专利名称:聚脱氧核苷酸的制备工艺的制作方法 本发明涉及由化学性质限定的并可再制的聚脱氧核苷酸的制备。更具体地说，本发明涉及了名为Defibrotide(DCI，Liste 21，Chronique OMS 35，5 Suppl.4，1981)的已知物质的制备。名为Defibrotide的物质的定义为低分子量核苷酸馏分的钠盐，该物质由动物器官萃取得到，这在美国专利3,770,720和3,899,481中已经披露，公开的两篇专利在这里作为参考文献。Defibrotide已是某些药理学和临床研究的课题，一方面其有可估计的很低的毒性(对急性或亚急性以及慢性病人)，从用于治疗的观点出发其优点是不言而喻的，而另一方面，Defibrotide公开了惊人的并且完全料想不到的治疗性能。实际上正如已被列为本文参考文献的美国专利3,892,567所述，Defibrotide具有溶解纤维蛋白的活性，因此，它可用作抗血栓药。此外，药理学和临床实验研究(在自愿者身上进行)显示出下列活性；a)治疗外围动脉病(发明者O.N.Ulutin；美国专利申请号649055，申请日1984.9.10)；b)治疗急性肾机能不全(发明者V.Bonomini；美国专利4,649,134，批准日1987.3.10)；c)治疗心收缩急性局部缺血(发明者G.Prino，M.Mantovani，R.riada，美国专利申请号701,695，申请日1985，2，14)。所公布的上述专利和专利申请在本文中列为参考文献，以便说明其中公开的药物组合物及应用。上述治疗应用的项目及重要性明显地将人们的注意力集中到了Defibrotide及其工业生产上。这项研究工作尤其与下列两方面有直接关系，一方面与进行经济上有利、技术上合理的大规模生产有关，每一方面与所得工业产品Defibrotide的控制和标准化有关。另外，构成上述美国专利主题的工艺是最初的开发，这导致了名为Defibrotide的核苷酸结构的Obtention。当药理学和临床研究的结果展现出初始离析物质的极其重要的和各种的性质时，显然，一方面面临着大规模生产的问题，另一方面要仔细考虑Defibrotide物质的化学和物理性质的研究，因为它们与生产和需求紧密相关。Defibrotide完全符合上述药理学及治疗性能是本发明现已发现的首要特点，因此，它特别适合上述文献中的治疗应用。当核苷酸馏分形成时，其与下列无规则顺序的聚脱氧核苷酸化学式的化学计量相符，聚脱氧核苷酸的无规则化学式为P1-5，(dAp)12-24，(dGp)10-20，(dTp)13-26，(dCp)10-20式中p＝磷基dAp＝脱氧腺苷酸的单体dGp＝脱氧鸟苷酸的单体dTp＝脱氧胸苷酸的单体dCp＝脱氧胞苷酸的单体与该化学式相应的Defibrotide还显示了下列化学物理性质—电泳现象＝均匀阳极流动性；—消光系数，在260±1nm时，E1Cm1%=220±10;]]>—消光比，E230/E260＝0.45±0.04；—摩尔消光系数(以磷表示)ε(p)＝7.750±500；—旋光本领〔α〕D20°＝53°±6；—可逆增色性，用在天然DNA中的％表示，h＝15±5可逆增色性是聚脱氧核苷酸的一个独特的光学性质，是衡量这些生物聚合物在溶液中分子重排能力的一个计量方法。
作为热力学状态函数来说，物质的分子趋向于无序自由活动，并且物质溶液的温度越高其运动速度也就越高。在大多数简单的、可溶性物质(如盐、糖、肽)中，当温度降低时，尽管分子运动速度降低，与初始条件相对照也没有发生分子重排。就生物聚合物来说，如聚脱氧核苷酸，其分子则趋向于相互重排。这个性质在双螺旋DNA中很明显，与初始条件相对照，其分子重排能力约为100％。这种重排能力的测量可用一种特殊方法进行，对于聚脱氧核苷酸来说，则测量其在260nm溶液中光密度(O.D)的变化值，该溶液被加热然后冷却，或使其呈碱性然后中和使其PH值为5。
增色性的测量值由下列公式计算出，
鉴于上述观点，该式还可定义为
在这种方法中，增色性h表示能够重排的聚核苷酸分子的百分数。
上面已提到，就双螺旋DNA来说，这个值可用百分数表示，大约为100％，而对寡脱氧核苷酸(分子量低于8000道尔顿)来说这个值几乎为零。
就聚脱氧核苷酸Defibrotide的药理活性及适用的上述治疗应用来说，现已发现h的最佳值是大约百分之十五，如果h值小于10％，其药理活性将惊人地降低，相反如果h值高于20％则可能出现不希望的付作用。
这些增色性的特征限定表明聚脱氧核苷酸Defibrotide是一种单丝体并且这点还可以通过在漫射照明条件下测量分子量来证明，测量可以在标准情况下和变性情况下进行，但在这两种情况下测量的结果表明分子量没有明显的区别。
因此，聚脱氧核苷酸Defibrotide具有单丝生物聚合物结构，以天然DNA百分数表示分子内重排能力(相同分子内的核酸碱基配对)约为15％。
正如上文所述本发明的主要特征之一在于制备具有上述性质的Defibrotide工艺，同时这些性质保证了不同批次生产的产品特征基本上有完美的一致性。所得到的产品用于人类治疗完全实用可靠，显然，从工业生产的观点来看也是方便可行的。在美国专利3,770,720和3,899,481中已经公开的工艺过程包括萃取和用核酸的质子降解方法部分降解脱氧核糖核酸。在该工艺中Defibrotide的产率相对较低并且产物也常伴有降解付产物。事实上，聚脱氧核苷酸的质子降解特殊的方式或多或少地可以产生脱嘌呤是众所周知的，形成的无嘌呤酸是有毒的，即使是少量的也是有危险的。
本发明的主要目的是要彻底解决以前工艺中的上述问题以及缺点。
更具体地说本发明的目的是提供一种制备具有上述化学和化学物理性质的Defibrotide的工艺。
本发明的另一个目的是提供一种能够应用若干(除上述专利申请中所设想的牛肺之外)天然原料生产Defibrotide的工艺。
现已意外地发现通过在多种控制聚合的条件下的操作，能以最佳的方式解聚原核酸，从而使降解产物的形成量降至最小。
根据本发明的工艺其特征在于包括下列步骤a)研磨原料的动物器官并加热使其蛋白水解；b)过滤并浓缩溶解产物；c)在浓缩液中添加能够沉淀磷酸盐的阳离子盐，调节PH值使其酸性值不高于PH4.5；d)在沉淀悬浮液的恒容条件下过滤，以分离出存在于溶液中的多糖部分。
e)在得到的核酸不溶性盐的悬浮液中加入水溶性碱金属盐，以溶解核酸，经沉降从溶液中消除不能溶解的阳离子。
f)将核酸溶液中的离子力调节到至少1摩尔的预定值，发生以高度聚合的带切口的聚脱氧核苷酸形式的稳定聚合，然后调节溶液的PH值直到反应混合物的分光光度分析显示最大可逆增色性，即已达到了最大可能的聚合。
g)将溶液加热到聚合的聚脱氧核苷酸的解聚温度，解聚过程可以通过测量可逆增色性的变化值来控制，直到该值达到以天然DNA的百分数表示是15±5时为止。
h)通过冷却，中止解聚过程并断裂双丝碎片中的氢键；i)在高于解聚步骤的温度和PH值的条件下加热上一步得到的溶液，稳定得到的单丝碎片，以防止氢键重新形成。
j)热过滤，并仍在加热条件下除去存在于溶液中的盐，同时尽可能地浓缩。
现在考虑上述工艺的单个步骤，所用动物器官包括哺乳动物的器官、组织、细胞，特别是牛、羊、猪和马的肺、肠、肝和粘膜。
同样从生产肝素、蛋白溶胞产物和器官萃取物中所获得的剩余母液也是有用的。另一种原料包括细胞，例如白小体或其培养物的剩余物、哺乳动物的精子、精母细胞和胚细胞。
在蛋白水解酶(例如木瓜蛋白酶，tripsin等)的存在下用已知方法进行蛋白水解。
蛋白水解的条件和时间显然取决于蛋白水解酶的类型，这已是众所周知的，较佳的操作条件范围是温度为10～90℃，时间为0.5～10小时。
例如用木瓜蛋白酶进行蛋白水解通常在65℃进行4小时。
现在考虑步骤b的过滤和浓缩，后者最好在具有切向流的薄膜上进行。实际上，在该方法中能够选择所需要的分子量范围，选择的薄膜应具有较好的分子限定范围(一般为50,000～100,000)。
所得到的浓缩液与在浓缩液中能沉淀磷酸盐的阳离子混合(步骤c)。阳离子盐例如钙、锌(Ca、Zn)的卤化物、硫酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐等等，可以加入到浓缩液中，将PH值调至酸性。
沉淀物的悬浮液在恒容条件下通过孔径为0.45μ或更小的过滤膜在切向流中进行分离过滤(步骤d)，并用水连续补充入悬浮液以保持恒容，直到多糖物质从滤液中消失。
向核酸的不溶性盐的悬浮液中添加水溶性盐(步骤e)，这些水溶性盐是碱金属，如钠或钾，的卤化物或乙酸盐。
在得到的悬浮液中残留的不溶性阳离子(例如钙、锌等)，可以在恒容条件下用分子限定范围小于10,000的过滤膜由切向流分离过滤，除去阳离子。并连续补充盐水以保持容积恒定。
连续进行该处理直到在渗透液中不再存在不溶性阳离子为止。另外，也可通过将步骤d得到的悬浮液进行离子交换来除去不溶性阳离子。
如果需要，将原核酸溶液的阳离子力调节到至少1摩尔，最好是3摩尔，最好添加碱金属的水溶性盐，并将溶液的PH值调节到根据实验测量相应于系统最大的可逆增色性，该PH值一般在4～5之间。
在这步骤中原核酸经过稳定聚合形成高聚合的切口的聚脱氧核苷酸。
尽管步骤a～c的实施温度范围为10℃到90℃，但一般能在室温下进行。
稳定聚合步骤(步骤f)完成后，便可以进行高聚合的切口的聚脱氧核苷酸的解聚，尽管解聚温度范围为60～90℃，但最好在加热到约70～75℃的温度下进行。同时可通过测量可逆增色性的变化来控制解聚过程。
一旦冷却到较低温度，最好为15～30℃，解聚过程就终止，然后将反应物料调节到PH值大于7的碱性，最好PH值为8或更高，以便断裂所得双丝碎片中的剩余氢键。
最后，加热溶液，稳定所得到的单丝碎片，在步骤h中加热的温度至少要比解聚温度高5℃，一般温度为65～100℃。
附图用一般表达式大致说明了从器官中提取并经过蛋白水解消化的原核酸在各步骤中的变化。
可以清楚地看出，当原料设想为或多或少地不成对的，令人失望的且随着用缩略语SM表示的短脱嘌呤长度的形成部分降解的聚核苷酸体系时，当原料溶于具有高离子力并足以质子化的最好为3摩尔的碱金属水溶性盐溶液时，众所周知，由于从溶剂介质中可得到氢键，根据碱基配对Chargaff规则，这些形成原料的分子趋于聚合。因为聚核苷酸链部分是不闭合的，偶然的配对导致了形成高聚合的双丝聚核苷酸，间断点(切口)依次不规则地中断丝体，切口在沿着图中用缩略语AS(聚合体系)表示的结构的亲水界面形成。如图所示，图中的疏水区(IR)和亲水区(IF)带有负电荷。
当适当地调节所提供的热能时，可导致断裂，主要发生双丝体的破裂。因此产生的双丝碎片具有某些规律性(如图中DSF所示)。
断裂程度通过调节几个化学物理参数控制，主要一个参数是该体系(已有定义)的可逆增色性指数。
当可逆增色性达到Defibrotide特征值15±5时，氢离子断裂，从而导致使核酸碱基成对的氢键断裂，于是得到具有所需特征结构的聚脱氧核苷酸的单丝体。
人们还发现，当溶液在PH值为8±0.2时，在以前采用的聚合条件下，以高于解聚时的温度进一步加热，在结构中单丝体的自由度状态稳定，且具有15％可逆增色性的Defibrotide特征。
在体系中引入动能以防止发生再聚合，这种再聚合可能出现在分离有价值的聚脱氧核苷酸成分的连续工艺中。
只有这样，稳定的聚脱氧核苷酸的丝体(如图中SSD所示)才能保持所需Defibrotide结构特征的全部化学性质。
采用这种方式，脱嘌呤的程度可以降低至最小，并且嘌呤基和嘧啶基之间比率很少小于0.95％。
最后要指出的是根据本发明的工艺，能够获得具有Defibrotide的化学和药理学性质的标准聚脱氧核苷酸。在这项工作的研究过程中业已发现上述具有所需性质的聚脱氧核苷酸还能够从除牛肺外的其他来源中获得。现已惊奇地发现，按照上述准则操作，聚脱氧核苷酸还可以从其它来源，如牛或猪的肺和肠、肝和胸腺中获得。考虑到Defibrotide产品的预期的治疗消耗量，这种可能性是很重要，似乎有必要放宽原料来源。特别突出的优点是能够使用肝素生产中的母液、萃取液和蛋白水解产物作为原料，尽管这些原料来源极为丰实，但至今没有充分利用，它们的处理也是污染方面的一个重要原因。
本发明的另一个优点是不仅扩大了Defibrotide萃取来源的可能性，而且增加了从生产肝素和蛋白溶胞产物的工艺的付产品中回收Defibrotide的可能性，使这些工艺更加经济。此外，还减小了由于那些其它工艺中存在的富集的磷酸盐剩余物而引起的污染，这些剩余物事实上也是核酸的来源。
下列实施例说明如何实施所要求的工艺，但并不是限定本发明的范围。
实施例1将100Kg的冷冻牛肺研磨并分散于含有200g粗木瓜蛋白酶的50升饮用水中，用亚硫酸盐活化。该分散液的PH值用稀盐酸调到5.8，然后将该物料加热到65℃进行蛋白水解。在4小时后通过将该物料加热至沸腾15分钟后，停止蛋白水解。通过压滤机过滤后，分散液中的固体在压滤器中除去，将蛋白水解的滤液在具有50000分子限定范围的管式薄膜Romicon上通过切向流过滤并浓缩到25升的体积。用大约8UI/ml肝素活性的渗透膜回收肝素和氨基酸。
将浓缩液用150g的无水氯化钙处理，调节溶液的PH值到3，使核酸部分沉淀，从而保证多糖部分留在溶液中。
悬浮液通过孔隙度为0.45微米的管式过滤膜Romicon由切向流进行分离过滤，并通过加入0.01氯化钙溶液保持浓缩液体积恒定。分离过滤连续进行直到浓缩物不发生多糖与十六烷基吡啶鎓的反应为止。
使用分离过滤的渗透膜回收多糖，得到大约50g的由Condrotin硫酸盐和肝素组成的混合物。
将含有不溶性核酸钙盐分离过滤的浓缩液的悬浮液与25升3M氯化钠混合。该混合物通过具有10000分子限定范围的过滤膜Romicon由切向流分离过滤，浓缩物的体积通过加入3摩尔氯化钠溶液保持恒定直到该渗透液不再引起钙与草酸铵的反应为止，用这种方法，钙和钠离子之间的交换导致了全部核酸转化成为钠盐形式。
将浓缩液用切向流在相同过滤膜上过滤以进一步浓缩浓缩液直到体积达到7.5升为止。这样在3摩尔盐溶液中浓缩液含有大约3％(分光光度推定法)原核酸的钠盐，与0.22％的原料器官重量相当。在溶液中加入3M盐酸以调节最大减色点，直到在溶液试样再次呈碱性时，分光光度测量的增色性不能显示吸收的最大δ为止；已经发现当PH值达到4.25，后者等于天然DNA的38％，从而与体系的最大减色点相当，必然与溶液中的聚脱氧核糖核苷酸的聚合和碱基配对的最大状态相当。
当达到这样的条件后，将溶液加热到75℃使其开始解聚。
以15分钟的时间间隔，通过测量溶液试样的增色性控制解聚的速度。在测量6次以后，将数据记录在笛卡儿坐标系的纵坐标上，使用外推法在时间的横坐标上推断4小时后所获得聚脱氧核苷酸在天然DNA中的增色性为19％。
因此在4小时后在聚合条件下将解聚的物质冷却到30℃的温度终止解聚，且用3摩尔氢氧化钠使其呈碱性(PH8)。
将温度升高到85℃并维持30分钟以稳定聚核苷酸的结构，然后将溶液热过滤并使其透析并用如上述的切向流浓缩至6500毫升的体积。
用乙醇从浓缩液中沉淀出最终产物。
用乙醇脱水并在60℃真空中干燥后，得到有下列分析性质的126g产物p＝8.40％ G＝8.60％d＝34.10％ C＝6.15％A＝8.90％ T＝9.20％P/(A+G+C+T)mol＝1.07嘌呤/嘧啶mol＝0.96
用P表示的摩尔消光系数ε(P)＝7.800消光系数E1Cm1%=230]]>旋光本领〔α〕D20°＝+570增色性(在天然DNA中)h＝18％从上述记录的化学计算数据得出下列核苷酸化学式P3，(dAp)12，(dGp)10，(dCp)10，(dTp)13实施例2将1000Kg猪肺用实施例1中描述的方法处理，得到具有下列性质的700g DefibrotideD＝8.50％ G＝8.90％d＝36.20％ C＝6.80％A＝9.30％ T＝10.20％P/(A+G+C+T)mol＝1.02嘌呤/嘧啶mol＝0.90〔α〕D20°＝+53°h＝16％ ε(P)＝7.750从上述记录的化学计算数据得出下列核苷酸的化学式P，(dAp)12，(dGp)10，(dCp)10，(dTp)14。
实施例3将1000升牛肠粘膜生产肝素所得到的母液用切向流薄膜浓缩到55升。
按美国专利3,770,720中描述的方法用氯化锌沉淀核酸。通过倾析和洗涤分离该多糖，将沉淀物悬浮在水中，并通过用以Na+形式的离子交换树脂IR120处理溶液使其转化成钠盐。
在洗脱液中所含的核酸钠盐通过加入等体积的5M乙酸盐缓冲液(PH3.9)进行聚集，从而得到最后混合物，其PH为4.1并用于体系的最大可逆增色性的测量。
将混合物加热到70℃，用可逆增色性指数维持这个温度，并且每15分钟监测一次，在4小时以后这个指数达到h＝18％。将该溶液冷却到25℃，然后用5N氢氧化钠将其PH调节到7.8然后加热到85℃且维持30分钟。在过滤后1.0体积的产物用1.5体积的乙醇沉淀，然后将沉淀物洗涤，用乙醇脱水，最后在60℃真空中干燥。
得到630g具有下列化学性质的产物P＝8.73％ G＝8.5％d＝36.40％ C＝6.9％A＝9.60％ T＝9.7％P/(A+G+C+T)mol＝0.4嘌呤/嘧啶mol＝0.92ε(P)＝7.580〔α〕D20°＝51°h＝15％相应得到下列核苷酸化学式P2(dAp)13，(dGp)10，(dTp)14，(dCp)11。
实施例4将根据美国专利3,770,720披露的方法从牛肺中得到的30Kg核苷酸钠盐溶解于500升3M PH值为4.5的乙酸盐缓冲液中形成具有最大可逆增色度的溶液。
将这样得到的溶液过滤并加热到75℃。以15分钟的时间间隔测定试样的可逆增色性指数，其增色性数据记录在笛卡儿坐标系的纵坐标上，而横坐标上记录时间，从而将试样记录在该坐标上。
以3次或4次测量得到的数据为基础，可以外推得到使体系的增色性h达到15％值(以天然DNA表示)所需要的时间，在这段时间内要连续加热。
用5N氢氧化钠将所得物质的PH值调节到8并加热到80℃持续60分钟，以稳定聚脱氧核苷酸的结构，该结构的聚脱氧核苷酸具有Defibrotide的性质。
最后将溶液过滤并用实施例3指出的方法干燥。得到大约15Kg的产物，所制备的产物在本实施例中描述的性质如下P＝8.83％ G＝8.40％d＝37.80％ C＝7.00％A＝9.90％ T＝9.85％P/(A+G+C+T)mol＝1.06嘌呤/嘧啶mol＝0.95ε(P)＝7.750〔α〕D20°＝+54°h＝17％得到核苷酸的化学式是P，(dAp)13，(dGp)11，(dTp)14，(dCp)12。
实施例5本实施例是实施例4的一个改型，即在解聚步骤中，用分子限定范围为100,000的薄膜由切向流渗透法从体系中除去解聚产物。这种除去方法可避免已经有Defibrotide结构的聚脱氧核苷酸进一步降解，从而提高产率。
实际上本实施例的操作条件是与实施例4一样的。其变化在于从30Kg的核酸钠盐中获得了16.5Kg的与实施例4产物相同性质的产物。


对由原核酸稳定聚合得到的高聚合的切口的聚脱氧核苷酸的稳定溶液进行解聚，解聚是在控制的温度下通过加热进行，并且由可逆增色性的变化函数进行控制，然后断裂双丝体中的氢键并通过加热稳定单丝体，这样便获得名为Defibrotide的聚脱氧核苷酸。
Defibrotide具有明确限定的化学物理性质及工业生产的可再制性。