专利名称：一种柿叶中提高脑缺血耐受作用的提取物的制作方法柿树属柿树科(Ebenaceae)柿树属(Diospyros)植物柿(Diospyros kaki L. . f) 植物，是我国南北各地普遍栽培的食用品种。柿果、柿核、柿蒂、柿霜、柿漆、柿饼、柿树心木、 柿花、柿叶、柿子皮、柿木皮及柿根皮等均可作为药用或有可能成为药物。在我国柿叶资源 特别丰富，使用方便，医用疗效确切，正日益受到人们的重视，柿的新鲜或干燥叶，其入药始 见于明《滇南本草》记载“经霜叶敷臃疮”。柿叶中含有丰富的营养物质和功效成分，具有抗 菌消炎、生津止渴、清热解毒、润肺强心、镇咳止血、抗癌防癌等多种保健功能，而且柿叶产 品食用安全无毒，故柿叶的开发利用前景广阔。现代研究表明柿叶含有以萘为骨架的芳香化合物(萘醌类、萘酚类)，苯并吡喃 酮类(黄酮类、花色素类、香豆素类)，萜类(主要是三萜化合物且都是五环三萜化合物)， 谷甾醇类，脂肪酸，鞣质，柿叶中含有大量的维生素C、E和有机酸类等。柿叶有好的改善心 脑血管功能作用。柿叶具有止血作用；柿叶提取液有抗菌、解热作用；柿叶具有明显的抗氧 化作用；柿叶具有明显的减肥降脂作用；柿叶有抗癌变和抗诱变作用，调节免疫功能作用。 柿叶粉能显著降低食用高固醇食物小鼠肝脏中的胆固醇浓度，增加胆汁酸的排泄。临床上柿叶有软化血管和预防动脉硬化的作用，用于治疗心脑血管疾病；应用柿 叶可治疗多种出血症；柿叶具有抗菌消炎、解热作用；柿叶有预防贫血、降脂减肥和美容的 作用；有抗癌和抗诱变作用；柿叶复方对妇女某些疾病如痛经有效，柿叶茶对患者的精神 状态和食欲有好。柿叶有清血利尿、治疗烧伤和褥疮的作用。脑缺血耐受现象[1] (Brain ischemic tolerance，BIT)是指预先短暂性缺血或轻 度缺氧激发或动员机体内在的防护能力，使机体对随后严重的缺血、缺氧产生防御和保护 作用的现象。脑缺血耐受现象最初在研究心肌缺血时发现，脑、骨骼肌、肝、肾、小肠等器官 中也发现了类似现象。现认为脑缺血耐受的机制主要有兴奋性氨基酸(EAA)、炎症、热休克 蛋白(HSP)、腺苷、细胞凋亡、反应性星形细胞增生和信号传导通路。药物(腺苷、3-硝基丙 酸(3-NPA)、某些抗生素、麻醉药物、阿司匹林、内毒素、缓激肽、神经营养因子等)对脑缺血 耐受的提高作用，但因多方原因，上述药物在脑缺血耐受中应用受到了制约。祖国医学没有 脑缺血耐受的明确提法，但祖国医学对脑缺血辨证清楚，脑缺血属于中医“缺血中风”的范 畴。缺血中风的发生主要与风、火、痰、淤、虚等因素有关，而与“淤”关系最为密切，“活血化 淤”可是提高脑缺血耐受的基本方法。那么如何利用中医药大宝库来解决提高脑缺血耐受 作用呢？至今未见有公开报导。
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种柿叶中提高 脑缺血耐受作用的提取物，可有效解决提高脑缺血耐受作用的问题。本发明解决的技术方案是，该提取物为柿叶提取物，是将柿叶粉碎成粗粉，加入柿 叶粗粉重量的8-10倍量的质量浓度为70%的乙醇，浸泡30min后，回流提取Ih ；过滤，药渣 再加柿叶粗粉重量的6-8倍的质量浓度为70%的乙醇，回流提取Ih过滤，合并两次滤液，回 收乙醇后，用NaOH调pH至13，3000r/min离心15min，得柿叶提取物，或称取柿叶粗粉，用超 临界( 萃取法，萃取压力为30. OmPa,萃取温度50°C，CO2流量30Kg/h，萃取池，得柿叶提 取物。本发明提取物有效用于制备治疗提高脑缺血耐受作用的药物。制备方法简单，原 材料丰富，成本低，效果好，开拓了柿叶的药用价值，是中药上的创新。做详细说明。实施例1，本发明在具体实施时，是由柿叶经粉碎机粉碎过30目筛成柿叶粗粉，然 后，取柿叶粗粉100克加入柿叶粗粉重量十倍量的质量浓度为70%乙醇1000克，浸泡30 分钟，回流提取1小时，过滤得滤液；药渣再加入柿叶粗粉重量8倍的质量浓度为70%的乙 醇800g，回流提取1小时，过滤得滤液，合并两次滤液，回收乙醇后，用NaOH调pH值为13， 3000r/min离心15min，得柿叶提取物。实施例2，本发明在具体实施中，还可由以下实现将柿叶经粉碎机粉碎过50目 筛，成柿叶粗粉然后，取柿叶粗粉50克加入柿叶粗粉重量8倍量的质量浓度为70%乙醇 400克，浸泡30分钟，回流提取1小时，过滤得滤液；药渣再加入柿叶粗粉重量6倍的质量 浓度为70%的乙醇300g，回流提取1小时，过滤得滤液，合并两次滤液，回收乙醇后，用NaOH 调PH值为13，3000r/min离心15min，得柿叶提取物。实施例3，本发明在具体实施中，还可由以下实现将柿叶经粉碎机粉碎成粗粉， 然后，取柿叶粗粉80克加入柿叶粗粉重量9倍量的质量浓度为70%乙醇720克，浸泡30 分钟，回流提取1小时，过滤得滤液；药渣再加入柿叶粗粉重量7倍的质量浓度为70%的乙 醇560g，回流提取1小时，过滤得滤液，合并两次滤液，回收乙醇后，用NaOH调pH值为13， 3000r/min离心15min，得柿叶提取物。实施例4，本发明在具体实施中，也可由以下具体方案实现将柿叶经粉碎机粉碎 成粗粉，取粗粉100g，置入超临界萃取釜中，用超临界CO2萃取法，萃取压力为30. OmPaJ^ 度50°C，CO2流量30Kg/h，萃取池，得柿叶提取物。本发明提取物可有效用于制备治疗提高脑缺血耐受作用的药物，对于提高脑缺血 耐受作用经试验得到了充分的证明，有关试验资料如下对小鼠脑缺血耐受模型的影响1实验材料1.1试剂药品本发明柿叶提取物称取柿叶粗粉，加8-10倍量的70%乙醇，浸泡30min后回流 提取Ih ；过滤，药渣再加6-8倍量的70%乙醇，回流提取Ih过滤。合并两次滤液，回收乙醇 后用NaOH调pH至13，离心(3000r/min) 15min,得柿叶提取物。或称取柿叶粗粉，采用超临 界C02萃取法，萃取压力为30. OmPa，萃取温度50°C，(X)2流量30Kg · h—1，萃取时间3h，得柿 叶提取物。银杏叶提取物片(金纳多)，德国威玛舒博士药厂，批号9900908 ；水合氯醛，天 津市科密欧化学试剂开发中心，批号20071018 ；医用酒精，郑州晟弘工贸有限公司，批号 20090801 ；氯化钠注射液，郑州永和制药有限公司，批号09073105 ；碘[1251]6_酮-前列 腺素-F1 α内皮素，北京普尔伟业生物科技有限公司解放军总医院科技开发中心放免所， 批号20091125;碘[125I]血栓烷素化放射免疫分析药盒，北京普尔伟业生物科技有限公 司解放军总医院科技开发中心放免所，批号20091125;纤溶酶原激活剂(t-PA)含量测定 试剂盒(酶联免疫法)，上海太阳生物技术有限公司，批号41130;纤溶酶原激活剂抑制 物-I(PAI-I)含量测定试剂盒(酶联免疫法)，上海生物科技有限公司，批号42135。1. 2实验仪器JT6001电子天平，上海精天电子仪器厂；1202080019电子分析天平，奥豪斯 (上海)公司；KDC-160HR高速冷冻离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司；酶免仪， 680MicroplateReader, Bio-Rad Laboratories ；SN-695B 型智能放免 γ 测量仪，上海原子 核研究所日环仪器一厂。1. 3实验动物清洁级小鼠，昆明种，雄性，体重25 30g ；由河北省实验动物中心所提供，合格证 编号 911137。2.实验方法2. 1造模与给药取小鼠1 只，随机均勻分为7组，分别为假手术组、缺血再灌注组、预处理模型 组、柿叶醇提物高剂量组、柿叶醇提物中剂量组、柿叶醇提物低剂量组、银杏叶提取物组。所 有小鼠经10%水合氯醛(0. 03ml/10g)腹腔注射麻醉，仰固定于手术台上，颈前正中切口， 钝性分离双侧颈总动脉。除假手术组、缺血再灌注组外，其余各组小鼠用微动脉夹夹闭双侧 颈总动脉，分别阻断血流lOmin，然后恢复灌流；假手术组、缺血再灌注组只暴露双侧颈总 动脉，但不阻断血流。动物手术苏醒后，各给药组分别给予高剂量柿叶醇提物(400mg/kg)、 中剂量柿叶醇提物(200mg/kg)、低剂量柿叶醇提物(100mg/kg)、银杏叶提取物片GOmg/ kg)，假手术组、缺血再灌注组及预处理模型组灌同体积的生理盐水，所有小鼠的灌药体积 是0. lml/10g,每天给药1次，连续给药5天。于第5天禁食1 给药后lh，所有小鼠经 10%水合氯醛(0. 03ml/10g)腹腔注射麻醉，仰位固定于手术台上，颈前正中切口，钝性分 离双侧颈总动脉，除假手术组外，其余小鼠均用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉，分别阻断血 流30min，然后恢复灌流；假手术组只暴露双侧颈总动脉，不阻断血流。术中维持环境温度 M±1°C。实验过程中死亡33只小鼠，各组小鼠情况见结果。2. 2观察项目及检测方法所有小鼠于末次手术后24h取血，枸橼酸钠抗凝，分离血浆，采用酶联免疫法测定 纤溶酶原激活剂(t-PA)含量、纤溶酶原激活剂抑制物-I(PAI-I)含量；取血后处死，迅速 剥取脑组织，冠状切取做HE染色，切取皮层组织15mg，采用放射免疫法测定6-酮-前列腺 素-F1 α、血栓烷素化含量。2. 2. 1纤溶酶原激活剂含量的测定方法检验原理采用酶联免疫吸附双抗体夹心法原理定量测定组织纤溶酶原激活剂水 平。包被人t-PA抗体与待测样本中的t-PA结合，加入酶标抗体形成复合物，后者与底物作用呈现显色反应。490nm处测得的A值与待测样本t_PA含量成正比。操作程序①试剂重建浓稀释液用前置于37°C水浴15min，振摇均勻(因为母液盐 浓度高，冰箱保存易结冰析出)，然后用蒸馏水做10倍稀释(Iml浓稀释液+9ml蒸馏水)。 浓洗涤液用前置于37°C水浴15min，振摇均勻(因为母液盐浓度高，冰箱保存易结冰析出)， 然后用蒸馏水做20倍稀释(Iml浓稀释液+19ml蒸馏水)。将每瓶校准品用1. 8ml稀释液准 确复溶(60ng/ml)。取250 μ 1，用稀释液作四倍比稀释，得浓度为60、30、15、7. 5、3. 75ngml 五个标准点。②加样每孔加不同浓度校准品或待测样本100μ 1，空白对照孔加入稀释液 100μ 1，37°C孵育150分钟。③洗涤弃去反应孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置3秒钟，甩 干，反复三次后拍干。④加酶标抗体每孔加入酶标抗体100 μ 1，37°C孵育60分钟。⑤洗涤 弃去反应孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置3秒钟，甩干，反复三次后拍干。⑥显色临用前 每片OPD用5ml底物缓冲液溶解。每孔加底物液100 μ 1，37°C孵育15分钟。⑦终止每孔 加终止液50μ1。⑧比色在酶标仪上490nm处，以空白对照空调零，测定各孔A值。⑨数据 处理以A49c^it-PA校准品浓度(ng/ml)在普通坐标系上作标准曲线，待测样本t_PA含量 (ng/ml)可以从标准曲线上查出。2. 2. 2纤溶酶原激活剂抑制物-1含量的测定方法检验原理采用酶联免疫吸附双抗体夹心法原理定量测定纤溶酶原激活剂抑制 物-1水平。包被人PAI-I抗体与待测样本中的PAI-I结合，加入酶标抗体形成复合物，后 者与底物作用呈现显色反应。490nm处测得的A值与待测样本PAI-I含量成正比。操作程序①试剂重建浓稀释液用前置于37°C水浴15min，振摇均勻(因为母液盐 浓度高，冰箱保存易结冰析出)，然后用蒸馏水做10倍稀释(Iml浓稀释液+9ml蒸馏水)。 浓洗涤液用前置于37°C水浴15min，振摇均勻(因为母液盐浓度高，冰箱保存易结冰析出)， 然后用蒸馏水做20倍稀释(Iml浓稀释液+19ml蒸馏水)。将每瓶校准品用0. 5ml稀释液 准确复溶(120ng/ml)。取250 μ 1，用稀释液作六倍比稀释，得浓度为120、60、30、15、7· 5、 3. 75,1. 875ngml七个标准点。②加样每孔加不同浓度校准品或待测样本100μ 1，空白对照 孔加入稀释液100μ 1，37°C孵育150分钟。③洗涤弃去反应孔内液体，用洗涤液注满各孔， 静置3秒钟，甩干，反复三次后拍干。④加酶标抗体每孔加入酶标抗体100 μ 1，37°C孵育60 分钟。⑤洗涤弃去反应孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置3秒钟，甩干，反复三次后拍干。 ⑥显色临用前每片OPD用5ml底物缓冲液溶解。每孔加底物液100μ1，37 孵育15。⑦终 止每孔加终止液50μ 1。⑧比色在酶标仪上490nm处，以空白对照空调零，测定各孔A值。⑨ 数据处理以A49t^iPAI-I校准品浓度(ng/ml)在普通坐标系上作标准曲线，待测样本PAI-I 含量(ng/ml)可以从标准曲线上查出。2. 2. 3血栓烷化的测定方法测定原理利用液相竞争抑制原理，采用平衡法对样品进行测定。待测样本或标准 品与限量的抗血清及标记抗原加在一起进行竞争性结合反应，反应完全后，加入免疫分离 剂，分离出抗原-抗体复合物，测定复合物的放射性(B)，计算各标准管的结合率(Β/Β0%)。校准试剂缓冲液A，1瓶(液体)；缓冲液B，1瓶(蓝色，液体)；抗血清1瓶 (白色，冻干粉)；标准品1支(白色，冻干粉)，浓度为浓度为20，60，180，500，1000pg/ml ； 125I-TXB2 :1瓶(白色，冻干粉)；I3R分离剂1瓶(液体)，使用前充分摇勻。操作程序本实验采用平衡法，取聚乙烯试管编号，按下表程序操作TXB2RIA 加液程序(μ 1)


本发明涉及一种柿叶中提高脑缺血耐受作用的提取物，可有效解决提高脑缺血耐受作用的问题。本发明解决的技术方案是，该提取物为柿叶提取物，是将柿叶粉碎成粗粉，加入柿叶粗粉重量的8-10倍量的质量浓度为70％的乙醇，浸泡30min后，回流提取1h；过滤，药渣再加柿叶粗粉重量的6-8倍的质量浓度为70％的乙醇，回流提取1h过滤，合并两次滤液，回收乙醇后，用NaOH调pH至13，3000r/min离心15min，得柿叶提取物，或称取柿叶粗粉，用超临界CO2萃取法，萃取压力为30.0mPa，萃取温度50℃，CO2流量30Kg/h，萃取3h，得柿叶提取物。本发明提取物有效用于制备治疗提高脑缺血耐受作用的药物。制备方法简单，原材料丰富，成本低，效果好，开拓了柿叶的药用价值，是中药上的创新。