专利名称：一种外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法外周血单个核细胞(peripheralblood mononuclear cell, PBMC),指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞(monocyte)、树突状细胞和其它少量细胞(造血干细胞等)。PBMC是制备细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的种子细胞，CIK细胞因其同时表 达CD3和CD56而被认为是新一代肿瘤过继免疫治疗的首选方案。在临床应用过程中，常见的问题是很难保证提供足够数量的PBMC。针对该问题目前常用的做法是，利用低温冻存技术保存外周血单个核细胞，在需要时复苏并诱导培养为各种免疫细胞。但冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，同时伴随生物性损伤的危险。为了将冻存过程中细胞的损伤降至最低，使细胞复苏时存活率最高，最佳的冷冻条件是尽可能地降低细胞内的晶体形成，减少细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的低温损伤。因此需要采取缓慢冷冻、加入冷冻保护剂排除水分、在尽可能低的温度下保存细胞、快速复苏等方法来达到对细胞产生最低损伤的目的，其中冷冻保护剂的作用十分重要。常用的冷冻保护剂主要有甘油、二甲基亚砜(DMSO)等渗透性试剂，以及羟乙基淀粉(HES )、白蛋白和聚乙二醇(PEG)等非渗透性试剂，目前常用的是DMSO。现有技术中，细胞冻存复苏后的存活率通常在70%_90%之间。日本学者Makino S等采用5%DMS0、6%羟乙基淀粉、4%人血清白蛋白冻存自体外周血干细胞，冻存于_80°C，获得的复苏存活率为88. 4%±3. 6%，为目前已知报道中最高的存活率。不过叶韵斌等学者的报道显示，用此方法冻存的细胞回输给患者，有些患者出现了不适症状，原因可能是羟乙基淀粉(HES)为大分子物质，个别患者在使用含羟乙基淀粉的药品时，可能发生过敏性反应。因此，为提供足够量的PBMC，现有技术中细胞冻存复苏后的存活率仍需进一步提高，同时也应避免回输给患者时出现恶心、呕吐或过敏等不良反应。
针对上述现有技术中的不足，本发明的目的是提高PBMC细胞冻存复苏后的存活率，同时避免将复苏后的PBMC细胞回输给患者时出现不良反应。为了实现上述发明目的，本发明技术方案如下一种外周血单个核细胞冻存液，包含10-12%(V/V)渗透性冷冻保护剂，10-14%(V/V) ￠-葡聚糖，8-10%(V/V)血清或血浆，64-72%(V/V)生理盐水。以及，一种外周血单个核细胞冻存方法，包括以下步骤(I)将外周血单个核细胞悬浮于细胞培养液中，获得外周血单个核细胞悬液；(2)将所述外周血单个核细胞悬液与本发明的外周血单个核细胞冻存液按照0.9-1. I I的比例混匀，分装于细胞冻存管中；(3)将所述细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于_80°C冷冻，然后转入液氮中冻存。本发明的PBMC冻存液使用了经美国FDA认证安全的P -葡聚糖作为冷冻保护剂，使冻存复苏后的PBMC的存活率达到91. 56%左右，且使用本发明的PBMC冻存液的单个核细胞复苏后经诱导培养得到的CIK细胞中CD3+CD56+T细胞的比例与未冻存的PBMC相比十分接近，且两者的细胞生长曲线和增殖倍数没有明显差异，并且将该CIK细胞回输给患者后未引起不适症状。图I为使用本发明实施例I的冻存液冻存PBMC复苏后诱导得到CIK细胞与未冻存的PBMC诱导得到的CIK细胞的生长曲线图； 图2为使用本发明实施例I的冻存液冻存PBMC复苏后诱导得到CIK细胞与未冻存的PBMC诱导得到的CIK细胞中CD3+CD56+T细胞的流式检测图，其中(a)为本发明实施例I的冻存液冻存的PBMC的检测结果，(b)为未冻存的PBMC的检测结果。

(4)弃上清，加适量CIK完全培养液(含血清和IL-2)，吹打均匀，转移到预先包被处理的培养瓶中进行诱导培养；(5)将上述培养瓶置于37°C、5%C02培养箱中，每隔一天取样对CIK细胞进行计数，并取未冻存PBMC进行诱导培养，两者结果进行比较，见表2和图I，诱导培养第13天收获成熟的CIK细胞。4.诱导得到的CIK细胞的检测用流式细胞仪检测收获的成熟CIK细胞中⑶3+⑶56+T细胞的百分比，并与未冻存PBMC诱导培养的结果进行比较，结果见图2。5. CIK细胞回输结果观测选取100名受试者回输以上所得的成熟CIK细胞，回输后观察24h，记录反应结果。对比实施例II.取人外周血，分离得到外周血单个核细胞(PBMC)及自体血衆，按如下比例及组分配制PBMC冻存液10%DMS0+10%自体血浆+80%注射用生理盐水。2. PBMC 的冻存实验步骤同实施例I。3. PBMC复苏后存活率检测从液氮罐中取出一管已冻存的PBMC，迅速置于37°C水浴中lmin，使PBMC完全融化，取少量细胞用台盼蓝染色法检测细胞存活率，结果见表I。结果I.实施例I中的PBMC冻存复苏后细胞存活率检测结果如表I所示。表I采用不同冻存液冻存的PBMC复苏后的细胞存活率
^含12 P-葡聚糖不含P-葡聚糖 冻存液类型(实施例I )(对比实施例I )
细胞存活率(％)91.56 + 7. 4682. 23 + 9. 52由表I可见，实施例I中PBMC冻存并复苏后细胞存活率高于对比实施例I中的细胞存活率，也高于目前已知的使用现有技术的冻存液冻存PBMC并复苏后细胞存活率。2.实施例I的冻存组和对比实施例I的未冻存组的PBMC诱导培养得到的CIK细胞计数结果如表2和图I所示。表2冻存组与未冻存组的PBMC诱导得到的CIK计数结果


本发明涉及生物技术领域。本发明提供一种外周血单个核细胞冻存液，包含10-12%(V/V)渗透性冷冻保护剂，10-14%(V/V)β-葡聚糖，8-10%(V/V)血清或血浆，64-72%(V/V)生理盐水。本发明还提供一种外周血单个核细胞冻存方法，包括(1)将外周血单个核细胞悬浮于细胞培养液中，获得外周血单个核细胞悬液；(2)将所述外周血单个核细胞悬液与权利要求1-5中任一项所述的外周血单个核细胞冻存液按照0.9-1.1∶1的比例混匀，分装于细胞冻存管中；(3)将所述细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。