专利名称：一种治疗慢性泄泻的中药制剂固肠胶囊的含量检测方法随着经济的不断发展，中药受到世人更多的了解与瞩目。中药是在传统的中医理论指导下发展起来的，原料多是草根、树皮、矿物、动物等天然材料，来源广泛，成分复杂。中药和西医相比，中药含量控制确实难度更大，因为中药里面的成分十分复杂，生长地点不同、气候变化不同，都有可能导致中药成分的变化，而西药研究的主要是单一成分，相对更为容易。这就决定了中药安全性标准的特殊性，安全性标准问题也同样成为中药进入国际市场的一个难题。目前国际上虽然尚无植物类中药的国际标准，但是美国、欧盟及我国传统出口中药的东南亚地区均有提高中药标准的趋势。在此情况下，更要提出适合我国产品含量的标准以适应国际标准，而且中药在中国有数千年的使用历史，世界各国在制订相应的植物药产品含量标准中也多参考我国的中药标准。因此，完善、提高中药的含量标准更加成为了我国迫在眉睫的事情了。本发明的固肠胶囊由赤石脂(煅)、黄连、黄柏、诃子(去核)、肉豆蔻(煨)、厚朴 (炙)、建曲、吴茱萸(制)、肉桂、干姜、花椒、川弯、牡蛎(煅)、五倍子和乌梅(去核)十五味中药组成，制备方法是以上十五味生药粉碎成细粉，混勻，加适量水，制颗粒，干燥，整粒，分装入胶囊，制成1000粒，即得。固肠胶囊是天津达仁堂制药厂研制的治疗泄泻的三类中药新药，该方源于中国中医研究院北京西苑医院施奠邦主任医师的临床经验方，具有涩肠止泻、散寒清热、调和气血之功效，用于寒热错杂、虚实互见之久泻病症，药物疗效不受年龄、病程、病情的影响，临床应用对心肝肾无损害，药品上市至今国内外没有发生不良事件。高效液相色谱(HPLC)具有快速、灵敏、分离效能高等优点，在中药鉴定中，采用 HPLC法分离特征成分后，用紫外检测器(UV)或质谱检测器(MQ进行结构分析和定量分析， 是全面评价含量的有效方法。2010年版一部中有850个品种，956个项目采用HPLC法进行含量测定，较2005年版《中国药典》新增7M项。而且还不断有人用HPLC法对其它的中药进行鉴定和成分分析研究。由多味中药组成的复方中成药所含成分就更为复杂，在复方配伍和制备中有些化学成分还会互相影响，含量发生较大变化，给指标成分的检测增加了难度。《新药转正标准》 第69册规定的固肠胶囊原有质量标准检测步骤是⑴显微鉴别；⑵薄层色谱法鉴别川芎； ⑶薄层色谱法鉴别吴茱萸；⑷薄层色谱法鉴别肉桂；ω薄层色谱法鉴别花椒；(6)高效液相法测定厚朴。本发明在原含量标准基础上增加了诃子和五倍子中没食子酸的含量测定方法，专属性强，完善了定量检测指标，实现了中药的多成分多指标检测，提高了固肠胶囊含量标准的可控性，进一步确保了产品内在含量和疗效，保证患者用药安全。
为了提高固肠胶囊含量标准的可控性，进一步确保产品内在含量和疗效，保证患者用药安全，增加了诃子和五倍子中没食子酸的含量测定方法。本发明的测定方法能够定性、定量检测且检测手段简单、检测结果准确。为实现上述目的，本发明通过以下技术方案予以实现一种治疗慢性泄泻的中药制剂固肠胶囊的含量检测方法，包括鉴别和含量测定，其中含量测定方法有高效液相法测定厚朴和高效液相法测定诃子和五倍子，其特征在于固肠胶囊处方中含有五倍子及诃子，主要成分为鞣质，采用盐酸水解后测定没食子酸的方法测定样品中鞣质的含量，其包括如下的步骤①对照品溶液的制备取没食子酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每Iml含没食子酸40 μ g的溶液，即得；②供试品溶液的制备取装量差异项下的固肠胶囊内容物，混勻，研细，取0.25g，精密称定，精密加入4mol/L盐酸50ml，称定重量，置沸水浴上加热回流4小时，放冷，再称定重量，用4mol/L盐酸补足减失的重量，3000转/分钟离心5分钟，精密量取上清液5ml，置 25ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇勻，滤过，取续滤液，即得；③阴性样品溶液的制备称取煅赤石脂500份，黄连250份，黄柏250份，去核诃子 250份，煨肉豆蔻250份，炙厚朴250份，建曲250份，制吴茱萸200份，肉桂200份，干姜 250份，花椒200份，川弯200份，煅牡蛎200份，五倍子250份，去核乌梅250份，取除五倍子及诃子的各味药材，按制法制得样品，再按供试品溶液制备方法，制得阴性样品溶液；④液相色谱条件的设定色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇0.磷酸体积比8 92为流动相；检测波长为271nm，理论板数按没食子酸峰计算应不低于5000 ；
⑤测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μ 1，注入液相色谱仪，测定， 即得；本品每粒含诃子与五倍子以没食子酸C7H6O5计，不得少于13. 5mg。本发明提供的一种治疗慢性泄泻的中药制剂固肠胶囊的含量检测方法与原有的新药转正标准相比，其所具有的优点和积极效果在于
(1)本发明根据处方中诃子与五倍子(主要有效成分为鞣质)具有涩肠止泻、散寒清热、 调和气血之功效。通过测定固肠胶囊有效成分鞣质的含量测定，更加准确地把握有关药品的质量。采用本发明的质量控制方法，提高了固肠胶囊的质量控制标准，从而有效确保了固肠胶囊的安全、均一、稳定、有效、可控，保证了工艺的规范化和质量的稳定一致。(2)为有效控制产品质量，我们在原有固肠胶囊新药转正标准的基础之上建立了新的质量控制方法，该方法增加了诃子和五倍子中没食子酸的含量测定方法。新的检测方法能够定性、定量检测且检测手段简单、检测结果准确。精确度高可达到质量控制的目的。(3)本发明的固肠胶囊五倍子占总制剂处方量的6. 67%，按《中国药典》2010年版规定为没食子酸不少于50%，诃子也占总制剂处方量的6. 67%，按进口药材含量标准规定为没食子酸不少于10%，由于固肠胶囊为原粉入药，转移率按90%计算，其含量限度定为本品每粒含诃子与五倍子以没食子酸C7H6O5计，不得少于13. 5mg。(4)本发明在《新药转正标准》第69册原标准的基础上，增加了高效液相色谱法对诃子和五倍子中没食子酸进行含量测定的方法。修订后的含量标准，提高了药品含量标准的可控性，确保了产品的内在含量，对促进产品销售、增加产品的市场竞争力、保证患者用药安全意义重大。


图1为本发明没食子酸对照品液相色谱图，其中波长=271nm ； 图2为本发明供试品液相色谱图，其中波长=271nm ；
图3为本发明诃子和五倍子阴性样品液相色谱图，其中波长=271nm。

组方赤石脂(煅)500份黄连250份黄柏250份诃子(去核》50份肉豆蔻(煨》50 份厚朴(炙)250份建曲250份吴茱萸(制)200份肉桂200份干姜250份花椒 200份川芎200份牡蛎(煅)200份五倍子250份乌梅(去核)250份(来源于授权的固肠胶囊，专利号ZL200510014980. 1)
制备方法将以上十五味生药按处方量之比配伍，经挑选去杂物，水洗去泥沙后，烘干，粉碎成细粉，混勻，加适量水，制颗粒，干燥，整粒，分装入胶囊，即得。(来源于授权的固肠胶囊，专利号:ZL200510014980. 1) 实施例2 常规方法
固肠胶囊的含量检测方法，其方法步骤是 ⑴显微鉴别
取固肠胶囊内容物少量，置显微镜下观察韧皮纤维鲜黄色，成束或散在，有的与石细胞相连接，呈纺锤或梭形，末端斜尖、钝圆或狭细，长136 185 μ m,直径27 37 μ m,壁厚、 木化、孔沟明显，纤维束周围薄壁细胞中含草酸钙方晶，形成晶纤维，方晶至为密集，含晶细胞的壁不均勻木化增厚。⑵薄层色谱法鉴别川芎
取固肠胶囊内容物2g，加乙酸乙酯10ml，超声提取20分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取川芎对照药材0.2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液4 μ 1、对照药材溶液2 μ 1，分别点于同一高效硅胶G 薄层板上，以苯-乙酸乙酯(9:0. 5)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点。⑶薄层色谱法鉴别吴茱萸
取固肠胶囊内容物2g，加三氯甲烷10ml，超声提取20分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取吴茱萸对照药材0. 2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液4 μ 1、对照药材溶液2 μ 1，分别点于同一高效硅胶G 薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(7 1 2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm) 下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点。
⑷薄层色谱法鉴别肉桂
取固肠胶囊内容物2g，加无水乙醇IOml，超声提取20分钟，滤过，滤液浓缩至2ml，作为供试品溶液。另取桂皮醛对照品，加无水乙醇制成每Iml含1 μ 1的溶液，作为对照品溶液。 照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液4 μ 1、对照品溶液 1 μ 1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以石油醚(60 90°C )-乙酸乙酯(85 15)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯胼乙醇试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。ω薄层色谱法鉴别花椒
取固肠胶囊内容物2g，加乙酸乙酯10ml，超声提取20分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取花椒对照药材0.2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液4μ 1、对照药材溶液2μ 1，分别点于同一高效硅胶G 薄层板上，以石油醚(30 60°C)-乙酸乙酯(17:3)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点ο (6)高效液相法测定厚朴
厚朴照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定。色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水 (75:25)为流动相；检测波长^4nm。理论板数按厚朴酚峰计算应不低于3000。对照品溶液的制备精密称取厚朴酚12mg与和厚朴酚5mg，置IOOml棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，精密吸取5ml置IOml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇勻，即得(每Iml中含厚朴酚0. 06mg，和厚朴酚0. 025mg)。供试品溶液的制备取装量差异项下的内容物，混勻，精密称取2. 0g，置IOOml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，塞紧，称定重量，超声提取1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇勻，用0. 45 μ m微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。本品每粒含厚朴酚(C18H18O2)与和厚朴酚(C18H18O2)的总量应不少于0. 49mg。实施例3
高效液相法测定诃子和五倍子
固肠胶囊处方中含有五倍子及诃子，其主要成分为鞣质，因此采用盐酸水解后测定没食子酸的方法测定样品中鞣质的含量。①对照品溶液的制备取没食子酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每Iml 含没食子酸40 μ g的溶液，即得。液相色谱检测结果见图1。②供试品溶液的制备取装量差异项下的固肠胶囊内容物，混勻，研细，取 0. 25g，精密称定，精密加入4mol/L盐酸50ml，称定重量，置沸水浴上加热回流4小时，放冷， 再称定重量，用4mol/L盐酸补足减失的重量，离心5分钟(3000转/分钟)，精密量取上清液5ml，置25ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇勻，滤过，取续滤液，即得。液相色谱检测结果见图2。③阴性样品溶液的制备按处方取除五倍子及诃子的各味药材，按制法制得样品， 再按供试品溶液制备方法，制得阴性样品溶液。液相色谱检测结果见图3。
④液相色谱条件的设定色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇 0. 磷酸体积比8 92为流动相；检测波长为271nm。理论板数按没食子酸峰计算应不低于 5000。⑤测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得；
⑥结果分析处方中五倍子占总制剂处方量的6. 67%，按《中国药典》2010年版规定为没食子酸不少于50%，诃子也占总制剂处方量的6. 67%，按进口药材含量标准规定为没食子酸不少于10%，由于固肠胶囊为原粉入药，转移率按90%计算，其含量限度定为本品每粒含诃子与五倍子以没食子酸(C7H605)计，不得少于13. 5mg。实施例4
固肠胶囊中诃子与五倍子含量测定的实际应用
含量测定
照高效液相色谱法(中国药典2010年版第一部附录VI D)测定。1仪器与试药
仪器:Agilent-1200高效液相色谱仪。试剂甲醇(色谱纯，天津市康科德科技有限公司)，磷酸(分析纯)，盐酸(分析纯)， 水为去离子水。对照品没食子酸(中国药品生物制品检定所购置，批号110831 — 200302，供含
量测定用)。样品天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂(批号5070003，570005， 570006)。2色谱条件
色谱柱Agilent ZORBAX TC-C18 (250mmX4. 6mm 5 μ m)；流动相甲醇-0. 1 %磷酸 (8 92)；柱温30°C ；流速1. Oml/min ；检测波长271nm。理论板数按没食子酸峰计算应不低于5000。2. 1提取方法的确定与考察 2. 1. 1提取方式的确定
固肠胶囊处方中含有五倍子及诃子，其主要成分为鞣质，因此采用盐酸水解后测定没食子酸的方法测定样品中鞣质的含量。取同一批号(5070003)样品，取0.25g，精密称定，精密加入4mol/L盐酸50ml，称定重量，置水浴上加热回流3. 5小时，放冷，称定重量，加4mol/ L盐酸补足减失的重量，离心5分钟(3000转/分钟)，精密量取上清液5ml，置25ml量瓶中， 加50%甲醇定容至刻度，摇勻，即得。结果样品中没食子酸色谱峰与杂质峰分离度大于1. 5，因此采用加热回流提取。2. 1.2盐酸浓度的选择取同一批号(5070003)样品，取0.25g，精密称定，共8份， 分别精密加入浓度为2、3、4、5mol/L的盐酸50ml，称定重量，置水浴上加热回流3. 5小时，放冷，称定重量，分别用各自的溶剂补足减失的重量，离心5分钟(3000转/分钟)，精密量取上清液5ml，置25ml量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇勻，即得。结果采用浓度为4mol/L的盐酸提取，样品中没食子酸含量高于其他浓度的盐酸， 因此采用浓度为4mol/L的盐酸作为提取溶剂。结果见表(1)。
表(1)盐酸浓度的比较


本发明涉及一种治疗慢性泄泻的中药制剂固肠胶囊的含量检测方法，包括鉴别和含量测定，其中含量测定方法有高效液相法测定厚朴和高效液相法测定诃子和五倍子，其特征在于固肠胶囊处方中含有五倍子及诃子，主要成分为鞣质，采用盐酸水解后测定没食子酸的方法测定样品中鞣质的含量。由于固肠胶囊为原粉入药，转移率按90%计算，其含量限度定为本品每粒含诃子与五倍子以没食子酸C7H6O5计，不得少于13.5mg。本发明在《新药转正标准》的基础上，增加了高效液相色谱法对诃子和五倍子中没食子酸进行含量测定的方法。修订后的含量标准，提高了药品含量标准的可控性，确保了产品的内在含量，对促进产品销售、增加产品的市场竞争力、保证患者用药安全意义重大。