专利名称：一种从人胚胎干细胞分化成神经细胞的方法细胞移植治疗神经系统疾病是当今生物医学研究的一个热门领域，尽管目前细胞治疗已经取得很大进展，但由于细胞来源及供体短缺等因素，限制了其临床应用的步伐，同时也带来伦理道德的争论。胚胎干细胞是能在体外培养的高度未分化细胞，具有多潜能性， 可以诱导分化成多种组织细胞。将胚胎干细胞定向诱导分化成特定类型的神经细胞，不但可以解决上述问题，还可以使供体细胞对不同神经系统疾病更具靶向性。胚胎干细胞体外分化为神经细胞的研究始于1981年，迄今为此，诱导胚胎干细胞分化为神经细胞的方法通常有无血清诱导法、全反式维甲酸诱导法、可溶性因子诱导法、基质细胞共培养法等。人胚胎干细胞定向分化面临的一个关键问题就是分化效率和分化细胞的均勻性。胚胎干细胞在培养和分化过程中，如果细胞以悬浮方式培养时，它们会聚集形成球状细胞团(拟胚体)。拟胚体一般具有外、中、内三胚层结构，且其体外生长分化能够模拟正常胚胎的发育过程。目前，胚胎干细胞定向分化的研究很大部分都是围绕这一基础进行的。然而，这一方法也存在着诸多弊端，首先三胚层结构复杂，细胞种类多且分布不均；其次操作程序繁杂，前期需要制作拟胚体，后期还得筛选目的细胞。本发明的基本策略是使人胚胎干细胞在单细胞的状态下尽快贴壁，避免其形成拟胚体状态，不仅排除各胚层细胞之间复杂的相互作用的干扰，且使得所有的胚胎干细胞处于均一的分化环境。丁酸钠属于一类短链脂肪酸，它能够抑制组蛋白脱乙酰基酶的活性，2003年 Geron公司研究人员发现丁酸钠可通过拟胚体途径诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞， 随后也有文献报道丁酸钠可诱导胚胎干细胞分化为胰腺细胞，这说明丁酸钠抑制组蛋白脱乙酰化作用并不是针对某类细胞谱系特异基因所在的染色质特定区域，它只是随机地松散染色质。本发明先利用丁酸钠打破组蛋白乙酰化的平衡，促使染色质松散，从而抑制胚胎干细胞增殖，使其尽快进入分化状态；结合单层直接贴壁分化方法并添加特定的诱导培养基， 即可在相对短的时间里获得高比例的神经细胞。
本发明目的是提供一种在体外将人胚胎干细胞诱导分化成神经细胞的新方法，所述方法是以丁酸钠作为分化诱导剂，联合神经诱导培养液，通过人胚胎干细胞直接单层贴壁、二步诱导途径实现的。本发明所用细胞材料和试剂说明如下A，人胚胎干细胞(hESCs)本发明所述人胚胎干细胞可以以任何方式获得，都可用于本发明，如各种文献中公开确立的hESCs，保藏机构或者商家购买得到的hESCs，流产胚胎或不同发育阶段的囊胚分离得到的hESCs均可，本发明采用的Hl人胚胎干细胞系购自WiCell Research Institute, Madison WI, USA.，NIH 编号 WA01，参见 http://wicell. org八B，培养液及试剂本发明所用培养液可在常用的细胞基本培养基的基础上补充一种或多种成分而得到。可用于本发明的细胞基本培养基可以包括但不仅限于DMEM、MEM、RPMI1640, F_10、 F12、α MEM、KO-DMEM以及IMDM。这些培养基的配方是本领域所公知的，不仅在普通教科书和实验手册中有详细描述，而且还可以直接以成品的形式从公司购买获得。作为补充物的成分可以是任何维持或促进细胞生长的成分。他们可以包括但不限于氨基酸、维生素、蛋白、激素、金属离子、微量元素、脂肪酸、糖等等。作为举例，本发明可使用包含如下成分组合的培养基，除非另外指出，本发明所用试剂均购自invitrogen公司。(1)人胚胎干细胞培养液基本培养基K0-DMEM补充物(维持或促进细胞生长的营养物质)10% KO-血清替代物；10%胎牛血清；2mM L-谷氨酰胺；0. ΙπιΜβ-巯基乙醇；非必需氨基酸；10U/ml人白细胞抑制因子(LIF) ； 100U/ml青霉素；100ug/ml链霉素；4ng/ml人重组碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) ；ρΗ7· 0 7. 4。(2)诱导培养基I:基本培养基DMEM补充物(维持或促进细胞生长的营养物质)15%胎牛血清；2mM L-谷氨酰胺；ImM硫代甘油(MTG) (sigma) ；非必需氨基酸；100U/ml青霉素；100ug/ml链霉素； ρΗ7· 0 7. 4。(3)诱导培养基II:基本培养基KO-DMEM补充物(维持或促进细胞生长的营养物质)50% Ν2/Β27 ；ImM硫代甘油(MTG) (sigma) ；2mM L-谷氨酰胺；0. ΙπιΜβ -巯基乙醇；1 %非必需氨基酸；10U/ml人白细胞抑制因子(LIF) ； 100U/ml 青霉素；100ug/ml 链霉素；ρΗ7· 0 7. 4。本发明提供一种从人胚胎干细胞诱导分化神经细胞的方法，所述方法为将人胚胎干细胞进行分离纯化，获得人胚胎干细胞单体，将人胚胎干细胞单体按1 5 X IO4个/cm2 的细胞密度接种进行单层贴壁诱导培养，所述诱导培养是以丁酸钠结合诱导培养基I对人胚胎干细胞进行预诱导，再以诱导培养基II进行分化诱导培养，获得神经细胞；所述诱导培养基I以DMEM为基础培养基，还包含维持或促进细胞生长的营养物质；所述诱导培养基II 以KO-DMEM为基础培养基，还包含维持或促进细胞生长的营养物质。进一步，优选所述人胚胎干细胞按3 X IO4个/cm2的细胞密度进行单层贴壁诱导培养。所述诱导培养基I以DMEM为基础培养基，加入终浓度如下的营养物质15%胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，ImM MTG，1 %非必需氨基酸，100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素。所述诱导培养基II以KO-DMEM为基础培养基，加入终浓度如下的营养物质50% 的N2和B27血清替代物，15% KO-血清替代物，2mM L-谷氨酰胺，ImM MTG, 1 %非必需氨基酸，100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素。所述丁酸钠在诱导培养基I中的终浓度为1 10mM，优选1 5mM，更优选2. 5mM。所述诱导培养是以丁酸钠结合诱导培养基I对人胚胎干细胞于37°C，5% CO2, 100%湿度条件下预诱导培养1 3天，倾去培养液，再加入诱导培养基II中继续于37°C， 5% CO2,100%湿度条件下分化培养8 14天，获得所述神经细胞。进一步，所述预诱导培养优选2天，分化诱导培养优选8 12天。进一步本发明从人胚胎干细胞诱导分化神经细胞的方法所述诱导方法包括如下步骤(1)人胚胎干细胞的扩增和纯化；( 人胚胎干细胞单层贴壁及预诱导；C3)神经细胞的分化诱导形成，具体为(1)分离纯化人胚胎干细胞；将人胚胎干细胞接种至0. 1 2%明胶包被的培养孔板中的小鼠成纤维饲养层细胞上，于人胚胎干细胞培养液中，37°C，5% C02，100%湿度条件下培养5 8天，获得小鼠成纤维细胞和扩增后人胚胎干细胞的细胞混合物；获得的细胞混合物于消化液中，37°C 消化5分钟，获得悬浮液并置于含人胚胎干细胞培养液的0. 1 2%明胶包被的培养瓶中， 37°C贴壁培养1 2h，小鼠成纤维饲养层细胞将贴壁，而人胚胎干细胞大部分仍悬浮于培养液中，收集培养液离心，弃去上清液后获得扩增的人胚胎干细胞单体；所述消化液为终浓度0. 05%胰蛋白酶和终浓度0. 02%乙二胺四乙酸(EDTA)混合溶液，所述人胚胎干细胞培养液以KO-DMEM为基础培养基，加入终浓度如下的物质10% 1胎牛血清，10% KO-血清替代物，2mML-谷氨酰胺，0. ImM 2-β -巯基乙醇，1 %非必需氨基酸，10U/ml人白细胞抑制因子(LIF)，100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素和10U/ml碱性成纤维细胞生长因子，pH7. 0 7.4；(2)人胚胎干细胞单层贴壁及预诱导；将步骤(1)分离纯化后的人胚胎干细胞单体以3 X IO4个细胞/cm2的密度接种于10 μ g/ml多聚赖氨酸包被的培养孔板上，于含2. 5mM 丁酸钠的诱导培养基I中37°C，5% CO2,100%湿度条件下培养2天，倾去培养液；(3)神经细胞的诱导形成；步骤⑵所得的细胞于诱导培养基II中37°C,5% CO2,100%湿度条件下继续分化培养10天，即获得所述神经细胞。本发明所述方法获得的神经细胞至少具有如下特征之一(1)具有典型的细胞体、轴突和树突等细胞结构；(2)至少表达以下蛋白=NeuroD ^P β-tublin III ；(3)神经细胞占诱导细胞群体85%左右；(4)对外界刺激具有放电功能。与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在相比现有的拟胚胎途径或共培养诱导神经细胞的方法，本发明可克服其细胞异质程度大，分化效率低、不便实时观察和操作，需要后期分选过程等弊端。具有操作简便、诱导周期短(10 12天)、细胞分化均一度高(比例高达85% )等优点；丁酸钠是一种短链脂肪酸分化诱导剂，它是通过抑制组蛋白脱乙酰基酶活性来介导细胞分化，本发明利用丁酸钠预处理人胚胎干细胞抑制其增殖，促进其尽快进入分化状态，在人胚胎干细胞单层贴壁(非拟胚体)的状态下运用诱导培养基 II即可高效诱导其向神经细胞定向分化，神经细胞占诱导细胞群体85%左右，明显高于目前文献报道的诱导效率。电生理检测发现该神经细胞具有惊厥样放电功能。图1为本发明神经细胞分化诱导流程图；图2为本发明神经细胞的免疫细胞化学结果，A为诱导12天的神经细胞β-tublin III免疫细胞化学结果，B为相差图；图3为本发明神经细胞的Wfestern blot分析；图4为本发明神经细胞的流式细胞分析，B为本发明神经细胞，A为同型对照；图5为本发明神经细胞的电生理检测；步骤(1)将实施例1方法获得的神经细胞加入3ml预热至35°C，用杜氏磷酸缓冲液 (DPBS)漂洗细胞两次，每次:3min ；(2)加入:3ml 4%多聚甲醛固定液，室温固定30min ；(3) DPBS 漂洗 3 次，每次!3min。用含去垢剂(Triton X-100)的 DPBS 在 37°C 温育30分钟。(4)加入3ml含5%山羊血清的DPBS (封闭液)，室温下作用30min。(5)用枪头吸弃封闭液后，加入1 500稀释的鼠抗人β-tublin III单抗 (Millipore 公司)。4°C过夜(18h 以上)。(6)用枪头吸弃一抗反应液，用DPBS漂洗3次，每次5min。(7)加入1 200稀释的羊抗鼠荧光二抗(Millipore公司)，37°C避光温育lh。(8)用枪头吸弃第二抗体反应液后，用DPBS漂洗两次，每次5min。(9)双蒸水漂洗2次，荧光显微镜(Nikon)下观察并拍照记录，如图2显示，A为诱导12天的神经细胞β -tublin III免疫细胞化学结果，B为相差图。2、Western-blot 分析收集实施例1方法诱导0天，2天，7天，12天(整个诱导过程的时间)的神经细胞， 用4°C预冷的磷酸缓冲液PBS洗三次后，加入裂解液(50mMTris-HCl，pH8. 0,150mM NaCl, 100 μ g/ml PMSF, 1 % TritonX-100)冰上裂解 30min，12000g 离心 5min，去除细胞碎片后，取 50 μ g样品与上样缓冲液(上海生物工程有限公司)混合，煮沸5min，进行10%的SDS-PAGE 胶进行电泳，转硝酸纤维素膜(Pall Corporation)，将膜在含5%脱脂奶粉的TBSTdOmM Tris-HCl，pH7. 5，150mM NaCl,0. 05% Tween-20)中室温下封闭 Ih，随后加入鼠抗人NeuroD 和β -tublin III 一抗，抗鼠IgG-HRP 二抗，ECL化学发光试剂(Invitrogen公司)检测， 如图2所示。图3中显示神经细胞特异标志(NeuroD和β-tublin III)表达量随着诱导时间延长而增加，胚胎干细胞特异标志0ct4因细胞分化而消失。β -actin为内参。3、流式细胞分析(1)实施例1方法诱导12天的神经细胞，200 X g离心5min后用4°C DPBS漂洗两次。(2)重悬于0. 5ml的4°C的4%多聚甲醛中，18- °C温育10分钟。间歇地涡旋管子以维持单细胞悬液。(3) DPBS 漂洗 2 次，每次 3min。200Xg 离心 5min。(4)用含去垢剂(Triton X-100)的 DPBS 在 37°C温育 30 分钟。(5) 200Xg离心5min，弃上清后加入3ml含5%山羊血清的DPBS (封闭液)，室温下作用30min。(6)2008离心5!1^11，弃上清后加入1 40稀释的FITC标记过的β-tublin III 单抗(Thermo公司)；加抗体稀释液作为同型对照。室温孵育2小时。(7) 200 X g离心5min，弃上清，用DPBS漂洗2次，每次5min。(8) 200 X g离心5min，弃上清后每管用200_400uL的DPBS重悬细胞，上流式细胞仪(FACSCalibur，BD公司)进行检测分析。
图4中B显示诱导细胞中神经细胞比例约占85%，A图为同型对照。4、电生理检测培养皿中的培养测试腔内加入150 μ 1的10μ g/ml多聚赖氨酸表面处理液，37°C 培养箱中放置M小时，然后用灭菌双蒸水将培养皿漂洗3次，铺入实施例1获得的神经细胞，37°C、5% CO2培养3天，再对神经细胞进行无镁细胞外液37°C处理3h。采用LAPS芯片系统(浙江大学开发)检测诱导出的神经细胞电位，结果如图5所示。无镁细胞外液主要成分145mMNaCl, 2. 5mM KCl，IOmM Hepes,2mM CaCl2, IOmM 葡萄糖，0. 002mM甘氨酸，pH 7. 3，并用葡萄糖调节渗透压至325mM。图5中显示神经细胞经无镁诱导后惊厥样电位信号(上)及自发电位信号(下)。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。


本发明公开了一种从人胚胎干细胞诱导分化神经细胞的方法，所述方法为将人胚胎干细胞进行分离纯化，获得人胚胎干细胞单体，将人胚胎干细胞单体按1～5×104个/cm2的细胞密度接种进行单层贴壁诱导培养，所述诱导培养是以丁酸钠结合诱导培养基I对人胚胎干细胞进行预诱导，再以诱导培养基Ⅱ进行分化诱导培养，获得神经细胞；本发明可克服已有分化方法中神经细胞异质程度大，分化效率低、不便实时观察和操作，需要后期分选过程等弊端，具有操作简便、诱导周期短(10～12天)、神经细胞均一度高(比例高达85％)等优点，电生理检测发现该神经细胞具有惊厥样放电功能。