专利名称：重组人源脑红蛋白的生物活性检测方法及其用途的制作方法脑红蛋白(neuroglobin，Ngb)是2000年新发现的主要表达于神经系统的第三类携氧珠蛋白，功能和性质方面与肌红蛋白类似，与氧有很高的亲和力(P5tl 2torr)。对于 Ngb蛋白检测，现多集中在蛋白的免疫活性(蛋白印迹检测)和蛋白含量的检测方面，针对 Ngb蛋白的生物活性，尤其是清除自由基活性，目前尚无合适的检测方法报道。申请人:在发明专利ZL200510059313. 5中公开了重组全长人源脑红蛋白(rhNgb) 的制备方法，获得了原核表达的rhNgb蛋白，为rhNgb蛋白在产业上大量生产奠定了基础。然而，产业生产需要有相应的质量标准和质检体系支持，由此，申请人在蛋白水平上对 rhNgb的生物活性进行系列深入研究，并有望将研究成果转化为rhNgb蛋白生产的质量标准和质检方法。目前，国内外有很多关于Ngb抗自由基损伤的研究报道，已经通过真核表达载体技术和转基因等手段(而不是使用Ngb蛋白)，间接证明Ngb具有保护细胞抵抗自由基损伤的功會邑。如 Fordel 等(Neurosci Lett,Neuroglobin and cytoglobin overexpression protects human SH—SY5Y neuroblastoma cells against oxidative stress-induced cell death, 2006,410 (2) : 146-51)研究指出，过表达的Ngb能够保护SH-SY5Y细胞抵抗氧化应激诱导的细胞死亡；而Wang等(Stroke，Effects of neuroglobin overexpression on acute brain injury and long-term outcomes after focal cerebral ischemia，2008， 39(6) :1869-74)用过表达Ngb的转基因小鼠进行实验，发现Ngb过表达能够减少机体内氧化应激的产生；Nayak 等(J Neurochem, Role of neuroglobin in regulating reactive oxygen species in the brain of the anoxia-tolerant turtle Trachemys scripta, 2009,110(2) :603-12)研究发现，在体外培养的神经细胞中Ngb能够降低自由基的产生；Li 等(Brain Res, Neuroglobin protects PC 12 cells against oxidative stress,2008, 1190 :159-66)发现，过表达的Ngb能够保护PC12细胞抵抗氧化应激损伤。但是，以上研究只能说明Ngb对自由基引起的细胞损伤具有保护作用，并不能说明Ngb本身对自由基具有清除作用，也无法证明其抗氧化能力，因此文献中所报道的内容并不适合rhNgb生物活性的检测；同时，目前仅有的直接从Ngb蛋白进行的清除自由基研究(Neuro-and cytoglobin are found to show no appreciable superoxide dismutase, catalase, and peroxidase activities. (Gene, Neuroglobin and cytoglobin as potential enzyme or substrate, 2007,398(1-2) :103-1 )，却并未发现Ngb具有超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT) 和过氧化物酶(POD)活性，尚未证明其具有能够清除自由基的能力，导致对于Ngb生物活性的判定出现相互矛盾之处。这可能是由于检测技术灵敏度不足所导致的。因此目前还没有从蛋白水平直接检测Ngb蛋白清除自由基活性的报道。自由基是机体正常代谢的中间产物(包括但不限于超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等)。自由基在机体内具有很强的氧化反应能力，同时过量的自由基却又易于在机体内与各种生物大分子发生反应而导致细胞和组织氧化损伤。机体内过多的自由基是许多疾病产生的重要原因，因此清除过量自由基已成为防治多种疾病的重要方式。生理状态下人体内自由基处于产生与清除的动态平衡中，而此平衡主要依靠机体内的抗氧化系统进行维持。机体内过多的自由基是产生氧化应激的重要因素，也是致病的重要原因，如神经系统退行性疾病、脑中风、肿瘤等，因此清除体内过多的自由基或防止过多自由基的产生已成为预防神经系统疾病的重要途径。
本发明的目的在于提供了一种灵敏度较高的从蛋白水平直接检测重组人源脑红蛋白生物活性的方法。本发明所提供的重组人源脑红蛋白的生物活性检测方法，是通过重组人源脑红蛋白清除自由基能力体现，以rhNgb清除超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基的活性作为检测指标。具体来讲，一种所述重组人源脑红蛋白的系列生物活性检测方法，针对rhNgb清除超氧阴离子活性进行检测，用NBT光还原法，可包括以下步骤(1)测定样品吸收度向样品组中加入样品、反应混合液、PBS和VB2,向空白对照组中加入双蒸水，然后立即将待测样品放于光照箱，室温下光照15min，立即遮光终止反应，测定560nm处吸光度； 所述反应混合液为L-Met NBT EDTA-Na2按体积比2 2 1比例混合的混合液；(2)计算清除超氧阴离子的活性按下式计算清除超氧阴离子活性SAA(%) = [1-A/AJX100，其中A为空白对照组吸光度，A0为样品组吸光度。在上述NBT光还原法测定rhNgb清除超氧阴离子活性的方法中，所述各试剂浓度为L-Met 39mM、NBT 0. 225mM 和 EDTA-Na2 3mM、VB2 0. 12mM、PBS (pH 7.2)。具体来讲，另一种所述重组人源脑红蛋白的系列生物活性检测方法，针对rhNgb 清除过氧化氢活性进行检测，用过氧化氢灭活酶法进行检测，可包括以下步骤1)检测(1)标准曲线测定①取过氧化氢溶液至离心管中，加入过氧化氢酶检测缓冲液，混勻；然后加入显色工作液，25°C孵育后测定A520 ；②计算出标准曲线；(2)样品测定①将样品中加入到新的离心管中，然后加入过氧化氢酶检测缓冲液，混勻，再加入过氧化氢溶液，迅速混勻，25°C反应；②向上述反应体系中加入过氧化氢酶反应终止液，混勻以终止反应，并在终止反应后15分钟内完成下一步；③向新的塑料离心管内加入过氧化氢酶检测缓冲液，然后加入已终止并混勻的上述反应体系，混勻；再加入200 μ 1显色工作液；25°C孵育后测定A520 ；2)清除过氧化氢活性的计算根据标准曲线计算出的k和b值计算实验中消耗的过氧化氢微摩尔数；在上述过氧化氢酶检测rhNgb清除过氧化氢活性的方法中，所述过氧化氢酶检测缓冲液、过氧化氢酶反应终止液、显色工作液均为过氧化氢酶检测试剂盒自带试剂(江苏碧云天生物技术研究所)。具体来讲，再一种所述重组人源脑红蛋白的系列生物活性检测方法，针对羟自由基的活性进行检测，用邻二氮菲-Fe (II)比色法；所述邻二氮菲-Fe (II)比色法可包括以下步骤1)待测样品溶液准备将待测rhNgb样品配成0. 1，0. 5，lmg/ml的样品溶液；2)四个离心管分别标号f、0、χ、s，分别依次加入邻二氮菲溶液，PBS, FeSO4溶液， f、0、s中加入双蒸水，χ中加入等量的样品溶液；再等量分别在f、x中加入H2O2，在0中加入双蒸水，在s中加入样品溶液；水浴后于536nm处测其吸光度，其值分别为Af、A0, Ax和As ；3)计算清除羟自由基活性按算式计算羟自由基清除率HRSA HRSA (% ) = [1-(As-Ax) / (A0-Af) ] X 100。以上三种检测方法中，将10 μ g/ml的rhNgb清除超氧阴离子的比率>50%作为产品具有此清除活性的指标；10 μ g的rhNgb清除过氧化氢的摩尔数> 5 μ mol为产品具有清除过氧化氢活性的指标；100 μ g/ml的rhNgb清除羟自由基的比率> 10%作为产品具有该清除活性的指标。对于被检测的rhNgb产品，可以选用其中的任意一项作为检测指标，只要有一项检测指标达标的产品即可认为其具有清除自由基活性，作为合格产品，并可进一步用于制备具有清除自由基功能的药物的活性成分。上述重组人源脑红蛋白的生物活性检测方法在对rhNgb生物活性的跟踪，rhNgb 生产制备、储存、运输过程中rhNgb的活性确认，含有rhNgb的生物制品的活性检测，以及在建立rhNgb质量标准和质检体系中的应用也属于本发明的保护范围。经本发明的发明人证实，脑红蛋白Ngb具有清除自由基功能，因而可以其为活性成份制备具有清除自由基功能的药物。所述Ngb优选为重组人源脑红蛋白(rhNgb)。所述具有清除自由基功能的药物包括治疗氧化应激诱导的多种神经系统疾病的候选药物，治疗氧化应激诱导的神经系统疾病中的药物，治疗氧化应激诱导的多种神经系统疾病和脑缺血/缺氧等引起机体自由基增加的相关疾病的药物，还包括它们的医药产PΡΠ O本发明用NBT光还原法、过氧化氢灭活酶法和邻二氮菲-Fe(II)比色法等检测技术证明rhNgb能够清除自由基(包括但不限于超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等)，因而可以其为活性成份制备具有清除自由基功能的药物，并以此建立了 rhNgb的生物活性的检测方法。本发明提供的活性检测方法包括但不限于以rhNgb清除超氧阴离子、清除过氧化氢等能力作为检测指标。本发明的检测方法稳定，具有测定结果可靠、检测数据重复性较高等优点，测定的结果能较好地反映rhNgb蛋白的生物活性，并且在对rhNgb本身以及含有 rhNgb的生物制品的活性跟踪方面具有广泛用途，还可用于rhNgb生产过程中的质量跟踪， 对建立rhNgb质量标准和质检体系提供了保证，适合推广和应用。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

图1为rhNgb清除超氧阴离子活性检测结果图2为rhNgb清除过氧化氢活性检测结果图3为rhNgb清除羟自由基活性检测结果

针对不同批次的rhNgb蛋白产品，用双蒸水将rhNgb产品配制成lmg/ml的浓度， 后续根据需求进行不同浓度的稀释；2)所需试剂及仪器试剂所用试剂参照实施例1-3所述进行配制；仪器具有检测使用波段的紫外分光光度计，如Cary 50UV-VIS ；3)检测操作过程参照实施例1-3的具体操作步骤进行测定。4)结果及评价标准


本发明公开了一种重组人源脑红蛋白的生物活性检测方法及其用途，该检测方法包括1)将待检重组人源脑红蛋白配制成设定浓度的样品溶液；2)检测样品溶液清除自由基的能力，以rhNgb对超氧阴离子清除率、rhNgb清除过氧化氢的量、和/或rhNgb对羟自由基的清除率作为检测指标；3)计算出检测数据并与重组人源脑红蛋白的生物活性标准数据比较，得出检测结果。本发明还提出脑红蛋白Ngb在制备具有清除自由基功能药物中的应用，为新药研发提供了思路。本发明的检测方法稳定，具有测定结果可靠、检测数据重复性较高等优点，测定的结果能较好地反映rhNgb蛋白的生物活性，并且在对rhNgb本身以及含有rhNgb的生物制品的活性跟踪方面具有广泛用途。