专利名称：一种甲醇型毕赤酵母的高密度发酵工艺及设备的制作方法随着生物学技术的发展，利用基因工程菌生产生物产品已成为现实。在微生物表达系统中，酵母作为单细胞低等真核生物，具有易培养、繁殖快、便于基因操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒物质等优点，成为分子生物学领域中被广泛用于重组蛋白生产的系统之一。甲醇型巴斯德毕赤酵母Cidia /^1Stori1S)表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一，它不但克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白多形成不溶性包涵体、背景蛋白多、表达产量低等缺陷，而且弥补了哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统操作复杂、表达水平低、产业化生产造价昂贵的不足。 巴斯德毕赤酵母另一个特点是可以在廉价的非选择性培养基中生长，可进行细胞高密度培养，利于大规模工业化生产。目前许多产品，如植酸酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶等都在巴斯德毕赤酵母中获得高效表达。P. pastoris是一种嗜甲基酵母，可以在以甲酵为唯一碳源和能源的培养基中快速生长。甲醇毕赤酵母代谢的第一步是氧化甲醇形成甲醛，这一步是由醇氧化酶(alcohol oxidase, Aox)催化的，在毕赤酵母利用甲醇的代谢途径中存在两个醇氧化酶，AOXl和 A0X2。在甲醇流加培养时，AOX水平急剧上升，可达细胞可溶性蛋白的30%以上。现在采用的策略是将外源基因替换AOXl基因，这种替换所产生的转化子是最稳定的。AOXl的合成是在转录水平上调控的，其基因启动子具有明显的调空功能，可用于调控外源基因的表达。此调控作用是由碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导双重机制控制的，即外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即可被诱导表达。在25°C和1. OX 105! 氧在水中的溶解度仅为0. 25 mmol. L-I左右。在发酵液中含有大量的有机物和无机盐，氧的溶解度约为0. 21 mmol. L-I,比糖的溶解度小7000倍。在对数生长期即使发酵液中的溶氧能达到100%饱和度，若此时中止供氧，发酵液中溶氧可在几分钟之内便耗竭，使溶氧成为限制因素。溶氧(DO)是毕赤酵母生长所必需，尤其是在重组毕赤酵母高密度发酵工艺，在补料发酵阶段，由于菌体的大量生长，耗氧速率增加，需氧量非常大；在接下来的甲醇诱导表达阶段，甲醇通过毕赤酵母的醇氧化酶(A0X1和A0X2)进行代谢需要大量的氧参与，使溶氧成为甲醇型重组毕赤酵母高密度发酵的限制因素。目前的发酵工艺与设备无法在甲醇型重组毕赤酵母高密度发酵过程中达到供氧与耗氧的平衡。因此，针对大规模工业化的甲醇型重组毕赤酵母高密度发酵，需要从反应器结果设计、供气质量、菌种与发酵工艺的优化等方面提高氧的供给与利用率，防止发酵过程因缺氧而导致的发酵产率的降低。
本发明所要解决的技术问题是提供一种甲醇型毕赤酵母的高密度发酵工艺及设备，以克服目前甲醇型重组毕赤酵母高密度发酵过程中，在发酵工艺与设备方面的供氧不足等问题，防止发酵过程因缺氧而导致的发酵产率的降低。本发明所采用的技术方案是一种甲醇型毕赤酵母的高密度发酵工艺，包括分批发酵阶段、补料发酵阶段和甲醇诱导阶段，在补料发酵阶段和甲醇诱导阶段，由氧气发生器制得的高浓度氧气流入氧气储罐，然后与进入发酵罐的空气混合，使之氧气含量在40% -60%,以1. OOvvm的流量通入发酵罐，以维持发酵罐内发酵液氧的浓度高于同温同压下空气中的氧气在初始培养液中溶解度的30%。本发明进一步技术方案是提供一种应用于上述甲醇型毕赤酵母的高密度发酵工艺中的酵母高密度培养设备，该设备包括由管道依次连接的氧气发生器、氧气储罐、气水分离器、膜过滤器以及发酵罐。所述的发酵罐包括罐体、搅拌装置和通气装置；所述搅拌装置包括搅拌电机、固定在一根搅拌轴上的若干组搅拌浆，下层搅拌桨置于罐体底部且位于通气装置上方，中层搅拌桨置于罐体的中部，上层搅拌桨置于罐体的上部；所述通气装置为环形空气分布器，环形空气分布器上安置多个45度角的出气小管，出气小管上设有多个出气孔引导气体旋转的方向与搅拌轴旋转方向相反。本发明与现有技术比较具有以下有益效果1.在甲醇型重组毕赤酵母的高密度发酵工艺的补料发酵阶段和甲醇诱导阶段通入高浓度的氧气，可以增大发酵液中氧的溶解度，强化氧的供给，消除发酵过程中氧的限制对毕赤酵母生长和外源基因表达的影响，防止发酵过程因缺氧而导致的发酵产率的降低。2.由于环形空气分布器上安置了 45度角的出气小管，出气小管上排列有出气孔，使通气装置进入的气体能够均勻分散上升，并增加了气液接触面；同时由于出气小管上的出气孔引导气体旋转的方向与搅拌轴旋转方向相反，促进了进气与发酵液的混合，有利于提高氧的利用率。图1为本发明一种实施例甲醇型毕赤酵母高密度培养设备组成示意图。图2为本发明发酵罐结构示意图。图3为通气装置结构示意图。图4为图3的A-A视图。

一种甲醇型毕赤酵母的高密度发酵工艺，包括分批发酵阶段、补料发酵阶段和甲醇诱导阶段，在补料发酵阶段和甲醇诱导阶段，由氧气发生器制得的高浓度氧气流入氧气储罐，然后与进入发酵罐的空气混合，使之氧气含量在40%－60%，以1.00vvm的流量通入发酵罐，以维持发酵罐内发酵液氧的浓度高于同温同压下空气中的氧气在初始培养液中溶解度的30%。应用于上述甲醇型毕赤酵母的高密度发酵工艺中的酵母高密度培养设备，包括由管道依次连接的氧气发生器、氧气储罐、气水分离器、膜过滤器以及发酵罐。本发明可以防止发酵过程因缺氧而导致的发酵产率的降低，并可以提高氧的利用率。