专利名称：人胚源性神经干细胞分化诱导过程中的细胞克隆诱导分化方法神经干细胞是一种具有自我更新及广泛分化潜能的细胞，它处于分化的非终末状态，可通过对称或不对称分裂出新的干细胞或分化潜能逐渐变小的子细胞，最终产生中枢神经系统的3种主要细胞，即神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。人胚来源的神经干细胞除具有上述特点外，更以其与人体组织相容性好的的优点成为神经移植治疗的理想细胞。目前诱导神经干细胞体外分化的方法很多，最常用的是血清，而神经干细胞在脑脊液中的存活和分化情况尚不明确。本发明通过神经干细胞在脑脊液环境中的培养，为神经干细胞的移植治疗提供理论依据。
为实现本发明的目的，本发明提出一种人胚源性神经干细胞分化诱导过程中的细胞克隆诱导分化方法，其应用于人胚源性神经干细胞分化为神经细胞的正常成人脑脊液诱导过程，所述诱导过程应用正常成人脑脊液培养基(DMEM/F12+B27+30%脑脊液)将原代培养的人胚来源的神经干细胞分化诱导为各类神经细胞，在分化的不同时间对分化的细胞进行免疫细胞化学染色，计算各类神经细胞的比例。最终分别占(10. 88士0.79)%、 (86. 70 士 1. 99) %，少突胶质细胞很少只有0 % 2 %。具体的，本发明的人胚源性神经干细胞分化为神经细胞的正常成人脑脊液诱导过程包括如下步骤Sl 原代细胞的分离和培养取胚龄13周水囊引产的新鲜人胚胎，无菌条件下分离出胚胎大脑皮层组织，剥除脑膜及表面血管，在PBS液中漂洗3次，用细吸管反复吹打组织碎块至完全散开，离心洗涤后吹打制成细胞悬液，经100目不锈钢滤网过滤，制成单细胞悬液，加入含 B 27(1 50) (GibcoBRL)和 EGF (Serotec. )20ng/ml、bFGF (Chemicon) 20ng/ ml的DMEM/F12(1 1) (GibcoBRL)无血清培养基，台盼蓝染色计数活细胞，调整细胞浓度为IX 105/ml，将原代细胞种植于25cm2培养瓶(8ml细胞悬液/瓶)，37°C、5 % (X)2条件下静置培养。S2:克隆诱导分化选取单细胞形成的克隆球，机械分离成单细胞悬液，种植于多个培养皿中，置入多聚赖氨酸包被的玻片，用含有正常成人脑脊液培养基(DMEM/ F12+B27+30%脑脊液)培养，观察其生长分化情况，分别于1、3、7、14、21d行免疫细胞化学染色检测。S3 免疫细胞化学染色将贴附有细胞的玻片取出用4%多聚甲醛固定，用SABC组织化学染色试剂盒分别检测神经微丝(neurofilament，NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、 feilc在分化细胞中的表达。S4 细胞计数免疫细胞化学染色NF(+)的细胞代表神经元，GFAP (+)细胞代表星型胶质细胞，Galc (+)细胞代表少突胶质细胞，苏木精复染成蓝色的细胞代表总细胞数。倒置显微镜下O0X)对分化的细胞随机选择6个独立视野计数NF (+)的细胞数、GFAP (+)细胞数、Galc (+)细胞数及总细胞数，计算各系细胞比例并求其平均数。本发明的实验结果表明，在最早期的分化当中神经元占的比例较高，约为 27. 25%，正常成人脑脊液能诱导人胚来源的神经干细胞分化成神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞，与在胎牛血清中的分化相比星型胶质细胞比例增多，而其他类型细胞比例无显著性差异。神经干细胞在脑脊液中可以存活和分化，为神经干细胞的移植治疗提供理论依据。通过下面结合附图的详细描述，本发明前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中图1所示为本发明的人胚源性神经干细胞分化为神经细胞的正常成人脑脊液诱导方法的步骤示意图。实验结果及分析如下人胚来源的神经干细胞在体外悬浮生长，常聚集成球即神经球(neurosphere)。 将生长良好的神经球种植在经多聚氨酸处理的培养皿中，在含有正常成人脑脊液培养基 (DMEM/F12+B27+30%脑脊液)中可发现神经球贴壁现象。神经球在新鲜正常成人脑脊液中的分化过程与在胎牛血清中的相似，只是贴壁时间较晚04 48h)，贴壁的神经球有 50% 90%，未贴壁的神经球将逐渐死亡。贴壁的神经球2天后，周围即有细胞分化游出， 神经球的直径放射状扩大，聚集着许多由神经球中迁移出来的单极和多极细胞，形状酷似神经元和神经胶质细胞。随着时间延长，神经球周围游离出来的细胞越来越多，这些细胞通过突起与邻近细胞形成联系，3周以后这些细胞不再增多，呈稳定状态。免疫细胞化学显示，含有正常成人脑脊液培养基中，从神经球中游离分化出的细胞成单极或多极，细胞化学分别为NF(+)细胞、GFAP(+)细胞和细胞。其中NF(+) 细胞由开始时的06士3.40) %降至(10. 00士0. 74)%，GFAP⑴细胞数逐渐增多，从 (73. 53% 士3. 40)%升至(89. 83% ±1.96) %0 Galc (+)细胞在整个分化过程中均很少， 且在1周后才出现，约占0% 1.8%。NESTIN阳性细胞数成直线下降，贴壁神经球细胞呈 Nestin抗原全阳性，使整个神经球体成蓝色(间接荧光染色)，14d时尚可见部分阳性细胞， 21d尚有少量Nestin表达，30d后Nestin染色几无阳性表现。以上结果表明，在最早期的分化当中神经元占的比例较高，约为27. 25%，正常成人脑脊液能诱导人胚来源的神经干细胞分化成神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞，与在胎牛血清中的分化相比星型胶质细胞比例增多，而其他类型细胞比例无显著性差异。神经干细胞在脑脊液中可以存活和分化，为神经干细胞的移植治疗提供理论依据。本发明并不局限于所述的实施例，本领域的技术人员在不脱离本发明的精神即公开范围内，仍可作一些修正或改变，故本发明的权利保护范围以权利要求书限定的范围为准。


本发明提出一种人胚源性神经干细胞分化诱导过程中的细胞克隆诱导分化方法，其应用于人胚源性神经干细胞分化为神经细胞的正常成人脑脊液诱导过程，所述诱导过程包括如下步骤原代细胞的分离和培养；克隆诱导分化；免疫细胞化学染色；以及细胞计数。本发明应用正常成人脑脊液培养基将原代培养的人胚来源的神经干细胞分化诱导为各类神经细胞，在分化的不同时间对分化的细胞进行免疫细胞化学染色，计算各类神经细胞的比例。其诱导人胚来源的神经干细胞分化成神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞，与在胎牛血清中的分化相比星型胶质细胞比例增多，而其他类型细胞比例无显著性差异。神经干细胞在脑脊液中可以存活和分化，为神经干细胞的移植治疗提供理论依据。