一种牡蛎活性肽的制备方法及用途【技术领域】，涉及一种牡蛎活性肽的制备方法，以及在制备治疗化学环境干扰物双酚A暴露所致的卵巢功能紊乱的药物中应用。[0002]海洋食品牡蛎具有巨大的食用价值和药用价值，是世界上第一大养殖贝类，在我国浙江省等沿海地区都进行大规模养殖。浙江宁海一带被誉为“牡蛎之乡”，已有700年的牡蛎养殖史。牡蛎的营养价值极高，牡蛎中的蛋白质含量高达45%-57%，其氨基酸组成完善。根据世界粮农组织评定，牡蛎肉中必需氨基酸完全程度和质量比例优于人乳和牛乳。古人将牡蛎称为“水产品之最贵者”，古罗马人把它誉为“海中美味-圣鱼”，西方人称之为“神赐魔石”、“海中牛奶”，日本人则誉之为“根之源”。[0003]牡蛎中丰富的生物活性肽、蛋白质、糖原、牛磺酸等生物活性成分为其在食品和医药领域的应用提供了巨大的支持。牡蛎是中国卫生部公布的第一批68种药食同源的食品之一。早在我国汉代《伤寒论》、明代《本草纲目》等医疗史籍中就已有关于牡蛎药用价值的记载。目前牡蛎产品的研发大多只关注牡蛎中牛磺酸的生理功能或牡蛎的全营养功能，而忽略其它成分的独特作用。
[0004]本发明的目的是提供一种牡蛎活性肽的制备方法，通过以下步骤实现: 1.新鲜牡蛎去壳、洗净，得新鲜牡蛎肉。在新鲜牡蛎肉中加入预冷的双蒸水，高速匀浆后放入4 °C冰箱内静置I hr，以8000r/min，4 °C离心30min，取上清液，冷藏备用。取上清液以HCL (1:1)调溶液pH至4,8000r/min离心1min,取上清液，以5mol/L NaOH调pH至9,再离心分离，上清液以HCL调至中性即为牡蛎粗蛋白。[0005]2.用蒸馏水准确配制5.0%的蛋白悬浊液，先将牡蛎蛋白悬浊液放置于4°C冰箱12小时，再用高速冷冻离心机4°C，7000-8000r/m，离心2次。收集上清液。采用高速分散器均质1min,放置于250 mL的恒温酶反应器内预热至木瓜蛋白酶(Papain)的最适反应温度50°C。然后用0.5mol/L NaOH调节至Papain的最适pH值8.5,继续搅拌20min,然后加入Papain启动反应，反应过程中连续搅拌，滴加0.2 mo I/L NaOH维持溶液pH值恒定，反应结束后，将反应物立即在95 0C加热10 min灭酶，然后迅速用流水冷却，酶解物4 °C、离心，收集上清液冷冻干燥，得到牡贩Papain蛋白冻干粉。
[0006]3.取牡蛎蛋白冻干粉，用双蒸水配成20 mg/mL的溶液，在磁力搅拌器上搅拌，用HCL或NaOH调pH值至8.5，待pH稳定后再连续搅拌浸提25 min，离心，上清液定容至50 mL。用生物传感器测定高温灭酶后的牡蛎酶解液中氨基酸的含量。通过Sephadex G_25层析柱对牡蛎酶解液进行分离，以超纯水为洗脱液洗脱，收集各洗脱峰，冻干后，凝胶柱脱盐得到牡蛎活性肽(CGE)。
[0007] 本发明的另一个目的是提供所述方法获得的牡蛎活性肽在制备治疗化学环境干扰物双酚A暴露所致的卵巢功能紊乱的药物中应用。
[0008]本发明的有益之处是:(1)得到的牡蛎酶解液中总氨基酸的含量高；(2)有效保护了生物成分活性。 申请人:首次发现CGE可显著拮抗双酚A (BPA)所致的卵巢颗粒细胞功能干扰效应；同时发现CGE的这种拮抗作用是通过提高卵泡刺激素受体(FSHR)蛋白在颗粒细胞上的表达水平而实现的。



[0009]图1是不同温度下的酶解反应进程曲线。
[0010]图2是血清中FSH，LH, E2的水平测定。
[0011]图3是免疫组化法测定卵巢组织中FSHR的表达。
[0012]图4是卵巢组织中FSHR的表达水平比较。

[0013]本发明通过附图和具体实施例作进一步的说明。
[0014]实施例1 一种牡蛎活性肽的制备方法
取新鲜牡贩去壳、洗净，得新鲜牡贩肉:按料水比1:3 (mg: ml)比例加入预冷的双蒸水，高速匀浆5min后放入4 °C冰箱内静置I hr，以8000r/min，4 °C离心30min，取上清液，冷藏备用。取上清液以HCL (1:1)调溶液pH至4，8000r/min离心10min，取上清液，以5mol/L NaOH调pH至9，再离心分离，上清液以HCL调至中性即为牡蛎粗蛋白。用蒸馏水准确配制5.0%的蛋白悬浊液，先将牡蛎酶解液放置于4°C冰箱12小时，再用高速冷冻离心机4°C，7000-8000r/m，离心2次。收集上清液。采用高速分散器均质lOmin，放置于250 mL的恒温酶反应器内预热至木瓜蛋白酶(Papain)的最适反应温度。然后用0.5mol/L NaOH调节至Papain的最适pH值8.5，继续搅拌20min，然后加入酶启动反应，反应过程中连续搅拌，滴加0.2 mol/L NaOH维持溶液pH值恒定，反应结束后，将反应物立即在95 V加热10min灭酶，然后迅速用流水冷却，酶解物8 °C,4000 rpm离心15 min，收集上清液冷冻干燥，得到Papain蛋白酶解液。取牡贩蛋白，配成20 mg/mL的溶液。在磁力搅拌器上搅拌,用
0.1-0.2mol/L HCL或NaOH调pH值至预定值。待pH稳定后再连续搅拌浸提25 min, 3000rpm离心10 min,上清液定容至50 mL。用生物传感器测定高温灭酶后的牡蛎酶解液中氨基酸的含量，与其他酶解方法总氨基酸含量约为45%相比较，本方法酶解液中总氨基酸含量较高，为55.1%。通过Sephadex G_25层析柱对牡蛎酶解液进行分离，以超纯水为洗脱液洗脱，收集各洗脱峰，冻干后，凝胶柱脱盐得到牡蛎活性肽。活性筛选方法参见实施例3，实施例5。
[0015]实施例2反应温度对牡蛎蛋粗白水解度的影响
控制反应体系PH8.5，加酶量40AU/kg，反应时间为2小时，反应温度为40°C、50°C、60°C条件下进行酶水解。不同温度下的牡蛎匀浆蛋白质酶解进程见图1，图1所示对不同温度下的酶解反应进程进行研究，计算并比较水解度DH(% )。随着温度的升高，耗碱量增加，说明酶解程度加大，综合考虑经济、能耗、温度过高可能导致酶失活等原因，所以选择反应温度为 50。。。
[0016]实施例3本实施例中所用到的牡蛎活性肽(CGE)为实施例1中制备的的CGE。
[0017]选取4周龄Sprague Dawley (SD)雌性大鼠，正常饲养12天,通过阴道涂片观察到2个连续4-5天的性周期者入选为实验动物。随机分为正常对照组(Control)、模型对照组(BPA)，牡蛎活性肽+双酚A处理组(CGE+BPA)，每组6只。在普通饲料喂养基础上，Control组每天喂饲玉米油；BPA组每天喂饲含BPA (按50mg/kg喂饲；BPA为99%纯度)的玉米油；CGE+BPA组每天喂饲含BPA (按50mg/kg喂饲；双酚A为99%纯度)的玉米油再加上牡蛎活性肽同时喂饲。各组大鼠每天喂饲I次，处理期间每天称重，根据体重调整剂量。连续喂饲6周。从治疗开始后的第6天起，各组大鼠同时阴道脱落涂片，观察有无排卵。6周处理结束后，肝门静脉取血，同时迅速剥离子宫、卵巢。测定各组大鼠血清卵泡刺激素(FSH)，促黄体生成素(LH)，雌二醇(E2)的水平。参见图2，血清中E2，FSH，LH的测定结果表明，对照组的血清E2水平明显高于其他组，血清FSH水平明显低于BPA组和BPA+ CGE组(P〈0.05)。对照组的血清LH水平显著高于BPA组(P〈0.05)，然而，BPA+ CGE组和BPA组之间没有显著差异(P >0.05)。与BPA组比较，BPA+ CGE组血清中的E2水平显著升高，FSH的血清水平显著降低(P〈0.05)，表明用上述方法制备的CGE在减轻雌性大鼠双酚A暴露导致的卵巢功能紊乱有积极影响，该制备方法有效保护了生物活性成分。
[0018]实施例4 一种牡蛎活性肽的制备方法
新鲜牡贩去壳、洗净，得新鲜牡贩肉:按料水比l:2(mg: ml)比例加入预冷的双蒸水，高速匀浆1min后放入4 °C冰箱内静置I hr，以8000r/min，4 °C离心30min，取上清液，冷藏备用。取上清液以HCL (1:1)调溶液pH至4，8000r/min离心10min，取上清液，以5mol/L NaOH调pH至9，再离心分离，上清液以HCL调至中性即为牡蛎粗蛋白。用蒸馏水准确配制5.0%的蛋白悬浊液，先将牡蛎酶解液放置于4°C冰箱12小时，再用高速冷冻离心机4°C，7000-8000r/m，离心2次。收集上清液。采用高速分散器均质lOmin，放置于250 mL的恒温酶反应器内预热至木瓜蛋白酶(Papain)的最适反应温度。然后用0.5mol/L NaOH调节至Papain的最适pH值，继续搅拌20min，然后加入酶启动反应，反应过程中连续搅拌，滴加0.2mol/L NaOH维持溶液pH值恒定，反应结束后，将反应物立即在95 V加热10 min灭酶，然后迅速用流水冷却，酶解物8 0C >6000 rpm离心10 min，收集上清液冷冻干燥，得到Papain蛋白酶解液。取牡蛎蛋白，配成20 mg/mL的溶液。在磁力搅拌器上搅拌，用0.2mol/L HCL或NaOH调pH值至预定值。待pH稳定后再连续搅拌浸提25 min, 2500 rpm离心15 min,上清液定容至50 mL。用生物传感器测定高温灭酶后的牡蛎酶解液中氨基酸的含量，与其他酶解方法总氨基酸含量约为45%相比较，本方法酶解液中总氨基酸含量较高，为53.8%。通过Sephadex G_25层析柱对牡蛎酶解液进行分离，以超纯水为洗脱液洗脱，收集有活性的各峰，冻干后，凝胶柱脱盐得到牡蛎活性肽。
[0019]实施例5
本实施例中所用到的牡蛎活性肽(CGE)为实施例3中制备的的CGE。
[0020]选取4周龄Sprague Dawley (SD)雌性大鼠，正常饲养12天,通过阴道涂片观察到2个连续4-5天的性周期者入选为实验动物。随机分为正常对照组(Control)、模型对照组(双酚A, BPA)，牡蛎活性肽+BPA处理组(CGE+BPA)，每组6只。在普通饲料喂养基础上，Control组每天喂饲玉米油；BPA组每天喂饲含双酹A (按50mg/kg喂饲；双酹A为99%纯度)的玉米油；CGE+BPA组每天喂饲含双酚A (按50mg/kg喂饲；双酚A为99%纯度)的玉米油再加 上牡蛎活性肽同时喂饲。各组大鼠每天喂饲I次，处理期间每天称重，根据体重调整剂量。连续喂饲6周。从治疗开始后的第6天起，各组大鼠同时阴道脱落涂片，观察有无排卵。6周处理结束后，肝门静脉取血，同时迅速剥离子宫、卵巢。如图2所示，用免疫组化法检测FSH及其受体在卵巢组织中的情况。牡蛎活性肽可有效地缓解雌性大鼠暴露于双酚A所导致的卵巢功能障碍，该制备方法有效保护了生物活性成分。