专利名称：消除克雷伯氏肺炎杆菌合成2,3-丁二醇和乙偶姻能力的方法克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)是一种革兰氏阴性细菌,在分类学上与大肠杆菌属于同一个属。克雷伯氏肺炎杆菌代谢甘油可以生成1，3_丙二醇，并具有较高的生产强度和转化率，相关研究受到很大的关注。克雷伯氏肺炎杆菌在利用甘油合成1，3-丙二醇的同时还合成2，3- 丁二醇、乙偶姻(3-羟基-2- 丁酮)、乙醇、琥珀酸、乙酸和乳酸等副产物，这些副产物的合成消耗大量的底物，同时给 1，3_丙二醇的分离提取带来沉重的负担[Xiu, Z. L. and A. P. Zeng, Present state and perspective of downstreamprocessing of biologically produced I，3-propanediol and 2,3-butanediol. Appliedmicrobiology and biotechnology,2008. 78(6) :p.917-926]。目前，已经有一些工作通过敲除副产物的合成途径来消除或降低这些副产物的产生。Xu等在克雷伯氏肺炎杆菌HR526中敲除了乳酸脱氢酶基因，从而降低了菌株合成乳酸的能力，同时该菌株利用甘油生产1，3_丙二醇的底物转化率和产物终浓度都得到了提高[Xu, Y. Z. , et al. , Metabolism in I, 3-propanediol fed-batch fermentationby a D-Iactate deficient mutant of Klebsiella pneumoniae. Biotechnology andbioengineering, 2009. 104(5) :p. 965-972]。Zhang 等在克雷伯氏肺炎杆菌 YMU2 中敲除了乙醛脱氢酶，阻断了乙醇的合成途径，从而降低了菌株合成乙醇的能力，同样利用该菌株转化甘油生成 I，3_ 丙二醇的能力提高[Zhang, Y.，et al.，Inactivation of aldehydedehydrogenase a key factor for engineering 1,3-propanediol production byKlebsiella pneumoniae. Metabolic engineering,2006. 8 (6) :p.578-586]。在所有这些副产物中，2，3-丁二醇的合成量较大，并且化学性质与I，3-丙二醇接近，与1，3_丙二醇的分离成本较高。在克雷伯氏肺炎杆菌中2，3_ 丁二醇由中心代谢产物丙酮酸开始，两分子丙酮酸经过乙酰乳酸合成酶催化合成乙酰乳酸，乙酰乳酸脱羧酶催化乙酰乳酸脱羧形成乙偶姻，乙偶姻在乙偶姻氧化还原酶的催化下还原形成2，3-丁二醇。菌株在合成2，3_ 丁二醇的同时其前体物质乙偶姻也有一定的积累。但是目前并未见消除雷伯氏肺炎杆菌这两种物质合成能力的研究报道。
本发明要解决的技术问题是提供一种消除克雷伯氏肺炎杆菌合成2，3_ 丁二醇和乙偶姻能力的方法。通过本发明的方法，在克雷伯氏肺炎杆菌利用甘油合成1，3_丙二醇过程中，可以消除2，3_ 丁二醇和乙偶姻这些副产物，减少1，3-丙二醇分离提取步骤，同时提高底物转化率。为解决上述技术问题，本发明的消除克雷伯氏肺炎杆菌合成2，3_ 丁二醇和乙偶姻能力的方法，是通过对克雷伯氏肺炎杆菌2，3- 丁二醇合成途径中乙酰乳酸脱羧酶基因进行失活，从而阻断乙酰乳酸转化成乙偶姻的催化反应，实现克雷伯氏肺炎杆菌合成2，3- 丁二醇和乙偶姻能力的消除。上述方法的具体步骤，包括I)利用PCR扩增克雷伯氏肺炎杆菌乙酰乳酸脱羧酶基因，通过TA克隆方法连接到克隆载体，并进行序列测定；2)利用步骤I)克隆到的基因序列，制备两侧连有乙酰乳酸脱羧酶基因的同源臂、中间连接抗性核的DNA片段；3)利用转化或接合方法，将步骤2)制备的DNA片段转 入到克雷伯氏肺炎杆菌中，利用同源重组与克雷伯氏肺炎杆菌染色体上的乙酰乳酸脱羧酶基因进行重组，筛选获得乙酰乳酸脱羧酶基因失活的菌株。所述步骤I)中，PCR扩增中的上游引物为SEQ ID NO. I所示，下游引物为SEQ IDNO. 2所示；克隆载体,包括质粒。所述步骤2)中，乙酰乳酸脱羧酶基因的同源臂制备中的同源序列PCR扩增上游引物为SEQ ID NO. 6所示，下游引物为SEQ ID NO. 7所示；抗性核包括链霉素、安谱霉素、氯霉素、壮观霉素和四环素等抗性基因。所述步骤1)-3)中，乙酰乳酸脱羧酶是菌体中催化乙酰乳酸脱羧形成乙偶姻的酶，酶国际系统分类编号EC 4. I. I. 5,在克雷伯氏肺炎杆菌中一般由259个氨基酸残基构成。筛选获得乙酰乳酸脱羧酶基因失活的菌株中，先筛选得到具有抗性核的菌株，并以SEQ IDN0. I和SEQ ID NO. 8所示的引物进行PCR扩增验证。本发明通过对乙酰乳酸脱羧酶基因进行失活，在克雷伯氏肺炎杆菌利用甘油合成1，3_丙二醇时，能消除2，3_丁二醇和乙偶姻这些副产物的产生，减少了 1，3_丙二醇分离提取步骤，同时，提高甘油(底物)向I，3-丙二醇的转化率。氨苄青霉素抗性。本实施例的消除克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1. 6366合成2，3_ 丁二醇和乙偶姻能力的方法，其具体步骤如下I、利用PCR扩增克雷伯氏肺炎杆菌乙酰乳酸脱羧酶基因(budA)，通过TA克隆方法连接到克隆载体，并进行DNA序列测定。根据克雷伯氏肺炎杆菌MGH78578 (Genbank CP000647)基因组信息，设计乙酰乳酸脱羧酶 PCR 引物，上游引物 budA-s GAAGATCAGAACATCGCCAGA (SEQ ID NO. I 所示)，下游引物 budA-a CTCTGATGGACCTGCTTCGCCTTAT (SEQ I D NO. 2 所示)。通过上述引物，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1. 6366基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得乙酰乳酸脱羧酶基因片段，通过TA克隆方法(Original TA Cloning Kit)连接到pMD-18T simple质粒上,命名为pMD18T-budA质粒,序列测定结果如下 budA基因相邻上游部分序列为GAAGATCAGAACATCGCCAGAAAGCGTTTCACCGTGCGCGAGCGCTCGAAGCGCCGCCAGGCGATGGCGATATCGGTCTTCAGCGGTGCCCCGCTGAGCGGGTGATAGCTGACGTTCGGCTGTTGAATGCAGGTCATCGACTGCGGGACCAGCGCGAAGCCGAACCCGGCATTGACCATGCTCAGCGATGACGAAATCTGCGACGACTGCCAGGCGCGCTCCATATCGATGCCGGCGCGCAGGCAGCTGTTGTACACCAGCTCATACAGCCCCGGGGCCACCTCCCGCGGGA(SEQ IDNO. 3所示)οbudA基因阅读框为AGAGAGTCTGTGCGAAACCCTGCGGGCGTTTTCCGCGCAGCATCCCGAGAGCGTGCTCTATCAGACATCGCTCATGAGCGCCCTGCTGAGCGGGGTTTACGAAGGCAGCACCACCATCGCGGACCTGCTGAAGCACGGCGATTTCGGTCTCGGCACCTTTAATGAGCTGGACGGGGAGCTGATCGCCTTCAGCAGTCAGGTCTATCAGCTGCGGGCCGACGGCAGCGCGCGCAAAGCCCAGCCGGATCAGAAAACGCCGTTCGCGGTGATGACCTGGTTCCAGCCGCAGTACCGGAAAACCTTCGACCATCCGGTGAGCCGCCAGCAGCTGCACGAGGTGATCGACCAGCAAATCCCCTCTGACAACCTGTTCTGCGCCCTGCGCATCGACGGCCATTTCCGCCATGCCCATACCCGCACCGTGCCGCGCCAGACGCCGCCGTACCGGGCGATGACCGACGTCCTCGACGATCAGCCGGTGTTCCGCTTTAACCAGCGCGAAGGGGTGCTGGTCGGCTTCCGTACCCCACAGCATATGCAGGGGATCAACGTCGCCGGGTATCACGAGCACTTTATAACCGATGACCGCAAAGGCGGCGGTCACCTGCTGGATTACCAGCTCGACCACGGGGTATTGACCTTCGGCGAAATTCACAAGCTGATGATCGACCTGCCCGCCGACAGCGCGTTCCTGCAGGCCAATCTGCATCCCGATAATCTCGATGCCGCCATCCGTTCCGTAGAAAGTTAAGGGGGTCACATGGACAAACAGTATCCGGT (SEQ ID NO. 4 所示)。budA基因相邻下游部分序列为ACGCCAGTGGGCGCACGGCGCCGATCTCGTCGTCAGCCAGCTGGAAGCCCAGGGGGTACGTCAGGTGTTCGGCATCCCTGGCGCCAAAATCGACAAGGTATTCGACTCACTGCTGGATTCCTCCATTCGCATTATTCCGGTACGCCACGAAGCTAACGCCGCCTTTATGGCCGCCGCCGTCGGGCGCATTACCGGTAAAGCGGGCGTGGCGCTGGTCACCTCCGGTCCGGGCTGTTCCAACCTGATCACCGGTATGGCCACCGCCAACAGCGAAGGCGACCCGGTGGTGGCCCTGGGCGGCGCGGTGAAACGCGCCGATAAGGCCAAACAGGTCCACCAGAG (SEQ ID NO. 5 所示)。2、利用步骤I克隆到的基因序列，制备两侧连有同源臂中间连接抗性核的DNA片段。本步骤中的操作，采用在大肠杆中利用Red重组酶催化，具有同源臂连接抗性核的DNA片段与pMD18T-budA质粒进行同源重组，获得pMD18T_budA质粒上失活的budA基因，利用该质粒作为模板通过PCR扩增具有长的同源臂的DNA片段，该片段两侧连有与budA基因上下游序列同源的序列，中间连接抗性核。本步骤操作原理可参见(Weiet. al. Red recombinase assistedgene replacement in Klebsiella pneumoniae Journal of IndustrialMicrobiology&Biotechnology 2012),具体步骤如下a. pMD18T-budA质粒热击转化到含有pIJ790质粒的大肠杆菌DH5a_pIJ790中，命名为 DH5a-pMD18T-budA。制备DH5a-pMD18_budA感受态细胞，在菌体培养I个小时后，添加10mmol/L的阿拉伯糖，诱导PIJ790质粒中Red重组酶的表达。b.设计引物budA_s2和budA_a2，序列分别为GCCCTGCTGAGCGGGGTTTACGAAGGCAGCACCACCATCATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ IDNO. 6所示)和TTGCGGTCATCGGTTATAAAGTGCTCGTGATACCCGGCGATGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ I DNO. 7所示)。弓丨物budA-s2 的 “GCCCTGCTGAGCGGGGITTACGAAGGCAGCACCACCATC” 序列与 budA 基因序列同源，引物 budA-a2 的“TTGCGGTCATCGGTTATAAAGTGCTCGTGATACCCGGCGA”序列与 budA基因相应序列同源。
利用引物budA_s2和budA_a2，以质粒pIJ778为模板扩增出长约1491bp的DNA片段A。该片段两段分别具有与budA序列同源的同源臂，中间包含了来源于pIJ778质粒的链霉素抗性基因aadA。c.利用DNA片段A转化感受态DH5a-pMD18T_budA感受态细胞。利用电击转化方法，转化电压为2000V，选择链霉素抗性的菌株，链霉素用量为50mg/L。DNA片段A两侧的同源序列与质粒pMD18T-budA上的budA同源部分发生重组，获得了 pMD18T-A 质粒。d.利用引物 budA-s (SEQ ID NO. I 所示)和 budA-a (SEQ ID NO. 2 所示)，以PMD18T-A质粒为模板进行PCR扩增，获得3114bp的DNA片段B。DNA片段B两端分别具有1131bp和571bp的budA基因和相邻序列，该序列作为同源臂。DNA片段B中间具有链霉素抗性基因aadA，DNA片段B用于进行CGMCC1. 6366染色体上budA基因重组的线性DNA片段。3、利用转化或结合方法将制备的DNA片段B转入到克雷伯氏肺炎杆菌中，利用同源重组与染色体上的乙酰乳酸脱羧酶基因进行重组，筛选获得乙酰乳酸脱羧酶基因失活的菌株，具体步骤如下a.将 pDK6-red 质粒转化到 CGMCC1. 6366 中，获得 CGMCC1. 6366-pDK6_red 菌株，线性DNA片段B电击转化CGMCC1. 6366-pDK6-red感受态细胞。利用链霉素筛选抗性菌株。b.重组菌的验证，设计验证引物Yanzheng778z AGAATCTCGCTCTCTCCAGGGGAAG (SEQ ID NO. 8所示)，其序列对应链霉素抗性基因aadA中间的一段序列。利用引物budA-s (SEQ ID NO. I所示)和Yanzheng778z，以长出的菌株总DNA为模板进行PCR扩增，产物DNA片段为1889bp，而以出发菌株CGMCC1. 6366总DNA为模板进行PCR无特异性条带，表明获得的重组菌正确，命名为CGMCC1. 6366-budA-。该菌株的乙酰乳酸脱羧酶基因通过同源重组而失活。4、乙酰脱羧酶失活菌株乙偶姻和2，3- 丁二醇合成能力检验。配制培养基硫酸铵4g/L ;磷酸氢二钾O. 69g/L ;磷酸二氢钾O. 25g/L ;硫酸镁
O.2g/L ;酵母粉I. 5g/L ;甘油30g/L ;微量元素I. 0ml/L ;铁溶液I. Oml/L。其中，微量元素为硫酸锰100mg/L ;氯化锌70mg/L ;钥酸钠35mg/L ;硼酸60mg/L ；氯化钴 200mg/L ;硫酸铜 29. 28mg/L ;氯化镍 25mg/L ;浓盐酸(37% )0. 9ml/L。
铁溶液为每升水中加入硫酸亚铁5. 0g，37%的浓盐酸4ml。利用CGMCC1. 6366出发菌株和乙酰乳酸脱羧酶失活菌株CGMCC1. 6366-budA-在500mL锥形瓶进行培养，培养条件为装液量50ml，转速150转每分，发酵结束后，发酵液利用气相色谱和液相色谱对发酵液各组分进行定量分析，结果如下CGMCCI. 6366 出发菌株琥珀酸 O. 46g/L ;乳酸 O. 54g/L ;甘油 O. 00g/L ；乙酸
2.97g/L ; I，3-丙二醇 10. 56g/L ;乙偶姻 O. 05g/L ; 2，3- 丁二醇 3. 06g/L ;其中，甘油向 I，3-丙二醇的转化率为35. 2% ;CGMCCI. 6366-budA-菌株琥珀酸 I. 23g/L ;乳酸 O. 12g/L ;甘油 11. 94g/L ；乙酸
O.87g/L ;1，3-丙二醇 6. 9lg/L ;乙偶姻 O. 00g/L ;2，3_ 丁二醇 O. 00g/L ;其中，甘油向 1 ，3-丙二醇的转化率为38.2%。以上培养结果表明，乙酰乳酸脱羧酶失活菌株中的2，3_ 丁二醇和乙偶姻合成已经消除，在发酵液中的含量处在检测限度以下，同时，增加了甘油向1，3_丙二醇的转化率。


本发明公开了一种消除克雷伯氏肺炎杆菌合成2，3-丁二醇和乙偶姻能力的方法，该方法通过对克雷伯氏肺炎杆菌2，3-丁二醇合成途径中乙酰乳酸脱羧酶基因进行失活，从而阻断乙酰乳酸转化成乙偶姻的催化反应。利用本发明，在克雷伯氏肺炎杆菌利用甘油合成1，3-丙二醇时，消除了副产物2，3-丁二醇和乙偶姻的合成，提高了甘油向1，3-丙二醇的转化率。