专利名称：L-半胱氨酸酶法转化制备方法L-半胱氨酸是自然界存在的氨基酸，也是人体的非必需氨基酸之一，其所带的巯基具有重要的生理功能。L-半胱氨酸及其衍生物可用于医药领域、化妆品工业、食品领域和饲料添加剂领域等，具有非常广泛的应用。根据目前文献报导L-半胱氨酸的制备方法主要有提取法、化学合成法、发酵法和酶转化法。1、提取法目前国内生产L-半胱氨酸主要以人或动物毛发为原料，先经酸水解提取L-胱氨酸，再经过电解还原制得L-半胱氨酸。该方法大规模工业化生产受到原料来源的限制，产物中易混入其它氨基酸，分离难度大，环保成本高。也有厂家在生产L-半胱氨酸的相关产品中回收L-胱氨酸，曾庆群等(CN 101104599A,2008)对N-乙酰-L-半胱氨酸生产过程中排放的废液进行氧化处理，分离回收了 L-胱氨酸，提高了原料利用率，降低了生产成本。但是，近年来随着人们环保意识的增强或宗教信仰等原因，一些西方国家禁用由动物毛发为原料制得的L-半胱氨酸，因此寻求新的制备L-半胱氨酸的方法势在必行。2、化学合成法化学合成法是利用氯代烷类化合物经过氧化反应、加成反应、还原反应、取代反应，最后得到DL-半胱氨酸。化学合成法不仅步骤较多，而且得到的产物通常为外消旋体， 需经拆分后才能得到具有生理活性的L-半胱氨酸。马云峰(CN 1876628A, 2006)以DL-半胱氨酸为原料，以无机酸为溶剂，以D- 二苯甲酰酒石酸或L- 二苯甲酰酒石酸为拆分剂，将外消旋半胱氨酸与拆分剂按一定摩尔比溶于稀的无机酸溶液中，保温搅拌、冷却结晶，分别制得L-半胱氨酸和D-半胱氨酸。3、发酵法目前发酵法生产L-半胱氨酸正处于实验室探索阶段，其主要问题是微生物体内的L-半胱氨酸合成过程复杂，且巯基来源难以解决。张建国(CN 101831397A，2010)利用基因改造的大肠杆菌BL21(DE3)，在含葡萄糖、玉米粉、牛肉膏、乳糖、氯化钠、硫代硫酸钠等成分的培养基中发酵产生了 L-半胱氨酸， 基因改造前的大肠杆菌BL21 (DE3)L-半胱氨酸产量几乎为0，而基因改造后的BL21 (DE3) L-半胱氨酸产量达到lg/L。托马斯·迈尔(CN 1262646C，2006)采用半胱氨酸代谢去调节、CysB活性增加的改造菌株，在含葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠等成分的培养基中补料分批发酵，流加葡萄糖及硫代硫酸盐，发酵4 后发酵液中L-半胱氨酸含量达到22. 6g/L。Takagi Hiroshi (EP1234874, 2002)以棒状杆菌为出发菌株，通过基因改造提高胞内丝氨酸乙酰转移酶活性，同时降低半胱氨酸脱巯基酶活性，在含葡萄糖、硫酸铵等成分的产半胱氨酸培养基中发酵，积累了 L-半胱氨酸和L-胱氨酸。4、酶转化法自 1979 年 Sano K.等(Applied and Environmental Microbiology, 34 (6) 806-810,1977)发现嗜硫氮杂环戊烯假单胞菌转化DL-2-氨基-Δ 2-噻唑啉-4-羧酸 (DL-ATC)为L-半胱氨酸以来，酶法生产L-半胱氨酸已成为近年来人们关注和研究的方向。 酶法转化因具有专一性强、反应条件温和、环境友好等优点而日益受到重视。日本具有用DL-ATC为原料酶法制备L-半胱氨酸较为成熟的生产工艺，国内学者也做了相关研究。王普(CN 100467587C,2009)以假单胞菌ζjwp_14湿菌体或粗酶液为酶源，以DL-ATC为底物，于20 52°C酶促转化1 9h，得到含L-半胱氨酸的反应液，经分离提取制得L-半胱氨酸。陈宁(CN 101348809A,2009)以恶臭假单胞菌(I^seudomonas putida) TS-1138为供试菌种，以全细胞为酶源酶法转化DL-ATC合成了 L-半胱氨酸。以DL-ATC为底物酶法合成L-半胱氨酸，需要化学合成DL-ATC，且酶转化过程中需要多步酶促反应，整体催化效率不高。焦庆才等(BioresourceTechnology, 102 :3554-3557,2011)以 L-丝氨酸和吲哚为底物，以色氨酸合成酶基因工程菌DM206(pETj8a-trpBA/BL21)酶法合成了 L-色氨酸。 但据文献报道色氨酸合成酶不仅能够催化L-丝氨酸和吲哚合成L-色氨酸，还能催化L-丝氨酸和硫氢化钠反应生成L-半胱氨酸。Ken-ichi Ishiwata等(Journal of Fermentation and Bioengineering, 67 (3) 169-172，1989)以L-丝氨酸和硫氢化钠为底物，色氨酸合成酶酶法合成了 L-半胱氨酸，在最佳条件下反应液中L-半胱氨酸达到114g/L，转化率是以L-丝氨酸和吲哚为底物酶法合成L-色氨酸的47%。日本专利(JP62215396-A，1987 ； JP63007790-A, 1988)报道了以 L-丝氨酸为底物， 以硫化氢或硫氢化物或硫化物为巯基供体，色氨酸合成酶酶法合成L-半胱氨酸。日本专利 (JP62019098-A, 1987)以DL-丝氨酸和硫化物为底物，用色氨酸合成酶将L-丝氨酸转化生成L-半胱氨酸或L-胱氨酸，同时分离制备了 D-丝氨酸。以上色氨酸合成酶酶法合成L-半胱氨酸的报道均以L-丝氨酸纯品为底物，目前 L-丝氨酸和L-半胱氨酸的生产成本大体相当，故以L-丝氨酸纯品酶法合成L-半胱氨酸无现实意义。
本发明需要解决的问题是提供一种高效、低成本的制备L-半胱氨酸的方法。本发明以氨基酸工业中富含L-丝氨酸的混合氨基酸料液代替L-丝氨酸纯品，以色氨酸合成酶酶法合成L-半胱氨酸。本发明可以通过以下技术方案来达到L-半胱氨酸的酶法转化制备方法，其步骤为(1)色氨酸合成酶基因工程菌DM206 (pET-28a-trpBA/BL21)，在含有异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)或乳糖的培养基中培养，诱导产生色氨酸合成酶；(2)将含有色氨酸合成酶的湿菌体或粗酶液与含L-丝氨酸的混合氨基酸料液混合，再加入适量磷酸吡哆醛、表面活性剂、硫氢化钠或硫化钠或硫氢化铵或硫化铵或硫化氢，在25 55°C，pH 6 11条件下进行酶促反应；将反应生成的L-半胱氨酸氧化后分离得到L-胱氨酸，再经过电解还原制得L-半胱氨酸。上述步骤(1)中的培养基碳源采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和/或果糖，培养基中总碳源质量浓度为1 20g/L ；氮源采用牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨和/或豆饼水解液，培养基中总氮源质量浓度为1 30g/L ；加入IPTG或乳糖诱导，IPTG终浓度为0. 05 0.15g/L，乳糖终浓度为5 15g/L。上述步骤O)中含L-丝氨酸的混合氨基酸料液为角蛋白水解液或蚕丝水解液或酶法合成L-丝氨酸的反应液，混合氨基酸料液中总氨基酸含量(w/w)为10% 50%，其中 L-丝氨酸在总氨基酸中含量(w/w)为10% 95%。上述步骤( 的转化液中加入适量的表面活性剂吐温-80或十六烷三甲基溴化铵 (CTAB)或聚乙二醇辛基苯基醚(OP)，其浓度为0. 005g/L 5. Og/L。目前，我国L-半胱氨酸生产主要来源于毛发水解提取法，该方法工艺成熟，但大规模工业化生产受到原料来源的限制，短时间内难以扩大生产规模，环保压力大。而另一方面我国在氨基酸工业生产中，会产生大量不能直接用于食品和医药方面的富含L-丝氨酸的混合氨基酸料液，该混合氨基酸料液直接分离制备L-丝氨酸成本高、效率低。本发明以富含L-丝氨酸的混合氨基酸料液为原料，以色氨酸合成酶酶法合成了 L-半胱氨酸。本发明与现有技术相比具有如下优点(1)本发明采用的色氨酸合成酶基因工程菌DM206，在优选的培养基中培养可以高效表达色氨酸合成酶，使酶法合成L-半胱氨酸有较高的催化速率和转化率，其中L-丝氨酸摩尔转化率达到80 %以上。(2)本发明采用含L-丝氨酸的混合氨基酸料液为反应原料，充分利用了工业副产物，解决了混合氨基酸料液中L-丝氨酸高效分离的难题，同时也为大规模生产L-半胱氨酸提供了更为丰富的原料，具有良好的经济效益和社会效益。(3) L-半胱氨酸氧化后得到L-胱氨酸，L-胱氨酸和混合氨基酸料液中的其它氨基酸理化性质有较大差异，用等电点结晶法即可实现分离。(4)酶法合成L-半胱氨酸具有反应条件温和，酶立体选择性强，催化效率高，成本低，工艺流程简单等优点，适合工业化生产。1.0，加热去除H2S,活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/LNa0H调pH 5. 0，将滤液中的L-半胱氨酸通空气氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得16. 8g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色， 中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得15. 6gL-胱氨酸精品，比旋光[α^= -223° (c = 2，lmol/L 盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。实施例二1.将IOOOmL发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体19g加入到500mL转化液中， 转化液中含46g/L L-丝氨酸的毛发酸水解液(氨基酸总含量10% )、15g NaHS,0. 2g/L磷酸吡哆醛和5g/L吐温-80，pH 9. 0，35 °C酶促反应^h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为45g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为84. 9 %。2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH 1. 0，加热去除H2S,活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/LNa0H调pH 5. 0，将滤液中的L-半胱氨酸通空气氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得21g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得19. 6g L-胱氨酸精品，比旋光[α^=-224° (c = 2, lmol/L 盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。实施例三1.将IOOOmL发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体18g加入到500mL转化液中， 转化液中含25g/L L-丝氨酸的毛发酸水解液(氨基酸总含量25%)、8g NaHS,0. 2g/L磷酸吡哆醛和0. 5g/L吐温-80，pH 9. 0，25 °C酶促反应15h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为23. 8g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为82.6%。2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH 1. 0，加热去除&S，活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/L NaOH调pH 5. 0，将滤液中的L-半胱氨酸滴加双氧水氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得10. 5g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得9. SgL-胱氨酸精品，比旋光[^g= - 224° (c = 2， lmol/L盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。实施例四1.将IOOOmL发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体19g加入到500mL转化液中， 转化液中含70g/L L-丝氨酸的蚕丝酸水解液(氨基酸总含量35% )、32g Na2S、0. 2g/L磷酸吡哆醛和0.05g/L CTAB，pH 9. 0，40°C酶促反应40h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为68. 8g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为85.3%。2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH 0. 5，加热去除H2S,活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/LNa0H调pH 5. 0，将滤液中的L-半胱氨酸滴加双氧水氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得32. 5g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得31g L-胱氨酸精品，比旋光[ag=-221° (c = 2， lmol/L盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。实施例五1.将IOOOmL发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体18g加入到500mL转化液中， 转化液中含84g/L L-丝氨酸的蚕丝酸水解液(氨基酸总含量30%)、^g NH4HS、0. 2g/L磷酸吡哆醛和0. 5g/L CTAB, pH 7. 0，37°C酶促反应40h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为81. 6g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为84. 3%。2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH 0. 5，加热去除H2S,活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/LNa0H调pH 5. 0，将滤液中的L-半胱氨酸滴加双氧水氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得38. 2g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得37g L-胱氨酸精品，比旋光[α^=-220° (c = 2，lmol/L盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。实施例六1.将IOOOmL发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体17g加入到500mL转化液中， 转化液中含44g/L L-丝氨酸的蚕丝酸水解液(氨基酸总含量20% )、20g (NH4) 2S、0. 2g/L磷酸吡哆醛和0. 5g/L吐温80，pH 6. 0，55 °C酶促反应30h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为41. 2g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为81. 3%。2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH 0. 5，加热去除H2S,活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/L NaOH调pH 5. 0，将滤液中的L-半胱氨酸通空气氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得18. 8g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色， 中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得17g L-胱氨酸精品，比旋光[α^=-221° (c = 2, lmol/L 盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。实施例七1.将IOOOmL发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体19g加入到500mL转化液中， 转化液中含105g/L酶法合成L-丝氨酸的反应液(氨基酸总含量11% )、47g Na2S、0. 2g/L 磷酸吡哆醛和0. 5g/L吐温-80，pH 11，37 °C酶促反应45h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为102g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为84. 3%。2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH 0. 5，加热去除H2S,活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/L NaOH调pH 5. 0，将滤液中的L-半胱氨酸通空气氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得49. 6g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色， 中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得48g L-胱氨酸精品，比旋光[α^=-222° (c = 2, lmol/L 盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。实施例八1.将IOOOmL发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体19g加入到500mL转化液中， 转化液中含120g/L酶法合成L-丝氨酸的反应液(氨基酸总含量50% )、39g NaHS,0. 2g/ L磷酸吡哆醛和0. 5g/L吐温-80，pH 8，37 °C酶促反应45h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为118g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为85.3%。2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH 0. 5，加热去除H2S,活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/L NaOH调pH 5. 0，将滤液中的L-半胱氨酸通空气氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得57. 6g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色， 中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得56g L-胱氨酸精品，比旋光[α^=-224° (c = 2, lmol/L 盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。实施例九1.将IOOOmL发酵液离心得到的19g色氨酸合成酶湿菌体超声波破碎制成20ml粗酶液，加入到500mL转化液中，转化液中含200g/L酶法合成L-丝氨酸的反应液(氨基酸总含量30%)和0. 2g/L磷酸吡哆醛，通入H2S气体并用氨水调pH 9. 0，37°C酶促反应50h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为193g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为83. 7%。2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH 0. 5，加热去除&S，活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/L NaOH调pH 5. 0，将滤液中的L-半胱氨酸通空气氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得95gL-胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得93. 4g L-胱氨酸精品，比旋光[α^=-222° (c = 2, lmol/ L盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。

本发明属于生物技术领域，具体涉及L-半胱氨酸的酶法转化制备方法。该制备方法采用含有L-丝氨酸的混合氨基酸料液为原料，将具有L-色氨酸合成酶活性的湿菌体或粗酶液与含有L-丝氨酸的混合氨基酸料液混合，添加适量硫氢化物或硫化物，25～55℃，pH6～11条件下进行酶促反应，将反应生成的L-半胱氨酸通空气或滴加双氧水氧化，等电点结晶法分离得到L-胱氨酸，再经过电解还原制得L-半胱氨酸。该方法解决了混合氨基酸料液中L-丝氨酸的分离及综合利用难题，得到了附加值较高的L-半胱氨酸产品，具有原料来源广、价格低廉，操作简便，酶促转化时间短、生产成本低等优点。