专利名称：冬凌草甲素在制备获得免疫抑制效应药物中的应用的制作方法冬凌草甲素作为一种从传统中药冬凌草中分离提取而来的贝壳杉烯二萜类天然有机化合物，是冬凌草发挥抗肿瘤作用的主要成分。体外药效学研究表明浓度在 15-35 4 11101/1之间的冬凌草甲素能诱导多种癌细胞如朋841^、彻13、4375-52、861-7402、 U937、U20S、MG63、SaOS-2等的凋亡，但不能诱导人纤维细胞和外周血单个核细胞的凋亡。 冬凌草甲素对CD19+B细胞和CD3+T细胞的生存没有作用，但对PBMC杀伤作用较弱，尽管 PBMC拮抗冬凌草甲素的细胞毒作用，但在34. 3ymol/L的冬凌草甲素作用M小时时，PBMC 的生长受到抑制，由12小时细胞存活率的87%降至75%左右，可见冬凌草甲素对PBMC的细胞毒作用与5-氟尿嘧啶相当。河南省医学科学研究所等单位发现冬凌草甲素对雄性小鼠体液免疫功能有轻度抑制作用，对细胞免疫无明显抑制作用。经检索，关于冬凌草甲素抑制PBMC，还能诱导淋巴细胞亚群⑶4+T，⑶8+T，NK细胞的凋亡，对机体免疫系统产生影响的专利或研究文献还未见报道。
本发明的目的是提供一种冬凌草甲素在制备获得免疫抑制效应药物中的应用。本发明所述冬凌草甲素在制备获得免疫抑制效应药物中的应用，其特征在于所述获得免疫抑制效应以冬凌草甲素诱导外周血淋巴细胞凋亡的方式实现。其中所述获得免疫抑制效应以冬凌草甲素抑制人PBMC，诱导淋巴细胞亚群 ⑶4+T，⑶8+T或NK细胞凋亡的方式实现。其中所述冬凌草甲素抑制人PBMC，诱导淋巴细胞亚群⑶4+T，⑶8+T或NK细胞凋亡的浓度为6 18ymol/L，作用时间为48 60小时。进一步的，上述冬凌草甲素抑制人PBMC，诱导淋巴细胞亚群⑶4+T，⑶8+T或NK细胞凋亡的浓度优选6 12 μ mol/L,作用时间优选48小时。为了更好地理解本发明的实质，下面用冬凌草甲素体外诱导免疫抑制和体内诱导免疫抑制的药理实验及免疫抑制效果来说明冬凌草甲素在制备获得免疫抑制效应药物中的应用。体外诱导免疫抑制的方法浓度为6 18 μ mol/L的冬凌草甲素体外作用于正常人PBMC 48小时，台盼蓝染色后显微镜下计数发现活细胞数目随药物浓度增加而逐渐减少，死细胞数目在一定程度上明显增加。不同浓度的冬凌草甲素对PBMC生长产生抑制作用，细胞存活率逐渐降低，并且与药物浓度成明显的效用关系。浓度为6 18 μ mol/L的冬凌草甲素体外作用于正常人PBMC 48小时出现由亚G0/G1期形成的凋亡峰，该期细胞数占检测细胞的百分比，即为细胞发生凋亡的比例，亚 G0/G1期峰随着药物浓度的增加而逐渐明显，提示PBMC凋亡显著。随浓度的升高，PBMC凋亡率也升高。浓度为6 18μπι01/1的冬凌草甲素体外作用于正常人PBMC亚群48小时后， ⑶4+Τ细胞、⑶8+Τ细胞、NK细胞表现为明显的凋亡现象，B细胞主要表现为坏死。体内诱导免疫抑制的方法雄性小鼠C57BL/6连续注射冬凌草甲素10mg/kg 3天，第五天时分别从血液，肝脏，脾脏中分离淋巴细胞，检测三种来源的细胞的凋亡率。从脾脏中分离淋巴细胞亚群 ⑶4+T细胞、⑶8+T细胞、B细胞、NK细胞等，进而检测细胞的凋亡。免疫抑制效果的检测收集对照组及药物诱导48小时PBMC细胞，用PBS洗两次，70%预冷乙醇固定过夜。PBS 洗 2 次，加入碘化丙啶(PI)染液(0.1% Triton X-100, 200 μ g/ml DNase-Free RNase A, 20 μ g/ml PI, all in PBS) 200 μ 1，37°C避光15min。上流式细胞仪进行细胞周期和凋亡峰检测。收集药物诱导48小时PBMC细胞，PBS洗两次，分别加入区分淋巴细胞亚群的单抗或相应同型对照抗体，混勻后4°C避光孵育30min，PBS洗两次，再分别加入Armexin V 1μ 1，室温避光孵育20min，再加入PI染液(100 μ g/μ 1) 0. 5 μ 1，避光反应5min后，加入 BindingBuffer 200 μ 1重悬细胞，立即用FACS Calibur流式细胞术定量检测。以FSC/SSC 二维散射光图确定淋巴细胞群体，统一进行标准化设门。结果浓度为6-18ymol/L的冬凌草甲素无论在体外，还是在体内，均能明显诱导正常人PBMC凋亡，使得PBMC减少或活性下降。综上，依据冬凌草甲素体外诱导免疫抑制和体内诱导免疫抑制的药理实验及免疫抑制效果，可以证实冬凌草甲素对免疫细胞具有杀伤抑制作用，浓度为6-18ymol/L的冬凌草甲素能够在体内外均可以促进淋巴细胞的凋亡和坏死，杀伤免疫细胞，体内应用浓度为ΙΟμπιοΙ/L的冬凌草甲素则抑制机体免疫系统的功能，提示其可以用于制备获得免疫抑制效应药物。本发明所述冬凌草甲素可以作为一种免疫抑制剂应用于自身免疫病，器官移植等，为冬凌草甲素发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。图1冬凌草甲素抑制PBMC细胞数量和生长存活率。(A) 6-18 μ mol/L冬凌草甲素显著抑制PBMC细胞数量；(B) 6-18 μ mol/L冬凌草甲素显著抑制PBMC细胞生长存活率。图2流式细胞术检测冬凌草甲素诱导PBMC凋亡。(A)对照组凋亡率为6. 38% ； (Β)6 μ M冬凌草甲素组凋亡率为77. 49% ； (C) 12 μ M 冬凌草甲素组凋亡率为76. 32% ； (D) 18 μ M冬凌草甲素组凋亡率为79. 38%。图3冬凌草甲素介导PBMC凋亡。作用于PBMC流式细胞仪检测对照组和6，12，18，24 μ mol/L四个剂量组的凋亡率分别为46. 92%,62. 47%,78. 38%,97. 72%和 98. 51%。图4冬凌草甲素诱导重要淋巴细胞亚群凋亡。㈧6-18μπι01/1冬凌草甲素均可引起淋巴细胞各亚群的严重凋亡。6、12、 18 μ mol/L的冬凌草甲素作用PBMC 48h后，流式细胞仪检测对照组和6-18 μ mol/L三个剂量组的凋亡率分别为(B)CD4+T 细胞4. 44%,77. 00%,82. 20%,91. 10% ；(C)CD8+T 细胞8. 59%,87. 20%,78. 74%,80. 42% ；(D)B 细胞16. 73%,49. 42%,52. 33%,47. 61% ；(E)NK 细胞15. 31%,98. 21%,97. 81%,99. 20%。图5冬凌草甲素对小鼠淋巴细胞的凋亡诱导作用。雄性小鼠C57BL/6连续注射冬凌草甲素10mg/kg 3天，(A)对照组、PBS组、冬凌草甲素组对分别从外周血、肝脏、脾脏中分离的淋巴细胞的凋亡诱导作用，凋亡率分别为54. 44%、28. 97、23. 91%。(B)(C)(D)外周血、肝脏、脾脏分离而来淋巴细胞AnnexinV 单阳性率分别为52.8%,24.7%,22. 1%, AnnexinV、PI双阳性率分别为60. 7%,37. 5%, 28. 3% .图6冬凌草甲素对小鼠淋巴细胞亚群的凋亡诱导作用。(A)冬凌草甲素作用第五天时，从脾脏中分离淋巴细胞亚群对照组、PBS组、冬凌草甲素组。冬凌草甲素组凋亡率为⑶4+T细胞四.85 %、⑶8+T细胞48.四％、B细胞 27. 68%,NK 细胞 47. 12%。； (B-E)CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、B 细胞、NK 细胞 AnnexinV 单阳性率分别为 27. 4%,41. 4%,22. 2%,41. 9%, AnnexinV、PI 双阳性率分别为 48. 3%,72. 5%, 34. 9%,90. 7%。
46.92%,62. 47%,78. 38%,97. 72%和98. 51% (图3)，四个剂量组和对照组比较差异均有显著性(P < 0. 01)。(2)淋巴细胞亚群凋亡情况测定各浓度的冬凌草甲素均可引起淋巴细胞各亚群的严重凋亡。以浓度为6、12、18 μ mol/L的冬凌草甲素作用PBMC 48h后，流式细胞仪检测对照组和三个剂量组的凋亡率分别为CD4+T细胞4. 44%,77. 00%,82. 20%,91. 10% ；CD8+T 细胞8. 59%,87. 20%,78. 74%,80. 42% ；B 细胞16. 73%,49. 42%,52. 33%,47. 61% ；NK 细胞15. 31%,98. 21%,97. 81%,99. 20%。其中 CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、NK 细胞主要表现为凋亡，B细胞主要表现为坏死。5、冬凌草甲素对小鼠淋巴细胞的凋亡诱导作用雄性小鼠C57BL/6连续注射冬凌草甲素10mg/kg 3天，第五天时分别从血液，肝脏，脾脏中分离淋巴细胞，其凋亡率分别为54.44^^28.97^^23.91 ^从脾脏中分离淋巴细胞亚群，凋亡率为⑶4+T细胞29. 85%,⑶8+T细胞48. 29%, B细胞27. 68%, NK细胞47.12%。


本发明公开了一种冬凌草甲素在制备获得免疫抑制效应药物中的应用，其中所述获得免疫抑制效应以冬凌草甲素诱导外周血淋巴细胞凋亡的方式实现。实验证实浓度为6-18μmol/L的冬凌草甲素能够在体内外均可以促进淋巴细胞的凋亡和坏死，杀伤免疫细胞，体内应用浓度为10μmol/L的冬凌草甲素则抑制机体免疫系统的功能。本发明所述冬凌草甲素可以作为一种免疫抑制剂应用于自身免疫病，器官移植等，为冬凌草甲素发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。