专利名称：温敏聚异丙基丙烯酰胺－聚精氨酸缀合物转基因载体的制备的制作方法 基因治疗(gene therapy)是分子生物学与现代医学相结合的产物，是利用最先进的生命科学和临床医学的技术，通过导入正常或野生型(wild type)基因矫正或置换致病基因的一种治疗方法。将基因导入目的细胞需要长期有效的载体。目前为止，科学家们已经开发了许多转基因载体，具体可以分为两类病毒类载体和非病毒类载体。病毒载体包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒载体和单纯疱疹病毒载体等；非病毒载体包括裸DNA、脂质体、高聚物载体和人造染色体等。高分子载体作为非病毒载体的一部分，它既存在非病毒载体的特点(即低毒性，低免疫源性和低致病性)以外，还有自身的优势，就是对转导的基因的尺寸没有限制，有利于其作为转基因载体的应用。但与病毒载体相比来说，其可控性较差，因此现在主要的任务，就是提高其转染的可控制性，进而提高其转染效率。刺激响应性为非病毒载体的可控制性提供了很好的帮助。其刺激分为内在的刺激如pH值和特异性酶，以及外在的刺激如超声、光、温度等，其中温度刺激以其设计方便，调解灵活的特点受到了极大的关注，被广泛用于药物控制释放领域。对于温度响应聚合物来说，聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)在其低临界溶解温度(LCST在32-34℃)以下溶于水，高分子链段呈无规线团状；温度高于LCST时，PNIPAAm从水中析出，链段呈密实的小球。异丙基丙烯酰胺与阳离子单体共聚形成的共聚物既保持温度响应性，又具有复合DNA的功能，因而，通过改变温度，利用PNIPAAm的相变可实现对DNA结合和解离的调控。近年来，一些异丙基丙烯酰胺共聚物转基因载体被研制成功，并得到了很好的转染结果。Hinrichs等将异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)与N，N’-(二甲基胺乙基)甲基丙烯酸酯(DMAEMA)的共聚物作为温度和pH值响应的基因治疗载体，结果显示，NIPAAm对于DMAEMA的细胞毒性有明显的屏蔽效应，高分子量的共聚物对卵巢癌细胞的转染效果较好，但未能得出聚合物的LCST和转染之间的相关性。Okano研究组将疏水单元甲基丙烯酸丁酯(BMA)引入到PNIPAAm-co-DMAEMA体系，形成三元共聚物。并在不同的条件下研究了其对非洲猴的肾细胞(COS-1)的体外转染情况，得到了温度对于转染调控的直接证据短暂的低温培养(低于PNIPAAm的LCST)使PNIPAAm链锻水合伸展，DNA外露，有利于基因表达。同时研究人员也提出了一个新的观点温度控制的基因的表达对于未来的基因治疗是非常重要的。Twaites等人合成了PEI-NIPAAm和NIPAAm-co-DMAEMA-co-HA(己基丙烯酸)聚合物，初步的转染实验的结果表明，实验中的载体都具有将质粒DNA运送到细胞核的能力，但在小鼠的肌细胞(C2C12)中的蛋白表达水平较低。所有的实验结果揭示，合成有适当官能团和分子结构的温敏性聚合物对于复合物形成过程的可逆性、细胞的吸收和转染效率的提高都有着重要的作用。有文献报道，富精氨酸序列的寡肽和多肽具有较强的跨膜能力，可提高外源基因的内在化能力。聚精氨酸(PArg)已被尝试用作转基因载体，在合适的浓度下可成功介导半乳糖酶报告基因对208F小鼠成纤维细胞的转染。与本发明有关的参考文献如下[1]Hinrichs WLJ，Schuurmans-Nieuwenbroek NME，Wetering P，Hennink WE.Thermosensitive polymersas carrier for DNA delivery.Journal of Controlled Release.1999；60249-59[2]Takeda N，Nakamura E，Yokoyama M，Okano T.Temperature-responsive polymeric carriersincorporating hydrophobic monomers for effective transfection in small doses.Journal of ControlledRelease 2004；95343-55. Twaites BR，Alarcón CH，Cunliffe D，Lavigne M，Pennadam S，Smith JR，Górecki DC，Alexander C.Thermo and Ph responsice polymer as gene delivery vectorseffect of polymer architecture on DNAcomplexation in vitro.Journal of Controlled Release.2004；97551-66[4]Jones SW，Christison R，Bundell K，Voyce CJ，Brockbank SMV，Newham P，Lindsay MA.Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery.British Journal of Pharmacology(2005)145，1093-102[5]Emi N，Kidoaki S，Yoshikawa K，Saito H.Gene transfer mediated by polyarginine requires a formationof big carrier-complex of DNA aggregate.Biochemical Biophysical Research Communication 1997；231421-4.


本发明的目的在于提供一种温度敏感性转基因载体聚异丙基丙烯酰胺-聚精氨酸缀合物(PNIPArg)的制备方法。其制备方法简单，合成条件温和，以该方法制备的聚异丙基丙烯酰胺-聚精氨酸缀合物具有转基因的能力并能实现对于DNA运输和表达的调控。
本发明通过下述技术方案(即为专利申请的关键技术)加以实现一种温度敏感性聚异丙基丙烯酰胺-聚精氨酸缀合物的制备方法，所述的温敏性聚异丙基丙烯酰胺-聚精氨酸缀合物的结构式，如下式所示 其制备方法，特征包括以下步骤1.用四氢呋喃(THF)相自由基引发聚合体系，合成羧基封端的聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)。
将异丙基丙烯酰胺溶解于四氢呋喃中，磁力搅拌20分钟使之完全溶解，将其加入到100ml的三口烧瓶中。按照与异丙基丙烯酰胺质量比为1-5％，加入引发剂4，4′-偶氮双(4-氰基戊酸)，通氮气30分钟排除反应体系的空气，水浴加热到45-60℃，在氮气保护下反应6-8小时，以乙醚沉淀洗涤产物三次，去离子水溶解产物，透析5天(截留分子量为3500)，冻干。
2.以碳二亚胺将羧基封端的PNIAAm和聚精氨酸(PArg)偶联，得到聚异丙基丙烯酰胺-聚-L-精氨酸生物缀合物(PNIPArg)。
取步骤1反应所得的羧基封端的PNIPPAm溶解于盐酸/N，N，N′，N′四甲基乙二胺缓冲溶液(pH＝4.5-5.5)中，按照与聚异丙基丙烯酰胺质量比为10-20％称取聚精氨酸加入到含有羧基封端的PNIPAAm的缓冲溶液中，并按碳二亚胺与聚异丙基丙烯酰胺的质量比为5∶1-10∶1，加入碳二亚胺，在5-20℃下磁力搅拌反应48-72小时。将产物在32℃离心除去PNIPAAm，收集上清，再于37℃离心，收集沉淀，冷冻干燥得聚异丙基丙烯酰胺-聚-L-精氨酸生物缀合物(PNIPArg)产物。
发明的优点在于制备方法简单，合成条件温和。所制得的聚异丙基丙烯酰胺/聚精氨酸缀合物的低临界转变温度(LCST)为35.5℃，更接近体温，无细胞毒性，在体温下，高分子链段形成紧密的疏水结构有效地包裹DNA，有利于跨膜；DNA导入细胞后，适当的降低培养温度，低于LCST，高分子链段水合，释放DNA，促进DNA的表达，提高转染效率，完成载体通过外界刺激(温度)对DNA结合和释放的调控。

实施例一取2克异丙基丙烯酰胺溶解于25毫升四氢呋喃中，磁力搅拌20分钟使之完全溶解，将其加入到100ml的三口烧瓶中，加入引发剂4，4′-偶氮双(4-氰基戊酸)0.05克，通氮气30min排除反应体系的空气，水浴加热到60℃，在氮气保护下反应7h，以乙醚沉淀洗涤产物三次，蒸馏水溶解产物，透析5天(截留分子量为3500)，冻干。
取100mg上步反应所得样品溶解于盐酸/N，N，N′，N′四甲基乙二胺缓冲溶液(pH＝4.5)中，称取10mg聚精氨酸加入到上述溶液中，并加入20mg碳二亚胺，10℃下磁力搅拌反应72小时。将产物在32℃离心除去PNIPAAm，收集上清，再37℃离心，收集沉淀，冷冻干燥得最终产物。
将得到的最终产物10mg溶于0.1M/0.1M NaAc/HAc缓冲溶液中，同时将适量的含有Luciferase报告基因的PGL3质粒溶于0.1M/0.1M NaAc/HAc缓冲溶液中，滤菌，两者混合配制成PNIPArg/DNA复合物，复合质量比为2/1，静置30分钟后，将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-1细胞不含血清的培基中，转染2小时后，采取不同的控温路线进行转染后的培养(1)37℃48小时，(2)37℃(22小时)→20℃(2小时)→37℃(24小时)。48小时后裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为对于控温路线(1)来说为5.25×103RLU/mg protein；控温路线(2)为6.94×104RLU/mg protein。
实施例二取2克异丙基丙烯酰胺溶解于25毫升四氢呋喃中，磁力搅拌20分钟使之完全溶解，将其加入到100ml的三口烧瓶中，加入引发剂4，4′-偶氮双(4-氰基戊酸)0.02克，通氮气30min排除反应体系的空气，水浴加热到50℃，在氮气保护下反应6h，以乙醚沉淀洗涤产物三次，蒸馏水溶解产物，透析5天(截留分子量为3500)，冻干。
取100mg上步反应所得样品溶解于盐酸/N，N，N′，N′四甲基乙二胺缓冲溶液(pH＝5.0)中，称取20mg聚精氨酸加入到上述溶液中，并加入10mg碳二亚胺，15℃下磁力搅拌反应48小时。将产物在32℃离心除去PNIPAAm，收集上清，再37℃离心，收集沉淀，冷冻干燥得最终产物。
将得到的最终产物10mg溶于0.1M/0.1M NaAc/HAc缓冲溶液中，同时将适量的含有Luciferase报告基因的PGL3质粒溶于0.1M/0.1M NaAc/HAc缓冲溶液中，滤菌，两者混合配制成PNIPArg/DNA复合物，复合质量比为3/1，静置30分钟后，将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-1细胞不含血清的培基中，转染2小时后，采取不同的控温路线进行转染后的培养(1)37℃48小时，(2)37℃(22小时)→20℃(2小时)→37℃(24小时)。48小时后裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为对于控温路线(1)来说为1.73×105RLU/mg protein；控温路线(2)为5.23×105RLU/mg protein。
实施例三取2克异丙基丙烯酰胺溶解于25毫升四氢呋喃中，磁力搅拌20分钟使之完全溶解，将其加入到100ml的三口烧瓶中，加入引发剂4，4′-偶氮双(4-氰基戊酸)0.10克，通氮气30min排除反应体系的空气，水浴加热到45℃，在氮气保护下反应8h，以乙醚沉淀洗涤产物三次，蒸馏水溶解产物，透析5天(截留分子量为3500)，冻干。
取100mg上步反应所得样品溶解于盐酸/N，N，N′，N′四甲基乙二胺缓冲溶液(pH＝5.5)中，称取10mg聚精氨酸加入到上述溶液中，并加入15mg碳二亚胺，20℃下磁力搅拌反应60小时。将产物在32℃离心除去PNIPAAm，收集上清，再37℃离心，收集沉淀，冷冻干燥得最终产物。
将得到的最终产物10mg溶于0.1M/0.1M NaAc/HAc缓冲溶液中，同时将适量的含有Luciferase报告基因的PGL3质粒溶于0.1M/0.1M NaAc/HAc缓冲溶液中，滤菌，两者混合配制成PNIPArg/DNA复合物，复合质量比为5/1，静置30分钟后，将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-1细胞不含血清的培基中，转染2小时后，采取不同的控温路线进行转染后的培养(1)37℃48小时，(2)37℃(22小时)→20℃(2小时)→37℃(24小时)。48小时后裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为对于控温路线(1)来说为1.48×106RLU/mg protein；控温路线(2)为2.49×106RLU/mg protein。
实施例四取2克异丙基丙烯酰胺溶解于25毫升四氢呋喃中，磁力搅拌20分钟使之完全溶解，将其加入到100ml的三口烧瓶中，加入引发剂4，4′-偶氮双(4-氰基戊酸)0.08克，通氮气30min排除反应体系的空气，水浴加热到55℃，在氮气保护下反应8h，以乙醚沉淀洗涤产物三次，蒸馏水溶解产物，透析5天(截留分子量为3500)，冻干。
取100mg上步反应所得样品溶解于盐酸/N，N，N′，N′四甲基乙二胺缓冲溶液(pH＝5.0)中，称取15mg聚精氨酸加入到上述溶液中，并加入15mg碳二亚胺，10℃下磁力搅拌反应72小时。将产物在32℃离心除去PNIPAAm，收集上清，再37℃离心，收集沉淀，冷冻干燥得最终产物。
将得到的最终产物10mg溶于0.1M/0.1M NaAc/HAc缓冲溶液中，同时将适量的含有Luciferase报告基因的PGL3质粒溶于0.1M/0.1M NaAc/HAc缓冲溶液中，滤菌，两者混合配制成PNIPArg/DNA复合物，复合质量比为6/1，静置30分钟后，将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-1细胞不含血清的培基中，转染2小时后，采取不同的控温路线进行转染后的培养(1)37℃48小时，(2)37℃(22小时)→20℃(2小时)→37℃(24小时)。48小时后裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为对于控温路线(1)来说为2.44×103RLU/mg protein；控温路线(2)为6.34×103RLU/mg protein。


本发明公开了一种温度敏感性聚异丙基丙烯酰胺－聚精氨酸缀合物的制备方法，属于温度敏感性转基因载体的制备技术。该方法过程包括将异丙基丙烯酰胺溶解于四氢呋喃中，加入引发剂4，4－偶氮双(4－氰基戊酸)，水浴加热，在氮气保护下反应，洗涤产物，去离子水溶解产物，透析冻干得到羧基封端的聚异丙基丙烯酰胺；羧基封端的聚异丙基丙烯酰胺溶解于盐酸/N，N，N′，N′四甲基乙二胺缓冲溶液中，加入聚精氨酸，再加入碳二亚胺，搅拌反应，不同温度离心分离，冷冻干燥得到聚异丙基丙烯酰胺－聚精氨酸缀合物产物。本发明的优点在于制备方法简单，合成条件温和，所制得的产物用于转基因载体，可实现对于DNA运输和表达的调控。