCGCCTA 3’SEQ ID № XIV(反义链1b)5’AGCTTAGGCGAGGGAGTTCTTCTTCC 3’SEQ ID № XV(正义链2a)5’AGCTTAGGCGAGGGAGTTCTTCTTCCCTTTTTG 3’SEQ ID № XVI(反义链2b)5’AATTCAAAAAGGGAAGAAGAACTCCCTCGCCTA 3’包含上述四组DNA的质粒及细胞系均属于本发明的保护范围。具体的质粒为siDNA-1，-2，-3和-4-pBS/U6-GFP。
质粒siDNA-1，-2，-3和-4-pBS/U6-GFP的通用结构如图2所示。
质粒siDNA-1，-2，-3和-4-pBS/U6-GFP的构建方法为分别将siDNA-1、siDNA-2、siDNA-3、siDNA-4的正义链1a/反义链1b和正义链2a/反义链2b之间由设计在序列中的HindIII酶切位点连接，连接后的片断分别插入到pBS/U6质粒中的ApaI和EcoRI的酶切位点之间。GFP(绿色荧光蛋白，green fluorescence protein)片断插入到siDNA的3’末端的SmaI位点上。
本发明提供了四种siDNA核苷酸序列，并在质粒pBS/U6的基础上，将质粒改造为可表达GFP的质粒，与共转染相比，可以作为更好的siDNA转染标记。
本发明筛选的含有siDNA的稳定细胞系将对用RNAi技术治疗HBV感染的下一步研究提供不可缺少的实验材料，也属于本发明的保护范围。并将在乙肝病毒的治疗中起到重要作用。


图1用于克隆siDNA的pBS/U6质粒图谱图2质粒siDNA-1，-2，-3和-4-pBS/U6-GFP的通用结构图谱图3为经过FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting)对含有荧光-siDNA的HepG2.2.15细胞分离后的可见光和荧光显微镜观察4为经过不同siDNA转染的细胞所产生的HBV表面抗原的相对浓度与时间的关系曲线图5为不同细胞所产生的HBV表面抗原的相对浓度直方图
材料细胞及质粒1、质粒的构建是以E.coli DH5α为宿主进行的；2、HBV阳性细胞系为HepG2.2.15；3、用于克隆siDNA的质粒为pBS/U6，其图谱见附图1；4、GFP(绿色荧光蛋白，green fluorescence protein)cassette是从InvitrogenLife Technology的pCR3.1-Uni中克隆出来，它包括GFP的功能区(753bp)及其两侧的从PCMV到“BGH polyadenylation”之间的1739bp，同时在GFP序列前添加了NLS(nucleic-location-site)序列区。
实施例1、siDNA(small interfering DNA)的设计从GenBankTM得到不同来源的HBV的DNA序列共计19套，其GenBankTM序号见表2表2、用于设计siDNA的HBV序列(GenBankTM序号)


对上述19套HBV的DNA序列进行同源性分析，以其共有的保守区(长度大于19nt)设计siDNA。共设计了4套siDNA，设计原则为1、天然U6启动子，包含3个G，转录从此起始，这三个G在RNAi构建中被改造，作为siRNA的一部分。在pBS/U6载体中，在U6启动子后，紧跟着一个ApaI(GGGCCC)位点。用ApaI对pBS/U6载体酶切消化，用Klenow或T4-DNA聚合酶切成平端，还留下一个G，因此为了将2个G放回去，第一个oligo(oligo 1a)应该以“GG”开始，第二个oligo(即互补的oligo 1b)应该以“CC”结束。
2、在第二对oligo中，oligo 2a应该有“CCC”，“CCC”后应该是“TTTTT”(用于Pol III转录终止)和一个EcoR I酶切位点(用于将oligo亚克隆到载体中)。在oligo 2b中，需要有“GGG”和EcoR I酶切位点。
3、在两对oligo之间，用HindIII来连接，因此所有四个oligo都需要有HindIII识别序列。
4、确定所设计的oligo中没有EcoR I位点和Hind III位点，如果有，选择其它酶切位点来进行亚克隆。下面是用来构建各个RNAi载体的oligo的格式Oligo 1a 5’GG….A 3’Oligo 1b 3’CC….TTCGA 5’Oligo 2a 5’AGCTT….CCC TTTTT G 3’
Oligo 2b 3’A….GGG AAAAA CTTAA 5’其中Oligo 1a，1b反向互补，Oligo 2a，2b反向互补；1a和2b的基因组DNA(与需阻断的基因组内同源的序列)相同，2a和1b的基因组DNA的序列相同。这样最终得到的siDNA，是一个完全的反向重复，转录出来的这个RNA将折叠成发卡结构，可以很好地作为siRNA起作用。用于设计siDNA的HBV保守序列如表3所示表3、用于设计siDNA的HBV保守序列

*P聚合酶1-1626(P-1)and 2310-3215(P-2)；HBsAg表面抗原(LHBS，MHBS，HBsAg)1-838 and 2851-3215；HBeAgCore1817-2455；X-protein1377-1841。数字表示核苷酸在基因组中的位置。
所设计的siDNA为1)siDNA-1SEQ ID № I(正义链1a)5’GGCTGCTATGCCTCATCTTCTA 3’SEQ ID № II(反义链1b)5’AGCTTAGAAGATGAGGCATAGCAGCC 3’SEQ ID № III(正义链2a)5’AGCTTAGAAGATGAGGCATAGCAGCCCTTTTTG 3’SEQ ID № IV(反义链2b)5’AATTCAAAAAGGGCTGCTATGCCTCATCTTCTA 3’2)siDNA-2SEQ ID № V(正义链1a)5’GGCCTATGGGAGTGGGCCTCAA 3’SEQ ID № VI(反义链1b)5’AGCTTTGAGGCCCACTCCCATAGGCC 3’SEQ ID № VII(正义链2a)5’AGCTTTGAGGCCCACTCCCATAGGCCCTTTTTG 3’SEQ ID № VIII(反义链2b)5’AATTCAAAAAGGGCCTATGGGAGTGGGCCTCAA 3’3)siDNA-3SEQ ID № IX(正义链1a)5’GGAAGCCTCCAAGCTGTGCCTA 3’SEQ ID № X(反义链1b)5’AGCTTAGGCACAGCTTGGAGGCTTCC 3’SEQ ID № XI(正义链2a)5’AGCTTAGGCACAGCTTGGAGGCTTCCCTTTTTG 3’SEQ ID № XII(反义链2b)5’AATTCAAAAAGGGAAGCCTCCAAGCTGTGCCTA 3’4)siDNA-4SEQ ID № XIII(正义链1a)5’GGAAGAAGAACTCCCTCGCCTA 3’
SEQ ID № XIV(反义链1b)5’AGCTTAGGCGAGGGAGTTCTTCTTCC 3’SEQ ID № XV(正义链2a)5’AGCTTAGGCGAGGGAGTTCTTCTTCCC TTTTTG 3’SEQ ID № XVI(反义链2b)5’AATTCAAAAAGGGAAGAAGAACTCCCTCGCCTA 3’实施例2、质粒的构建分别将siDNA-1、siDNA-2、siDNA-3、siDNA-4的正义链1a/反义链1b和正义链2a/反义链2b之间由设计在序列中的HindIII酶切位点连接，连接后的片断插入到pBS/U6质粒中的ApaI和EcoRI的酶切位点之间。GFP(绿色荧光蛋白，greenfluorescence protein)片断插入到siDNA的3’末端的SmaI位点上，经过DNA序列测定，证明所克隆的siDNA片断已经正确插入，可用于转染人肝细胞系HepG2.2.15(质粒的结构见附图2)。用于质粒克隆的宿主为E.coliDH5α，培养基为添加0.1g/lAmpicillin(青霉素(Sigma))的LB培养基。
实施例3、siDNA-pBS/U6-GFP的转染1.HBV阳性的人肝细胞系HepG2.2.15用添加10％FBS的DMEM(GIBCO)高糖培养基，在含5％CO2的37℃培养箱中静置培养。
2.siDNA-pBS/U6-GFP质粒转染是用Effectene Transfection Reagent(QIAGEN)试剂盒完成的，具体操作如下(1)转染前24小时在含10％血清(FBS)的DMEM培养基的六孔板上接种约0.5-2×105个HBV阳性的人肝细胞系HepG2.2.15细胞，37℃培养至转染前；(2)转染前观察细胞生长正常，并且密度在40-80％饱和度之间；(3)在1.5ml离心管中将0.4μg siDNA-pBS/U6-GFP质粒DNA(浓度不低于0.1μg/μl)用pH7-8的TE溶解，加入Buffer EC至终体积100μl，加入3.2μl Enhancer，振荡器振荡1秒钟；(4)室温(15-25℃)放置2-5分钟，稍加离心，将管壁上的液滴甩下来；(5)加入10μl Effectene Transfection Reagent，用移液枪上下吹吸5次；(6)室温放置5-10分钟以形成转染复合体；(7)在放置5-10分钟期间，将6孔板中阳性的人肝细胞系HepG2.2.15细胞培养上清液吸去，用2ml PBS洗细胞一次，加入1.6ml新鲜培养基；(8)加入600μl培养基到转染复合体中，用移液枪上下吹吸2次，将转染复合物迅速滴加到六孔板的细胞上，轻轻混合均匀，37℃继续培养；(9)如果出现细胞毒性，在转染后6-18小时弃去培养基，用PBS冲洗一次，换上新鲜培养基。
实施例4、FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting)分选细胞和荧光观察转染前后的细胞用LEICA MPS60(Solms，Germany)荧光显微镜观察并采集图像。经转染的细胞在荧光显微镜下可见明显的绿色荧光。经过siDNA-pBS/U6-GFP转染的HepG2.2.15细胞经48h培养后用FACSDiva仪器(Becton Dickinson Bioscience，IOWA，USA)分离带有GFP荧光的细胞(即带有siDNA的细胞)并收集起来，继续培养。结果如图3所示，表明FACS技术可有效地将带有GFP(即带有siDNA)的细胞分选出来。
实施例5、经过不同siDNA转染的细胞所产生的HBV表面抗原的相对浓度与时间的关系以HBV阳性的人肝细胞系HepG2.2.15和只含pBS/U6-GFP(不含siDNA)质粒的HBV阳性的人肝细胞系HepG2.2.15细胞作为对照细胞。用含有不同siDNA的质粒转染HBV阳性的人肝细胞系HepG2.2.15细胞，经过48h培养后，根据细胞是否含有荧光，用FACS技术将含有荧光的细胞分离并收集起来，继续培养，同时与培养的对照细胞一起，在不同的培养时间，取培养上清液，用“乙肝表面抗原测定试剂盒S-01”(英科新创，厦门，中国)根据厂家提供的ELISA方法测定上清液中的HBV表面抗原HBsAg含量，以测定不同siRNA对HBV表达的抑制程度。
结果如图4所示，表明不同细胞所产生的HBsAg的量，随着培养时间的延长而增高。其中两个对照细胞HBV阳性的人肝细胞系HepG2.2.15和只含pBS/U6(不含siDNA)质粒的HBV阳性的人肝细胞系HepG2.2.15细胞所产生的sAg增高程度相近，并且作为对照，计算siRNA的抑制率；而经不同siDNA(siDNA-1，-2和-4)--pBS/U6-GFP转染的细胞与对照细胞相比，产生HBsAg的速度明显减慢，产生量也有不同程度的明显下降。这说明了不同siRNA对HBV表面抗原的表达有不同程度的抑制作用。图4中，所标的时间是经FACS分离后细胞培养的时间；HepG2.2.15是未经过任何质粒转染的、HBV阳性的稳定细胞系；pBS/U6是不含有siDNA的、经过pBS/U6-GFP转染的HepG2.2.15细胞；siRNA-1，-2，-4分别代表经过siDNA-1，-2和-4-pBS/U6-GFP质粒转染的HepG2.2.15细胞。
实施例6、不同siRNA对HBV表面抗原表达的抑制效率用不同siDNA转染的HepG2.2.15细胞、经FACS分离后培养120h，用FACS技术将含有荧光的细胞收集起来，与培养120h的HBV阳性的人肝细胞系HepG2.2.15和培养120h的只含pBS/U6(不含siDNA)质粒的HBV阳性的人肝细胞系HepG2.2.15细胞共同测量HBV表面抗原HBsAg含量，测定方法同实施例5。结果如图5所示，图中，HepG2.2.15是未经过任何质粒转染的、HBV阳性的稳定细胞系；pBS/U6是不含有siDNA的、经过pBS/U6-GFP转染的HepG2.2.15细胞；siRNA-1，-2，-3，-4分别代表经过siDNA-1，-2，-3和-4-pBS/U6-GFP质粒转染的HepG2.2.15细胞。
图5的结果如表4所示，表明，siRNA-1对HBV表面抗原的抑制率可达80％，其次为siRNA-3为60％；siRNA-2和-4也分别对HBsAg的产生有明显的抑制作用，其抑制率分别为21.9％和39％。其中以不含siDNA的、经pBS/U6-GFP转染的细胞作为对照。
表4、不同siRNA对HBV表面抗原表达的抑制效率。

*未列入说明书附图4、5。
序列表<160>16<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1ggctgctatg cctcatcttc ta22<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2agcttagaag atgaggcata gcagcc26<210>3<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3agcttagaag atgaggcata gcagcccttt ttg33<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4aattcaaaaa gggctgctat gcctcatctt cta33<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5ggcctatggg agtgggcctc aa22<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>6agctttgagg cccactccca taggcc26<210>7<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>7agctttgagg cccactccca taggcccttt ttg33<210>8<211>33<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>
<400>8aattcaaaaa gggcctatgg gagtgggcct caa33<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>9ggaagcctcc aagctgtgcc ta22<210>10<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>10agcttaggca cagcttggag gcttcc26<210>11<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>11agcttaggca cagcttggag gcttcccttt ttg33<210>12
<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>12aattcaaaaa gggaagcctc caagctgtgc cta33<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>13ggaagaagaa ctccctcgcc ta22<210>14<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>14agcttaggcg agggagttct tcttcc26<210>15<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>15agcttaggcg agggagttct tcttcccttt ttg33
<210>16<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>16aattcaaaaa gggaagaaga actccctcgc cta3

本发明公开了一种阻断乙肝病毒表达的方法。目的是能够通过该方法使乙肝病毒的表达阻断。本发明提供的阻断乙肝病毒表达的方法是使用RNAi技术阻断乙肝病毒HBV在人肝细胞中的表达。具体提供了四组siDNA序列，并提供了包含上述四种siDNA的质粒siDNA－1，－2，－3和－4－pBS/U6－GFP及其构建方法。本发明将RNAi技术用于阻断乙肝病毒的表达，将在乙型肝炎的治疗中起到重要作用。