专利名称：人参皂苷在制备治疗慢性感染疾病的药物中的应用的制作方法人参为五加科植物人参(Panax ginseng C. A. Meyer)的干燥根。从古自今作为名 贵药材，在治疗免疫功能低下、心脏病、感染性疾病等有广泛的应用。多年来，国内外学者 对人参化学成分及活性方面进行了大量的研究工作，从中分离出的主要成分有皂苷类、多 糖类、多肽类、挥发油等，其中的人参皂苷和人参多糖类成分在生物活性方面研究的最为广 泛。现在已从人参根、茎叶中分离出五十多种皂苷。并且发现人参皂苷具有提高免疫 功能、抗衰老、增加心脏功能、降血糖等多种药理作用。人参从古至今，在临床多用于慢性 疾病，包括由细菌感染引起的慢性疾病的治疗，多认为是由其提高机体的免疫功能，增加蛋 白、核酸合成能力，达到治疗的作用。感染性疾病是严重威胁人类生命的疾病，特别是近年来细菌耐药性的迅速发展， 使得感染性疾病越发难以治愈和形成慢性感染性疾病。细菌在生长过程中不断分泌胞外多 糖复合物(主要成分为藻酸盐)，细菌借助大量多糖，蛋白和DNA等多聚物，可粘附于物体表 面，将自身包裹于其中，形成膜状结构，即细菌生物被膜(baetedalbiofilm，BBF)[。在人体 中，生物被膜可粘附于各种植入物或器官组织表面，引起生物被膜相关感染。细菌一旦形成 生物被膜，则可表现为极强的抵抗宿主免疫系统的能力，不仅难以被清除，而且可刺激宿主 产生高效价抗体形成免疫复合物造成局部组织的损伤。大多数细菌在生长中为了适应周围 环境而形成生物膜，慢性细菌性感染多数是由于生物膜的形成造成的。正是由于细菌生物 膜的存在，使抗生素的作用大大减弱，细菌生物膜引起的感染是威胁人类健康的严重问题。我们通过细菌生物膜模型，对多种类化学成分对细菌生物膜抑制或破坏作用进行 了筛选，发现人参皂苷，包括根、茎叶总皂苷，特别是B族皂苷，对细菌生长和生物膜的形成 有明显的抑制作用。表明人参在治疗慢性感染性疾病时，不仅通过提高机体的免疫功能， 更重要的是通过对细菌和细菌生物膜的抑制或破坏，对慢性细菌感染性疾病起到治疗的作 用。人参为五加科植物人参(Panax ginseng C. A. Meyer)的干燥根。从古自今作为名 贵药材，在治疗免疫功能低下、心脏病、感染性疾病等有广泛的应用。多年来，国内外学者 对人参化学成分及活性方面进行了大量的研究工作，从中分离出的主要成分有皂苷类、多 糖类、多肽类、挥发油等，其中的人参皂苷和人参多糖类成分在生物活性方面研究的最为广 泛。现在已从人参根、茎叶中分离出五十多种皂苷。并且发现人参皂苷具有提高免疫 功能、抗衰老、增加心脏功能、降血糖等多种药理作用。人参从古至今，在临床多用于慢性疾 病，包括由细菌感染引起的慢性疾病的治疗，多认为是由其提高机体的免疫功能，增加蛋3白、核酸合成能力，达到治疗的作用。感染性疾病是严重威胁人类生命的疾病，特别是近年来细菌耐药性的迅速发展， 使得感染性疾病越发难以治愈和形成慢性感染性疾病。细菌在生长过程中不断分泌胞外多 糖复合物(主要成分为藻酸盐)，细菌借助大量多糖，蛋白和DNA等多聚物，可粘附于物体表 面，将自身包裹于其中，形成膜状结构，即细菌生物被膜(baetedalbiofilnuBBFK。在人体 中，生物被膜可粘附于各种植入物或器官组织表面，引起生物被膜相关感染。细菌一旦形成 生物被膜，则可表现为极强的抵抗宿主免疫系统的能力，不仅难以被清除，而且可刺激宿主 产生高效价抗体形成免疫复合物造成局部组织的损伤。大多数细菌在生长中为了适应周围 环境而形成生物膜，慢性细菌性感染多数是由于生物膜的形成造成的。正是由于细菌生物 膜的存在，使抗生素的作用大大减弱，细菌生物膜引起的感染是威胁人类健康的严重问题。我们通过细菌生物膜模型，对多种类化学成分对细菌生物膜抑制或破坏作用进行 了筛选，发现人参皂苷，包括根、茎叶总皂苷，特别是B族皂苷，对细菌生长和生物膜的形成 有明显的抑制作用。表明人参在治疗慢性感染性疾病时，不仅通过提高机体的免疫功能， 更重要的是通过对细菌和细菌生物膜的抑制或破坏，对慢性细菌感染性疾病起到治疗的作 用。人参皂苷中对于治疗慢性感染性疾病有效的成分主要为人参皂苷Rbp Rb2, Rb3、Re、Rd 和Re。
本发明通过试验研究证明了人参皂苷具有治疗慢性感染的新用途，通过试验表明 其中的主要有效成分为人参皂苷RbpRlvRbpRGRd和Re。在本发明申请前未发现有关于 人参皂苷在治疗慢性感染疾病的应用的报道。本发明的创新点之一是提供一种人参皂苷，该人参皂苷既可以从人参根中获得， 也可以从人参茎叶中获得；经进一步药理试验研究证明了人参皂苷具有治疗慢性感染的作 用。具有在制备治疗慢性感染的的药物中的新用途。本发明的创新点之二是提供了一种植物资源丰富，可产业化生产的人参皂苷，该 人参皂苷的特征在于按重量百分比计人参皂苷Rb1含量为1_3%，人参皂苷Rb2含量为 1-5 %，人参皂苷Rb3含量为0. 01-0. 1 %，人参皂苷Rc含量为1-5 %，人参皂苷Rd含量为 5-15%，人参皂苷Re含量为15-25%。经试验证明具有明显的治疗慢性感染的作用，性能稳 定，可以制成各种不同的剂型。本发明是通过如下技术方案来实现的。1材料与设备1. 1 菌株大肠杆菌(1. 1369)中国科学院微生物研究所；金黄色葡萄球菌(1. 0089)中国科学院微生物研究所；1.2培养基营养肉汤培养基(NB)北京美坛公司；琼脂粉北京鼎国生物技术有限责任公司；1.3仪器设备二氧化碳培养箱日本三洋电器有限公司；4台式恒温振荡器(THZ-L)太仓市试验设备厂；双人净化工作台(SW-CJ-ZD)苏州净化设备有限公司；立式压力蒸汽灭菌器筒(01J2003-04)上海东亚压力容器制造有限公司；细菌浊度仪(WGZ-3-XJ)上海晰瑞仪器仪表有限公司；酶标仪(MK3)热电(上海)仪器有限公司；96孔细菌培养板海门市天龙实验器材制造厂；2实验方法样品配制人参皂苷及人参皂苷各单体来源及溶液的配制人参皂苷从人参根中提取。购自于宏久药业有限公司，其中人参皂苷中Rb1含量 为1. 45 %，人参皂苷Rb2含量为2. 80 %，人参皂苷Rb3含量为0.012%，人参皂苷Rc含量为 2. 80%,人参皂苷Rd含量为7. 80%，人参皂苷Re含量为19. 20%。取人参皂苷10mg，用灭 菌蒸馏水定容至1ml，制成浓度为10mg/ml的样品。人参单体皂苷RbpRtvRbyRc^Rd和Re，购自于吉林大学，分别称取人参皂苷Rbl、 Rb2、Rb3、Re、Rd 和 Re 各样品 10mg，用灭菌蒸馏水定容至1ml，制成浓度为10mg/ml的样品。对照品的配制称取注射用头孢呋辛钠10mg，用灭菌蒸馏水定容为1ml，制成浓度为10mg/ml的阳 性对照药品。2. 1菌悬液的制备及样品对菌悬液的作用2. 1. 1菌悬液的制备分别将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌活化后，挑取3-4个菌斑接种于5ml营养肉 汤(NB)液体培养基中，37°C摇床震荡培养18h至对数中期，用细菌浊度计调菌悬液浓度为 5CFU，用NB液体培养基稀释100倍，待用。2. 1. 2样品对菌悬液的作用96孔板1-4列为空白组，5-8列为样品组，9-12列为阳性对照组。将已稀释好的菌 悬液，用八通道微量进样器按如下方法加入96孔板内1-4列每孔100 μ 1菌悬液，5-8列每孔90 μ 1菌悬液+10 μ 1样品，A-H行样品浓 度依次倍比稀释浓度依次为 1000 μ g/ml, 500 μ g/ml, 250 μ g/ml, 125 μ g/ml, 62. 5 μ g/ml, 31. 25 μ g/ml, 15. 625 μ g/ml, 7. 82 μ g/ml。9-12 列每孔 90 μ 1 菌悬液 +10 μ 1 头孢对照品， A-H行头孢浓度依次倍比稀释浓度分别为100 μ g/ml, 50 μ g/ml, 25 μ g/ml, 12. 5 μ g/ml, 6. 25 μ g/ml, 3. 125 μ g/ml, 1. 5625 μ g/ml，782 μ g/ml。将 96 孔板置于恒温培养箱培养 24 小时，取出，倒出液体，蒸馏水反复清洗。加入结晶紫ΙΟΟμΙ，染色30min，蒸馏水冲洗。加 入脱氧胆酸钠ΙΟΟμ 1，脱色30min，600nm酶标仪测OD值。该吸收值代表样品对细菌菌悬液 的作用强弱。2. 2细菌生物膜的制备和样品对细菌生物膜的作用2. 2. 1生物膜的制备分别将5McF的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌悬液用NB液体培养基稀释100倍 后，用八通道微量进样器加入96孔板内，每孔100 μ 1，放入37°C恒温培养箱中静置培养24h，弃去菌悬液，余下作为被膜菌待用。2. 2. 2样品对细菌生物膜的作用将建立好的细菌生物膜模型的96孔板的1-4列为空白组，5-8列为样品组，9_12 列为阳性组。选取头孢呋辛钠作为阳性药物。空白组加入肉汤培养基；样品组和阳性组加 水溶解，浓度为10mg/ml，分别加入到96孔板的5_8列和9_12列的A行依次倍比稀释直至 H行。将96孔板置于恒温培养箱培养24小时，取出，倒出液体，蒸馏水反复清洗。加入结晶 紫ΙΟΟμ 1，染色30min，蒸馏水冲洗。加入脱氧胆酸钠100 μ 1，脱色30min，600nm酶标仪测 OD值。该吸收值代表细菌生物膜的生长情况。细菌菌悬液(细菌生物膜)抑制率=(A空白-A样品)/A空白X 100% A空白 为不加样品的吸收值A样品加入样品的吸收值3实验结果3. 1人参皂苷等对大肠杆菌的抑制作用
本发明公开了人参皂苷在制备治疗慢性感染疾病的药物中的新用途。本发明的人参皂苷中用于治疗慢性感染疾病的有效成分主要为人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd和Re，并且阐述了人参皂苷的药物制剂。