槲皮素用于制备治疗局灶性脑缺血再灌注损伤的药物的用途[0002]随着社会环境因素和饮食结构的改变，人类缺血性脑血管疾病的发病率日益增加；局灶性脑缺血常导致患者感觉障碍、短暂性眩晕、失语等神经功能障碍，严重者可导致偏瘫、意识障碍或猝倒发作等； 一般来说，脑缺血发生后4.5小时内溶栓治疗是有效的，但只有少数病人能在这期间得到治疗，而且传统的溶栓治疗会增加颅内出血的风险，目前脑缺血的治疗已经到了瓶颈。急性脑缺血后大量的自由基生成，引起脑内脂质过氧化作用加强，导致细胞膜、线粒体膜及血脑屏障损害，引起和加重缺血和脑组织水肿。脑组织对自由基的损伤极为敏感，在缺血性脑损伤中，缺血过程固然可产生大量的自由基，但大量研究表明再灌注期间生成更多。在缺血性脑损伤中自由基反应启动于缺血期，但明显过氧化反应却发生在再灌注期，因此在再灌注期脑组织的损伤更大。寻找有效的方法预防脑组织缺血后的炎症反应及氧化应激损伤具有重要意义。[0003]槲皮素是黄酮类化合物中的一种，化学名为3，5，7，3’，4’ -五羟基黄酮，为多酚类化合物，化学式C15HltlO7，分子量302.24，广泛存在于水果、蔬菜以及一些中药中。槲皮素可溶于二甲基亚砜(DMSO)、甲醇、乙醇、冰醋酸、丙酮等，但不溶于水。目前已证明的槲皮素的药理作用有:祛痰平喘、治疗慢性支气管炎、抑制细胞的增殖或诱导细胞凋亡(如肿瘤)、抗炎、抗氧化等。大量的体外实验表明槲皮素可通过直接清除活性氧自由基、抑制低密度脂蛋白及DNA氧化损伤等途径发挥抗氧化作用，对各种因素所致的炎症反应及氧化应激有抑制作用。
[0004]本发明的目的在于提供槲皮素用于制备治疗局灶性脑缺血再灌注损伤的药物的用途，为有效治疗局灶性脑缺血再灌注损伤、改善患者的认知与运动功能提供了新的途径。[0005]本发明制备的“局灶性脑缺血”大鼠模型即为模拟人类脑缺血疾病。在本发明实施例中，大鼠局灶性脑缺血可引起缺血部位早期水肿、炎症以及后期萎缩，恢复血液再灌注后炎症进一步加重，缺血性损伤更为明显，引起大鼠认知与运动功能的缺陷；槲皮素具有显著的抗炎作用，能够减轻缺血急性期的水肿及炎症反应，抑制体内炎症因子的释放，减少脑缺血梗死部位的体积，从而减轻缺血后期脑组织的萎缩程度；脑缺血可刺激成年哺乳动物中枢神经系统神经干细胞的发生和增殖，但是这些神经干细胞大部分在2周左右死亡，无法正常发挥作用，如果给局灶性脑缺血大鼠使用槲皮素可明显延长神经干细胞的存活时间，在缺血3~4周时这些细胞仍然存活，并向神经胶质细胞或神经元方向转化，发挥一定的功倉泛。[0006]本发明进一步提供了用于制备治疗局灶性脑缺血再灌注损伤的药物优选的槲皮素药物制剂，即槲皮素的DMSO制剂，充分利用DMSO本身具有的消炎止痛、促进血液循环以及利尿等作用，而且DMSO具有强渗透力，能增加药物吸收、促进药物在体内快速发挥作用。[0007]由于槲皮素为脂溶性药物，不溶于水，可溶于DMS0，但多量使用DMSO对人体具有一定的毒性，因此，本发明经过摸索，在保证疗效的同时尽可能降低DMSO的使用浓度，确定了以下的优选制备方案:[0008](I)称取槲皮素适量，溶于无菌DMSO中，使其终浓度为0.66mol/L，置于4°C冰箱避光保存，作为储存液备用；
[0009](2)临用前用预先温热的无菌生理盐水将储备液稀释100倍，使用浓度为IOmg/
kg ο
[0010]本发明采用先制备储备液、再用生理盐水进行稀释的方法来有效降低DMSO的使用量，因此，本发明制备的DMSO-槲皮素药物形式既可保证槲皮素最大限度地发挥药物作用，又可有效降低DMSO对生物体的毒性。
[0011]关于本发明所述的槲皮素用于制备治疗局灶性脑缺血再灌注损伤的药物的作用机制，发明人认为与槲皮素的抗炎、抗氧化作用有密切关系。而且，发明人的体外实验表明，槲皮素能够抑制受损星形胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白表达，明显抑制胶质疤痕的形成，促进损伤细胞功能的恢复 ，减少受损神经细胞的死亡。业内所知，胶质细胞是脑内主要细胞之一，约占脑内细胞总量的90%以上，在营养、支持与神经元再生方面具有重要作用；但是脑缺血损伤后，损伤部位容易形成胶质疤痕，影响正常神经元功能的发挥。因此，将槲皮素制备成治疗局灶性脑缺血再灌注损伤的药物，有助于抑制损伤部位的胶质疤痕的形成，恢复正常神经元功能。



[0012]图1为大鼠缺血脑组织TTC染色图片，显示大鼠局灶性脑缺血再灌注术后第2天，脑组织切片TTC染色结果；图中，箭头所指为大鼠脑缺血部位。
[0013]图2为大鼠脑核磁共振(MRI)图像。
[0014]图2A为DMSO对照组术后7天脑MRI图像，图2B为DMSO对照组术后28天脑MRI图像，图2C为槲皮素治疗组术后7天脑MRI图像，图2D为槲皮素治疗组术后28天脑MRI图像。在图2A至图2D中箭头所指为大鼠脑缺血部位。
[0015]图3为大鼠脑PET-CT图像。
[0016]图3A为DMSO对照组术后第7天脑PET-CT图像，图3B为DMSO对照组术后第28天脑PET-CT图像，图3C为槲皮素治疗组术后第7天脑PET-CT图像，图3D为槲皮素治疗组术后第28天脑PET-CT图像。在图3A至图3D中箭头所指为大鼠脑缺血部位。
[0017]图4为大鼠水迷宫实验结果图。
[0018]图5为大鼠转棒疲实验结果图。
[0019]图6A为大鼠血清中IL-4的表达水平图。
[0020]图6B为大鼠血清中IL-6的表达水平图。
[0021]图6C为大鼠血清中IL-13的表达水平图。
[0022]图6D为大鼠血清中TNF-α因子的表达水平图。[0023]图7为大鼠缺血脑组织切片免疫荧光染色图片。
[0024]图7A为DMSO对照组7天GFAP免疫荧光染色图片，图7B为DMSO对照组28天GFAP免疫荧光染色图片，图7C为槲皮素治疗组7天GFAP免疫荧光染色图片，图7D为槲皮素治疗组28天GFAP免疫荧光染色图片。在图7A至图7D中，绿色为GFAP阳性染色，蓝色为DAPI染细胞核，显微镜放大倍数均为200倍。
[0025]图7E为DMSO对照组7天β -tubulin免疫荧光染色图片，图7F为DMSO对照组28天β -tubulin免疫突光染色图片，图7G为槲皮素治疗组7天β -tubulin免疫突光染色图片，图7H为槲皮素治疗组28天β-tubulin免疫荧光染色图片。在图7E至图7H中，绿色为β -tubulin阳性染色，蓝色为DAPI染细胞核，显微镜放大倍数均为200倍。

[0026]为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0027]实施例1:大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型实验
[0028]大鼠局灶性 脑缺血再灌注损伤模型采用线栓法制作。在模型制作前准备线栓，用尼龙线自制，长度约4cm，头端粘胶稍膨大，可更好地阻塞大脑中动脉起始部，线栓使用前用无菌生理盐水浸泡。模型制作时选取SPF级SD雄性大鼠，体质量220-240g，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3.5ml/kg体重)，将大鼠固定于手术操作台，常规消毒，取颈正中切口，切开皮肤皮下组织，暴露切断二腹肌肌腹，分离右颈总动脉，结扎颈总动脉近心端，向上分离找到颈内动脉与颈外动脉的分叉口，从颈外动脉45°斜切口插入线栓，经分叉口进入颈内动脉，从颈内动脉将线栓送至颅内，遇轻微阻力而止，此时线栓头端已达大脑中动脉起始部，将线栓停止在此位置，阻断大脑中动脉血流，使中动脉供血脑组织缺血；简单缝合切口，2小时后拔出线栓，实现缺血脑组织再灌注，仔细缝合伤口 ；术后给予适当的护理，足量饮食喂养，保证饲养环境的温度、湿度与光照。
[0029]模型制作完毕待动物清醒后，观察动物的行为表现，制模成功的动物表现较迟钝、不活泼；损伤侧眼球较突出；行动时绕着损伤侧转圈，不能直线行走，出现偏瘫症状；提尾倒悬时损伤侧前肢不能向前用力伸直，说明损伤侧肢体运动功能受损。
[0030]模型制作后因动物损伤较大，影响其进食，大鼠体重逐渐减轻，直至2~3周才能恢复其原有体重。
[0031]槲皮素的配制方法包括如下步骤:
[0032](I)电子天平称取槲皮素粉末200mg，溶于Iml无菌DMSO溶液中，混匀，使其终浓度为0.66mol/L，置于4°C冰箱避光保存，作为储存液备用；
[0033](2)给动物注射前用移液器吸取IOOul储备液，用IOml预先温热的无菌生理盐水稀释；因DMSO有一定的毒性，以此降低DMSO用于体内的浓度。
[0034]所有实验动物分成三组，其中一组为假手术组，只与模型动物一样做相同的外科手术切口，但不插入线栓，不阻塞血流，也不给予治疗；另两组为局灶性脑缺血再灌注模型动物，其中一组给予治疗(以下称为“槲皮素治疗组”)，缺血再灌注I小时后开始使用上述配制好的槲皮素，以10mg/kg的用药量(例如，体质量为200g的大鼠则给予槲皮素稀释液Iml)腹腔注射，每天I次，连用7天，注意不要将药物注射到动物肠壁，否则容易引起肠粘连；另一组模型动物不给予槲皮素(以下称为“DMSO对照组”)，只给予DMSO稀释液(即只用IOml无菌生理盐水稀释IOOul DMS0，不含槲皮素)腹腔注射，每天I次，连用7天，作为对照。
[0035]治疗期间从动物的大体表现来看，槲皮素治疗组的大鼠状态明显好于DMSO对照组大鼠，行为较活泼，偏瘫症状较早消失；槲皮素治疗组动物胃口明显好于DMSO对照组动物，体重减轻的程度以及死亡率均较低，具体数值见表1。表1治疗期间实验动物的体重变化
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