专利名称:利用淀粉葡萄糖苷酶和游动酵单细菌将经预处理并液化的淀粉转化成乙醇的制作方法本发明涉及一种利用高效的游动酵单胞菌种，在微需氧的条件下将预处理液化的淀粉转化成乙醇的方法。生产乙醇的传统方法是采用两级间歇发酵工艺，其中，前酵包括称之为生长阶段的酵母需氧繁殖，后酵包括在存有或不存有少量氧时乙醇生产的厌氧处理。在乙醇生产的后酵期间，为进一步繁殖酵母需要略为补充空气或氧。如果希望利用诸如沉降或离心装置进行酵母细胞再循环，以提高总的工艺效率，则后者是必需的。由于酵母发酵内在地取决于乙醇生产速率与生长的匹配，为选择乙醇生产的最佳条件，培养基必须补充以助生长物质或精细地控制通气。传统的酵母发酵工艺(后酵)取决于具有约5～10百万细胞/毫升规格的大的接种菌种的尺寸。优选的发酵温度在30℃～40℃之间，並使用冷却设备控制所产生的热。为得到9%～11%(体积/体积)的乙醇，半连续发酵培养工艺的后酵阶段时间为40～60小时。这一发酵时间可通过细胞再循环，使接种的菌种密度增加80～100倍而降低至10小时。淀粉水解物转化成乙醇的成本率表现为最好是在使用有3～5个供后酵处理之用的发酵罐的发酵培养工艺中，连续地添加新鲜酵母以得到最大利用效率和11%(体积/体积)乙醇。生产乙醇的第二种方法亦为已知，该方法使用游动酵单胞菌种(见欧洲专利No.0047641-George Weston Ltd.)。这一方法也是两级处理，正如上边所述的。但单细菌种在其生长阶段(前酵)不需要添加空气，而需要供应足够的氮气以保持厌氧条件。在乙醇生产的后酵处理期间，糖的浓度决不能超过6%(重量/体积)，因此需要间歇地或连续地添加浓缩的糖溶液。较佳的温度为28℃～33℃，较佳的PH值为5.5。这一方法不仅需补充氮，亦需补充营养物。已经公开的还有第三种乙醇生产方法，该方法是在两级发酵工艺中使用有固定化酵母或游动酵单胞菌种，各自均带有一定量的糖(10%重量/体积)(见英国专利No.2055121-Tanabe Sugaku Co.Ltd.)。第四种生产乙醇的方法是通过细胞再循环，连续地使用游动酵单胞菌(澳大利亚专利AU-B-67696/81)或在半间歇培养条件下使用絮凝的游动酵单胞菌种(澳大利亚专利AU-B-78199/81)。在这两种情况下，发酵温度控制在30℃，PH值在5.0，培养基含有添加5～10克/升酵母浸膏的纯葡萄糖。在酵母发酵的情况下，已知的碳源转化的例子为蔗糖，葡萄糖，糖蜜，甘蔗汁和淀粉水解物;在游动酵单胞菌发酵的情况下，例子限于葡萄糖;在固定化细胞的情况下，限定在葡萄糖和糖蜜，而在本发明者以前的专利申请，限定在蔗糖，糖蜜，甘蔗浆，甜菜浆和葡萄糖/果糖混合物。本发明的一个目的就是提供一种从淀粉物料，如由谷物、玉米和木薯中得到的经预处理液化的淀粉生产乙醇的方法。该方法利用以游离或固定化状态存在的、或两种形式均有的淀粉葡萄糖苷酶(EC3、2、1、3)和游动酵单胞菌的组合作用。更为突出的目的是该方法提供了单级发酵处理工艺。另一目的是该方法可在有培养基存在时进行，其中淀粉组份的浓度大于10%(重量/体积)。
本发明的再一个目的是提供这样一种方法。该方法使用单级发酵，或者如果需要可对这一培养方法调节，例如分批加料、半连续发酵罐培养、连续或多级系统，其中的能量供给较低。
本发明的其它目的可由下面的描述中体现出来。
概括地讲，本发明属于在一个发酵罐中从预处理过的液化淀粉物料中生产乙醇的方法，其特征在于以下几个步骤(a)通过淀粉葡萄糖苷酶使预处理过的液化淀粉糖化成葡萄糖;以及(b)在有发酵培养基存在的条件下，利用微生物游动酵单胞菌将葡萄糖发酵成乙醇。
“预处理过的液化淀粉”是一种由干法或湿法研磨含植物料的淀粉而得到的麦芽素(maltrin)、糊精、淀粉、脂类以及蛋白质的复杂混合物。该产物经物理、化学或酶剂处理以降低淀粉的粘度，以便于在随后的发酵工艺或食品工业中可使用较高的浓度。
糖化和发酵工序最好是在同一发酵容器中以单级发酵处理的形式同时进行。通过调节控制加入的淀粉葡萄糖苷酶的量来保证发酵前或发酵的同时由糖化所产生足够的葡萄糖，以满足游动酵单胞菌发酵生产乙醇的需要。
“单级发酵工艺”的含义为，在同一发酵容器中同时进行生长和生产两个阶段。该方法的起始既可通过向含有发酵培养基的发酵容器中添加含有游动酵单胞菌的种菌而完成，也可通过将发酵培养基加入含有一部分早先发酵操作的余物的发酵罐中而完成，该余物含有游动酵单胞菌。
发酵最好是在微需氧条件下进行。
“微需氧条件”是指不加任何气体(氧、空气、氮等)到发酵罐中，发酵培养基表面暴露于大气中。微生物游动酵单胞菌在其生长和发酵生产乙醇过程中不需要空气或氧(好气)或氮(厌气)，但容许在发酵培养基表面存有空气。
微生物游动酵单胞菌的优选菌株已分别于1984年4月24日和1986年1月17日寄存在昆士兰大学微生物系培养物保藏中心(St.Lucia，Queensland，4067，Australia)，寄存号为UQM2716，UQM2841和UQM2864及美国典型培养物保藏中心(ATCC)(12301Parklawn Drive，Rockville，Maryland，20952，U.S.A.)，寄存号为39676，53432和53431。
菌株UQM2716是通过连续培养技术由保藏在国家工业细菌保藏中心(Torry Research Station，Abbey Road，Aberdeen，AB9 8DG，United Kingdom)的菌株(寄存号NCIB11199)和寄存在ATCC的菌株(寄存号29191)以及寄存在昆士兰大学的菌株(寄存号UQM2007)进行选择得到的。选择是根据相对于母株UQM2007的蔗糖转化的改进性能及代谢率而确定。
菌株UQM2864是一种由菌株UQM2716得到的果糖用负突变体，而第三种菌株UQM2841是一种由菌株UQM2007得到的果糖用负突变体。这些菌株可以是游离或固定化状态，当然也可使用其突变化或变种。
预处理过的液化淀粉最好是由谷类中得到(如小麦、大麦、燕麦、黑麦、黑小麦、玉米、木薯、竹芋等)，可以是以滤清或未滤清的溶液状态，亦可结合任意其它指定的基质加入到发酵罐中。对淀粉物料所采用的预处理方式将视物料而定。
在本发明的一次典型商业实践中，第三方供应商向发酵罐操作人员提供了以化学不定的(复杂的)产品混合物形式存在的预处理过的液化淀粉，该混合物是通过一种通常被作为供应商贸易秘密的酶或非酶方法制得的。
在单级发酵中，为获得最大乙醇产率或在连续加料系统中获得更高产率，淀粉组份的较佳浓度范围为10%～30%(重量/体积)，最好是15%～20%(重量/体积)。
发酵培养基最好包括任一种或多种下述组份淀粉葡萄糖苷酶(EC3、2、1、3)、胨(干酪素水解物)、酵母浸膏、磷酸二氢钾(或铵或钠)、硫酸铵、或氢氧化铵或脲素、及硫酸镁。
这些组份(淀粉葡萄糖苷酶除外)的较好的浓度范围均为0.01%～0.5%，最好是大约0.2%。淀粉葡萄糖苷酶的浓度范围最好规定为10～100毫克/升或0.32～1.0GPU/克淀粉。“GPU”是用葡萄糖产生单位来表示酶活性(在PH为4.5，55℃条件下，三分钟内1个单位将由可溶性淀粉中释出1.0毫克葡萄糖)。酵母浸膏，胨(干酪素水解物)可用泛酸钙或β-丙氨酸代替。
上面所述的培养基组份(淀粉葡萄糖苷酶除外)可优先考虑用适当浓度的玉米浸液的浓缩液、甘薯汁或浆或糖蜜、甜菜汁或浆或糖蜜代替。
发酵工艺的PH值为3.5～7.0，最好控制在3.9～5.0之间，起始PH值为4.5～7.0。另一方面，通常对PH值为4.1左右的预处理过的液化淀粉/玉米浸液之浓缩液混合物的起始PH值可不加任何控制，也可调节这一自然PH值至4.3～5.0，在4.3～4.5范围内较好。然后进行发酵並通过混合物的自然缓冲作用保持PH值。这一点给于了该方法重要的经济上的优点。
发酵罐中的温度最好保持在25℃～40℃，将温度稳定地控制在30℃～35℃之间更可取。
为使充分理解本发明，现详细说明本方法的优选实施例。
实施例1将600克麦芽素(maltrin)(DE10)溶解于2升蒸馏水中。在添加75克玉米浸泡液浓缩液(50%固体含量)后，将该混合物加热至92℃经5～10分钟，然后转移到4升发酵罐中。冷却后用蒸馏水将体积稀释至2700毫升。向这一发酵培养基中添加相当于0.64GPU/克淀粉的淀粉葡萄糖苷酶。将在培养基中于37℃下生长12～24小时的种菌300毫升加入发酵罐中，该培养基含10%(重量/体积)葡萄糖、0.2%(重量/体积)酵母浸膏、0.2%(重量/体积)干酪素水解物(胨)、0.2%(重量/体积)磷酸二氢钾、0.2%(重量/体积)水合硫酸镁、0.2%(重量/体积)硫酸铵。
起始PH值为4.8，通过添加2N碱(如80克/升NaOH)控制PH值在4.5。在温度为35℃、搅拌速度为150转/分条件下进行培养。
15小时后出现最高的乙醇产量，得到的乙醇浓度为78克/升或9.87%(体积/体积)。
实施例2将500克麦芽素(maltrin)M-100溶于2升蒸馏水中，于92℃加热5～10分钟並转移入4升发酵容器中。添加200毫升培养基，该培养基含有任何一种或多种下述组份胨(干酪素水解物)、酵母浸膏、磷酸二氢钾、硫酸铵或脲素或氨或磷酸二氢铵、及水合硫酸镁，每种组份的浓度为0.2%(重量/体积)，其中胨和酵母浸膏可用泛酸钙代替;或者通过添加适量的玉米浸液浓缩液、甘蔗浆、糖蜜或甜菜浆来全部代替培养基。
将300毫升如实施例2所述的、经12～24小时生长的游动酵单胞菌和相当于0.64GPU/克淀粉的淀粉葡萄糖苷酶一起加入发酵罐中。起始PH值为5.0，通过添加2N碱(如80克/升NaoH)控制PH值在4.5。並且于35℃、150转/分钟的搅拌速度下进行培养。
15小时后出现最乙醇产量，得到的乙醇浓度为74克/升或9.36%(体积/体积)。
实施例3将540克麦芽素(maltrin)M-100溶于2升蒸馏水中並加热至92℃经10分钟。将9克酵母浸膏，9克胨，及磷酸二氢钾、水合硫酸镁、硫酸铵各6克溶解成700毫升。全部培养基可通过添加适当的玉米浸液之浓缩液(1%～5%(体积))加上淀粉水解物、甘蔗浆、汁或糖蜜、或甜菜浆或糖蜜来取代。
将2升麦芽素(maltrin)加700毫升营养液装入3升发酵罐中並将温度调至25～38℃，最好是30℃～35℃。加菌种之前，PH值应在4.5～6.5范围内，最好是5.0～5.5。
将300毫升、于含有5%～10%葡萄糖(重量/体积)、3克/升酵母浸膏、3克/升胨及各为2克/升的磷酸二氢钾、水合硫酸镁和硫酸铵的培养基中于30℃～37℃生长12～24小时的游动酵单胞菌菌种，和400毫克/升淀粉葡萄糖苷酶(12000U/克酶)一起加入到发酵罐(3升)中。
起始PH值调至4.5～6.5，最好为6.0。在发酵期间，通过添加2N碱(如80克/升NaoH)将PH值控制在4.5。于35℃，以60转/分钟的最小搅拌速率进行培养。22小时后出现最高乙醇产量，乙醇浓度为89.7克/升或11.4%(体积/体积)。发酵罐温度保持在28～40℃范围较好，最好为35℃。
实施例4实施例是重复的，其中将300毫克/升淀粉葡萄糖苷酶加入发酵罐並进行发酵18小时。
生成的乙醇浓度为88.6克/升或11.2%(体积/体积)。
实施例5使用20毫克/升淀粉葡萄糖苷酶以及43小时的发酵时间重复实施例4。生成的乙醇浓度为86.4克/升或11.0%(体积/体积)。
产得的乙醇作为汽油的一种组份或作为化学工业、例如生产乙烯的基础产物具有商业价值。其它副产品、二氧化碳可用于干冰或作为藻类生物生长的一种碳源。
因为在发酵过程中微生物能产生相当的热量，故此发酵处理就仅需少量能量供给。此外，发酵是在微需氧条件下进行的，这就避免了使用通气泵或加氮泵，发酵组份和产物仅需要小的机械搅拌和PH值调节。
当发酵完成时，可以将游动酵单胞菌细胞从发酵培养基中分离掉，乙醇可以被蒸馏出来。另一种方法是将一部分来自前批发酵处理的发酵培养基加入发酵罐中作为以后发酵的游动酵单胞菌细胞的种菌。
实验表明发酵工艺的成功不完全取决于基材的质量。
本发明不限于上述的特殊实施例，可对这些实施例进行各种改变和改善而並不超出所附
权利要求
1.一种在发酵罐中由淀粉物料生产乙醇的方法，其特征在于以下步骤(a)通过淀粉葡萄糖苷酶将淀粉物料糖化成葡萄糖，以及(b)在有发酵培养基存在的条件下利用微生物游动酵单胞菌将葡萄糖发酵成乙醇。
2.如权利要求
1的方法，其特征在于游动酵单胞菌是一种寄存在ATCC、寄存号为39676的菌株或ATCC39676的突变体或变种。
3.如权利要求
1的方法，其特征在于游动酵单胞菌是一种寄存在ATCC、寄存号为29191的菌株或ATCC29191的突变体或变种。
4.如权利要求
1的方法，其特征在于游动酵单胞菌是一种寄存在ATCC、寄存号为53431的菌株或ATCC53431的突变体或变种。
5.如权利要求
1的方法，其特征在于游动酵单胞菌是一种寄存在ATCC、寄存号为53432的菌株或ATCC53432的突变体或变种。
6.如权利要求
1～5中任一项的方法，其特征在于糖化和发酵工序是在同一发酵容器中，以单级发酵工艺的形式同时进行，调节或控制游动酵单胞菌细胞的量以使得糖化工序产得的葡萄糖即时发酵成乙醇。
7.如权利要求
1～6中任一项的方法，其特征在于发酵是在微需氧条件下进行。
8.如权利要求
1～7中任一项的方法，其特征在于淀粉水解物是由谷类、玉米、木薯或竹芋得到的。
9.如权利要求
8的方法，其特征在于谷类包括小麦、大麦、燕麦、黑麦或黑小麦。
10.如权利要求
8或9的方法，其特征在于淀粉以滤清或未滤清的溶液状态加入发酵罐。
11.如权利要求
1～10中任一项的方法，其特征在于淀粉的浓度范围为10%～30%(重量/体积)。
12.如权利要求
11的方法，其特征在于淀粉的浓度范围为15%～20%(重量/体积)。
13.如权利要求
1～12中任一项的方法，其特征在于发酵培养基包括任一种或多种下述组份淀粉葡萄糖苷酶(EC3、2、1、3)、胨(干酪素水解物)、酵母浸膏、磷酸二氢钾(或铵或钠)、硫酸铵、或氢氧化铵、或脲素和硫酸镁。
14.如权利要求
13的方法，其特征在于各种组份(淀粉葡萄糖苷酶除外)的浓度范围为0.01%～8.5%(重量/体积)。
15.如权利要求
14的方法，其特征在于各种组份(淀粉葡萄糖苷酶除外)的浓度范围为0.2%(重量/体积)。
16.如权利要求
13的方法，其特征在于淀粉葡萄糖苷酶的浓度范围为10～100毫克/升或0.32～1.0GPU/克淀粉。
17.如权利要求
13～16中任一项的方法，其特征在于用泛酸钙或β-丙氨酸代替酵母浸膏和胨。
18.如权利要求
1～17中任一项的方法，其特征在于发酵培养基的PH值保持在3.5～7.0。
19.如权利要求
18的方法，其特征在于PH值为4.5～5.0。
20.如权利要求
1～19中任一项的方法，其特征在于温度保持在34℃～40℃。
21.如权利要求
20的方法，其特征在于温度保持在35℃。
22.如权利要求
1～21中任一项的方法，其特征在于当发酵完成时，从发酵培养基中分离游动酵单胞菌细胞並蒸馏出乙醇。
23.如权利要求
1～21中任一项的方法，其特征在于将一部分来自前面发酵生产的发酵培养基加入发酵罐中，作为随后发酵用的游动酵单胞菌细胞菌种。
24.用权利要求
1～23中任一项方法从淀粉物料制取的乙醇。

一种预处理过的液化淀粉发酵成乙醇的方法，其中淀粉物料通过淀粉葡萄糖苷酶糖化成葡萄糖，而葡萄糖在单一发酵容器中通过微生物游动酵单胞菌发酵成乙醇。可改变淀粉葡萄糖苷酶与游动酵单胞菌细胞的比率使得糖化和发酵工序以相同速率进行。淀粉浓度范围为10％～30％(重量/体积)。