专利名称：层粘连蛋白332生成促进组合物的制作方法已知层粘连蛋白是由α肽链、β肽链和Y肽链组成的3条肽链蛋白质、并存在5种α肽链、3种β肽链和3种Y肽链的组合以及至少15种异构体。尤其层粘连蛋白332(α3β3γ2、以前的命名法中为层粘连蛋白5)大量存在于隔离表皮和真皮的基底膜中，被认为对皮肤的构造和功能起着重要的作用(非专利文献I)。层粘连蛋白332的基因敲除小鼠呈现出表皮和真皮分离，与形成水泡的人类遗传疾病的结合部大疱性表皮松解呈同样的症状，示出在表皮与真皮的固着中层粘连蛋白332发挥着至关重要的作用(非专利文献2)。再者，往在嵌入人成纤维细胞的胶原凝胶上培养角质化细胞的皮肤等价模型中添加层粘连蛋白332的精制样品，基底膜形成被增强(非专利文献3)。在表皮细胞中生成的活性蛋白质分解酶的血纤维蛋白溶酶切断层粘连蛋白332的α 3蛋白质亚基的氨基末端和羧基末端的肽，以及β 3蛋白质亚基的氨基末端的肽。切断断片中分别包括细胞基质黏附分子的识别部位和与7型胶原的结合部位。因此，被血纤维蛋白酶消化了的层粘连蛋白332 与角质细胞的固着能力减弱。还有，被血纤维蛋白酶消化了的层粘连蛋白332与7型胶原的亲和性减弱。因此，被认为由于紫外线照射及其他原因导致的皮肤老化与由于血纤维蛋白酶分解层粘连蛋白332，和其导致的基底膜的功能低下有关(非专利文献4)。因此，通过促进层粘连蛋白332的生成可产生抑制和/或改善由于紫外线照射及其他原因导致的皮肤老化的可能性。关于促进层粘连蛋白332生成的因子，近年报告过 HIFl (非专利文献5)和Smad4(非专利文献6)诱导α 3蛋白质亚基的基因的转录。但HIFl 是应对如缺氧和机械性刺激的环境刺激的转录调控因子，通过嗜炎症性细胞因子也被向上调控。Smad4是关于TGFP的信号传递的转录调控因子。这些因子由于全都是大分子量的蛋白质，其活性通过磷酸化等的修饰和与其他的蛋白质亚基的缔合状态所调节。因此，不可能将这些因子直接投与活性体内，使其送达至皮肤组织内的表皮细胞而用于促进层粘连蛋白332的生成。再者，由于上述的任意一个因子通过广泛的因子所调节，且为在能促进层粘连蛋白332的生成之外对于炎症反应等的生物体功能造成大影响的因子，因此不能在日常安全地使用。现有技术文献非专利文献非专利文献I Sugawara 等，Exp Dermatol. 17 (6), 473-80 (2008)非专利文献2 Aberdam 等，Nat. Genet. 6, 299, (1994)非专利文献3 Amano, S.，SOFff J.，134 10 (2008)非专利文献4 Amano, S. , J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 14 :2_7 (2009)
非专利文献5 :Fitsialos、G.等，J. Cell Sci. , 121 =2992(2008)
非专利文献6 :Zboralski，D.等，BMC Cancer, 8 :215 (2008)发明内容
发明要解决的问题
因此，需要开发可促进层粘连蛋白332的生成的组合物，该组合物可以日常使用、 稳定且安全。
用于解决问题的方案
本发明提供一种层粘连蛋白332生成促进组合物，其含有选自由D-丙氨酸和 D-羟脯氨酸及其衍生物和/或盐组成的组中的I种或2种以上的化合物。
本发明的层粘连蛋白332生成促进组合物根据情况为了抑制和/或改善皮肤状态而被使用。
在本发明的层粘连蛋白332生成促进组合物中，所述皮肤状态包括光老化、皱纹、 皮肤粗糙、细小皱纹及干燥，但并不限定于这些。
本发明的层粘连蛋白332生成促进组合物根据情况被用作药品。
本发明的层粘连蛋白332生成促进组合物根据情况被用作皮肤外用剂。
本发明的层粘连蛋白332生成促进组合物根据情况被用作食品。
本发明提供一种抑制和/或改善皮肤状态的方法，其方法包括投与层粘连蛋白 332生成促进组合物的步骤，该层粘连蛋白332生成促进组合物包括选自由D-丙氨酸和 D-羟脯氨酸及其衍生物和/或盐组成的组中的I种或2种以上的化合物。
通过本发明的方法所抑制和/或改善的皮肤状态包括光老化、皱纹、皮肤粗糙、细小皱纹及干燥，但并不限定于这些。
本发明的方法中，所述层粘连蛋白332生成促进组合物根据情况为药品。
本发明的方法中，所述层粘连蛋白332生成促进组合物根据情况为皮肤外用剂。
本发明的方法中，所述层粘连蛋白332生成促进组合物根据情况为食品组合物。
本说明书中，D-丙氨酸和D-羟脯氨酸的“盐”是指在不损害D-丙氨酸和D-羟脯氨酸的促进层粘连蛋白332生成的效果的条件下，包括金属盐、胺盐等在内的任意的盐。 前述金属盐可以包括碱金属盐、碱土金属盐等。前述胺盐可以包括三乙胺盐、苄胺盐等。
本说明书中，D-丙氨酸和D-羟脯氨酸的“衍生物”是指在不损害D-丙氨酸和 D-羟脯氨酸的促进层粘连蛋白332生成的效果的条件下，D-丙氨酸和D-羟脯氨酸分子在氨基、羧基、或侧链上与任意的原子团共价结合而成的化合物。所述任意原子团包括像 N-苯基乙酰基、4，4’_二甲氧基三苯甲基(DMT)等这样的保护基，像蛋白质、肽、糖、脂质、核酸等这样的生物高分子，像聚苯乙烯、聚乙烯、聚乙烯基化合物、聚酯等这样的合成高分子， 像酯基等这样的官能团，但不限定于这些。所述酯基可以包括例如甲酯、乙酯等脂肪族酯， 或芳香族酯。
氨基酸中存在作为光学异构体的L-体和D-体，天然的蛋白质为L-氨基酸以肽键键合而成的蛋白质，除了细菌的细胞壁等例外情况外仅L-氨基酸被利用，因此认为以人类为首的哺乳类中仅存在L-氨基酸并且仅利用L-氨基酸。(木野内忠稔等，蛋白质核酸酶， 50 :453-460 (2005) ,Lehninger 的新生物化学[上]第 2 版 ppl32_147 (1993)广川书店，哈珀 生物化学原文书22版pp21-30(1991)丸善)。因此，一直以来，学术上也好产业上也好，作为氨基酸主要仅使用L-氨基酸。
作为例外地使用D-氨基酸的例子，有用作使细菌中产生抗生物质的原料的情况； 以及为了节省从化学合成氨基酸时等量获得的L-氨基酸与D-氨基酸混合物中仅分离提取 L-氨基酸的成本，而直接以DL-氨基酸混合物的形式使用D-氨基酸的食品添加物的例子。 然而，从来没有在产业中仅使用D-氨基酸作为具有生理活性的物质的实例。
D-丝氨酸和D-天冬氨酸由于D-体的比例高，因此研究进展较快。D-丝氨酸局部存在于大脑、海马中，已清楚其为脑内的NMDA受体的调控因子。确认到D-天冬氨酸局部存在于精巢、松果体中，显示参与控制激素的分泌(日本特开2005-3558号公报)。但是在皮肤中的D-丙氨酸和D-羟脯氨酸的生理作用尚不明确。
如以下的实施例所示的那样，迄今未知D-丙氨酸和D-羟脯氨酸增大层粘连蛋白 332生成量 的效果。因此，本发明的包括D-丙氨酸和/或D-羟脯氨酸的层粘连蛋白332生成促进组合物为新颖发明。
近年来，有报道显示，使ddY小鼠两周内自由摄入IOmM的D-氨基酸水溶液， 然后测定各器官中的D-氨基酸浓度，结果松果体中，D-氨基酸浓度相对于I个作为分泌器官的松果体为3-lOOOpmol ;脑组织中，D氨基酸浓度相对于I克湿重量为 2-500nmol (Morikawa, A.等，Amino Acids, 32 :13-20 (2007))。基于此，算出以下说明的本发明的组合物中所含有的D-丙氨酸和D-羟脯氨酸的一日摄入量的下限。
如以下的实施例所示的那样，本发明的D-丙氨酸在O. I I μΜ的浓度范围下对培养的人表皮角质化细胞具有促进层粘连蛋白332生成的效果。因此，本发明的皮肤症状改善剂和皮肤外用剂及食品组合物中所含的D-丙氨酸的量只要满足该浓度范围的D-丙氨酸能够送达至生物体皮肤组织的成纤维细胞的条件，则可以为任意含量。本发明的组合物为外用剂时，在本发明的组合物的全量中的D-丙氨酸的含量为0.000015重量％到50重量％或者可配合的最大重量浓度范围即可。即所述组合物在为外用剂时的D-丙氨酸的含量，优选为O. 00003重量％ 30重量％、最优选为O. 0003重量％ 3重量％。本发明的组合物为口服剂时的D-丙氨酸的含量为O. 00001重量％ 100重量％的范围即可。本发明的组合物为口服剂时的D-丙氨酸的含量，优选为O. 00002重量％ 80重量％、最优选为 O. 0002重量％ 60重量％。再者，本发明的组合物中所含的D-丙氨酸的一日摄入量的下限只要每Ikg体重为O. Olng即可，优选为O. lng、更优选为lng。
如以下的实施例所示的那样，本发明的D-羟脯氨酸在O. I I μ M的浓度范围下对培养的人表皮角质化细胞具有促进层粘连蛋白332生成的效果。因此，本发明的皮肤症状改善剂和皮肤外用剂及食品组合物中所含的D-羟脯氨酸的量只要满足该浓度范围的 D-羟脯氨酸能够送达至生物体皮肤组织的成纤维细胞的条件，则可以为任意含量。本发明的组合物为外用剂时，在本发明的组合物的全量中D-羟脯氨酸的含量为O. 000015重量％ 到50重量％或者可配合的最大重量浓度范围即可。即所述组合物在为外用剂时的D-羟脯氨酸的含量，优选为O. 00003重量％ 30重量％、最优选为O. 0003重量％ 3重量％。 本发明的组合物为口服剂时的D-羟脯氨酸的含量为O. 00001重量％ 100重量％的范围即可。本发明的组合物为口服剂时的D-羟脯氨酸的含量，优选为O. 00002重量％ 80重量％、最优选为O. 0002重量％ 60重量％。再者，本发明的组合物中所含的D-羟脯氨酸的一日摄入量的下限只要每Ikg体重为O. Olng即可，优选为O. lng、更优选为lng。
本发明的组合物除了含有D-丙氨酸和D-羟脯氨酸及D-丙氨酸和D-羟脯氨酸的盐和/或能够在生物体内通过药物代谢酶等释放D-丙氨酸的衍生物之外，在不损害D-丙氨酸和D-羟脯氨酸的促进层粘连蛋白332生成的效果的条件下，还可含有I种或2种以上药学上允许的添加物。所述添加物包括稀释剂及膨胀剂、粘合剂及粘接剂、润滑剂、助流剂、 增塑剂、崩解剂、载体溶剂、缓冲剂、着色材料、香料、甜味剂、防腐剂及稳定化剂、吸附剂、本领域技术人员所知的其他药物添加剂，但不限于这些。
本发明的组合物还可以仅使用D-丙氨酸和D-羟脯氨酸、D-丙氨酸和D-羟脯氨酸的盐和/或能够在生物体内通过药物代谢酶等释放D-丙氨酸和D-羟脯氨酸的衍生物作为有效成分进行制备，但通常在不损害本发明的效果的范围内，可根据需要适当配合包括准药物在内的化妆品、药物等皮肤外用剂等中使用的其他成分。作为前述其他成分(任意配合成分)，例如可列举出油分、表面活性剂、粉末、着色材料、水、醇类、增稠剂、螯合剂、硅酮类、抗氧化齐 、紫外线吸收齐 、保湿齐 、香料、各种药效成分、防腐剂、pH调节剂、中和剂等。
本发明的为了抑制和/或改善皮肤状态而被使用的层粘连蛋白332生成促进组合物(以下称为“皮肤状态改善剂”)的剂型只要是以往的准药品组合物及医药组合物中所用者即可，包括例如软膏、乳霜、乳液、化妆水、面膜、凝胶剂、贴剂等外用剂及例如粉末，颗粒、 软胶囊、片剂等的口服剂和例如入鼻雾状液体等的入鼻剂及注射剂。
本发明的皮肤外用剂的剂型只要是以往的皮肤外用剂中所用者即可，包括例如软膏、乳霜、乳液、化妆水、面膜、凝胶剂、贴剂等。
本发明的食品组合物除了含有D-丙氨酸和D-羟脯氨酸、D-丙氨酸和D-羟脯氨酸的盐和/或能够在生物体内通过药物代谢酶等释放D-丙氨酸和D-羟脯氨酸的衍生物之外，在不损害D-丙氨酸和D-羟脯氨酸的促进层粘连蛋白332生成的效果的条件下，还可以含有调料、着色材料、保存料及其他等作为食品所允许的成分。
本发明的食品组合物只要是例如糖果、饼干、味噌、法式色拉调味汁、蛋黄酱、法式面包、酱油、酸奶、撒在饭上的粉状食品、调料 纳豆的佐料汁、纳豆、醪黑醋等使用于以往食品组合物中即可，但不限于前述例示。


图
图
图
图
图
图
图的坐标图。
图果的坐标图。
图9为显示D-丙氨酸对KC细胞的影响的坐标图。为显示D-丙氨酸对在KC细胞中的层粘连蛋白332生成效果的坐标图。 为显示D-丙氨酸对HaCaT细胞的影响的坐标图。为显示D-羟脯氨酸对HaCaT细胞的影响的坐标图。为显示D-丙氨酸对在HaCaT细胞中的层粘连蛋白332生成效果的坐标图。 为显示D-羟脯氨酸对在HaCaT细胞中的层粘连蛋白332生成效果的坐标图。 为显示各种浓度的D-丙氨酸对在HaCaT细胞中的层粘连蛋白332生成效果8为显示各种浓度的D-羟脯氨酸对在HaCaT细胞中的层粘连蛋白332生成效为显示各种浓度的D-天冬氨酸对在HaCaT细胞中的层粘连蛋白332生成效果的坐标图。
图10为显示各种浓度的D-天冬酰胺对在HaCaT细胞中的层粘连蛋白332生成效果的坐标图。
图11为显示各种浓度的D-脯氨酸对在HaCaT细胞中的层粘连蛋白332生成效果的坐标图。
图12为显示各种浓度的D-丝氨酸对在HaCaT细胞中的层粘连蛋白332生成效果的坐标图。

以下说明的本发明的实施例仅以例示为目的，不会限定本发明的保护范围。本发明的保护范围仅受权利要求书的记载所限定。
在本说明书中所言及的所有的文献通过其整体引用被纳入本说明书。
实施例I
I.通过添加丙氨酸和羟脯氨酸促进层粘连蛋白332的生成
1-1.材料和方法
(I)细胞
细胞使用来自人表皮的细胞的HaCaT细胞(H. Hans等，Experimental Cell Research 239 =399(1998))和来自人角质化细胞的KC细胞(三光纯药股份有限公司，制造商LONZAWalkersville Inc.)。所述细胞按照每个孔4X IO4个的方式接种于24孔细胞培养板，使用于细胞培养用培养基(D-MEM(lg/L葡萄糖)和光纯药)中添加了 O. 1% BSA的培养基(以下称为“普通培养基”。)，在37°C、5% CO2及饱和水蒸气条件下培养24小时。
(2)添加丙氨酸和羟脯氨酸
之后，所述细胞被转移到在所述普通培养基中添加了 I μΜ的L-或D-丙氨酸的培养基、各添加了 O. 5 μ M的L-和D-丙氨酸的培养基、添加了 I μ M的L-或D-羟脯氨酸的培养基及各添加了 O. 5 μ M的L-和D-羟脯氨酸的培养基中培养24小时。将不添加丙氨酸和羟脯氨酸的所述普通培养基作为阴性对照。本实施例中被使用的D-羟脯氨酸为顺式-4-D-羟脯氨酸。
(3)层粘连蛋白332生成量的定量
于培养结束后收回培养基，用3000rpm离心分离5分钟,依照ELISA方法(Amano,S.等，J. Immunol.Methods,224 :161(1999))测定上清的层粘连蛋白332的浓度。所述 ELISA方法按照使用相对层粘连蛋白5的α 3肽链为单克隆抗体的ΒΜ165和相对层粘连蛋白5的β 3肽链为单克隆抗体的6F12的生物素共轭物的双抗体夹心ELISA法，通过辣根过氧化物酶标记亲和素D (Vector Labs公司，商品说明书号码A-2004)被检出。使用PBS作为对照。
(4)活细胞数的定量
培养基收回后，用PBS洗净细胞，按照最终浓度达到10 %的方式添加 alamarBlue (商标、Biosource、Biosource -International)。2 小时后，按照 Ahmed S. A.等、 (J. Immunol. Method. 170，211-224 (1994))、及制造商的说明书以激发波长544nm、荧光波长 590nm测定alamarBlue液体的突光强度。
1-2.结果
(I)KC活细胞数的定量
图I示出了调查添加丙氨酸对KC细胞的增殖的影响的实验结果。各实验条件的误差柱表示在同一条件下重复3次的实验结果的测定值的标准偏差。
在KC细胞中，阴性对照的alamarBlue (商标)的荧光强度的相对值(以下相同) 为50。在添加了 I μ M的L-丙氨酸的培养基和添加了 I μ M的D-丙氨酸的培养基及各添加了 O. 5 μ M的L-和D-丙氨酸的培养基中所培养的KC细胞的荧光强度分别为40、45及50。在 KC细胞中，与阴性对照相比较在添加了丙氨酸的培养基中所培养的细胞的alamarBlue (商标)的突光强度在Tukey-Kramer检验中差异不显著。因此,示出了 L-和D-丙氨酸对KC 细胞无细胞毒性。
(2) KC细胞的层粘连蛋白332的生成
图2示出了调查添加丙氨酸对在KC细胞中层粘连蛋白332生成的影响的实验结果。图2的坐标图的纵轴显示为用比例于各孔的细胞数的alamarBlue (商标)的荧光强度除比例于各孔的培养上清中的层粘连蛋白332浓度的ELISA测定的吸光度所得的商(以下称为“单位细胞数的层粘连蛋白332浓度的相对值”)。各实验条件的误差柱表示在同一条件下重复3次的实验结果的测定值的标准偏差。另外，Tukey-Kramer检验中，星号(**)表示P不足I%。
单位细胞数的层粘连蛋白332浓度的相对值，阴性对照为O. 35。在添加了 I μ M的 L-丙氨酸的培养基和添加了 I μ M的D-丙氨酸的培养基及各添加了 O. 5 μ M的L-和D-丙氨酸的培养基中培养的KC细胞的单位细胞数的层粘连蛋白332浓度的相对值分别为O. 40、 O. 50及O. 45。添加了 I μ M的D-丙氨酸和阴性对照之间比较在Tukey-Kramer检验中ρ不足1%，为差异显著。因此，证明通过添加D-丙氨酸可促进于KC细胞中层粘连蛋白332的生成。
(3) HaCaT活细胞数的定量
图3和图4示出了调查添加丙氨酸和羟脯氨酸对HaCaT细胞的增殖的影响的实验结果。以下，D-羟脯氨酸(D-Hyp)是指为顺式-4-D-羟脯氨酸。各实验条件的误差柱表示在同一条件下重复3次的实验结果的测定值的标准偏差。
在HaCaT细胞中，阴性对照的alamarBlue (商标)的荧光强度为300。在添加I μ M 的L-丙氨酸的培养基和添加I μ M的D-丙氨酸的培养基及各添加O. 5 μ M的L-和D-丙氨酸的培养基中所培养的HaCaT细胞的荧光强度全部为250 (图3)。在添加I μ M的L-羟脯氨酸的培养基和添加I μ M的D-羟脯氨酸的培养基及各添加了 O. 5 μ M的L-和D-羟脯氨酸的培养基中所培养的HaCaT细胞的荧光强度全部为280 (图4)。在HaCaT细胞中，与阴性对照相比较在添加了丙氨酸和D-羟脯氨酸的培养基中培养的细胞的alamarBlue (商标)的突光强度在Tukey-Kramer检验中也是差异不显著。因此，不出了 L-和D-丙氛酸及L-和 D-羟脯氨酸对HaCaT细胞也无细胞毒性。
(4)通过添加丙氨酸的HaCaT细胞的层粘连蛋白332的生成
图5示出了调查添加丙氨酸对在HaCaT细胞中层粘连蛋白332生成的影响的实验结果。图5的坐标图的纵轴显示为各孔的培养上清中的单位细胞数的层粘连蛋白332浓度的相对值。各实验条件的误差柱表示在同一条件下重复3次的实验结果的测定值的标准偏差。另外，Scheffe’ s F-检验中，星号(**)表示ρ不足1%。星号(*)表示ρ不足5%。
单位细胞数的层粘连蛋白332浓度的相对值，阴性对照为O. 04。在添加了 I μ M的 L-丙氨酸的培养基和添加了 I μ M的D-丙氨酸的培养基及各添加了 O. 5 μ M的L-和D-丙氨酸的培养基中所培养的HaCaT细胞的单位细胞数的层粘连蛋白332浓度的相对值分别为 O. 07,0. 11及O. 10。添加I μ M的D-丙氨酸与阴性对照之间在Scheffe’ s F-检验中ρ不足I %,各混合添加O. 5 μ M的D-和L-丙氨酸与阴性对照之间在Scheffe’ s F-检验中ρ 不足5%，I μ M的D-丙氨酸与I μ M的L-丙氨酸之间在Scheffe’ s F-检验中ρ不足5%， 全部为差异显著。因此，证明和KC细胞同样，在HaCaT细胞中，通过添加D-丙氨酸也可促进层粘连蛋白332的生成。
(5)通过添加羟脯氨酸的HaCaT细胞的层粘连蛋白332的生成
图6示出了调查添加羟脯氨酸对在HaCaT细胞中层粘连蛋白332生成的影响的实验结果。图6的坐标图的纵轴显示为各孔的培养上清中的单位细胞数的层粘连蛋白332浓度的相对值。各实验条件的误差柱表示在同一条件下重复3次的实验结果的测定值的标准偏差。
单位细胞数的层粘连蛋白332浓度的相对值，阴性对照为O. 04。在添加I μ M的 L-羟脯氨酸的培养基和添加I μ M的D-羟脯氨酸的培养基及各添加O. 5 μ M的L-和D-羟脯氨酸的培养基中所培养的HaCaT细胞的单位细胞数的层粘连蛋白332浓度的相对值分别为 O. 05,0. 065 及 O. 06。
实施例2
2.通过添加各种氨基酸的层粘连蛋白332生成量的比较
2-1.材料和方法
细胞使用HaCaT细胞，和实施例I同样培养。然后，所述细胞被转移到在所述普通培养基中各添加了 10ηΜ、100ηΜ和IOOOnM的L-或D-丙氨酸、L-或D-羟脯氨酸、L-或 D-天冬氨酸、L-或D-天冬酰胺、L-或D-脯氨酸、L-或D-丝氨酸的氨基酸的培养基中培养24小时。使用不添加所述氨基酸的所述普通培养基作为阴性对照。本实施例中被使用的D-羟脯氨酸为顺式-4-D-羟脯氨酸。层粘连蛋白332生成量和实施例I同样进行测定。 另外，在以下的实验中，所有的浓度中都未发现添加氨基酸所导致的细胞毒性，因此可在各个实验条件下比较细胞的层粘连蛋白332的生成量。
2-2.结果
(I)添加丙氨酸
图7示出了调查添加各种浓度的丙氨酸对在HaCaT细胞中生成层粘连蛋白332效果的实验结果。图7的坐标图的纵轴显示为各孔的培养上清中的层粘连蛋白332浓度(ng/ mL)。各实验条件的误差柱表示在同一条件下重复4次的实验结果的测定值的标准偏差。
阴性对照中层粘连蛋白332的浓度为I. 7ng/mL。在添加10nM、100nM和IOOOnM的 L-丙氨酸的培养基及D-丙氨酸的培养基中所培养的HaCaT细胞的层粘连蛋白332浓度分别为 I. 7ng/mL 和 I. 7ng/mL, 2. 3ng/mL 和 3. 4ng/mL,及 2. 8ng/mL 和 4. 8ng/mL。从以上结果示出了 D-丙氨酸在lOOng/mL以上的浓度中促进层粘连蛋白332的生成。
(2)添加羟脯氨酸
图8示出了调查添加各种浓度的羟脯氨酸对在HaCaT细胞中生成层粘连蛋白332效果的实验结果。图8的坐标图的纵轴显示为各孔的培养上清中的层粘连蛋白332浓度 (ng/mL)。各实验条件的误差柱表示在同一条件下重复4次的实验结果的测定值的标准偏差。
阴性对照中层粘连蛋白332的浓度为I. 5ng/mL。在添加10nM、100nM和IOOOnM的 L-羟脯氨酸的培养基及D-羟脯氨酸的培养基中所培养的HaCaT细胞的层粘连蛋白332浓度分别为 I. 5ng/mL 和 I. 5ng/mL, 2. 3ng/mL 和 3. 3ng/mL,及 2. 7ng/mL 和 4. 4ng/mL。从以上结果示出了 D-羟脯氨酸在100ng/mL以上的浓度中促进层粘连蛋白332的生成。
(3)添加天冬氨酸
图9示出了调查添加各种浓度的天冬氨酸对在HaCaT细胞中生成层粘连蛋白332 效果的实验结果。图9的坐标图的纵轴显示为各孔的培养上清中的层粘连蛋白332浓度 (ng/mL)。各实验条件的误差柱表示在同一条件下重复4次的实验结果的测定值的标准偏差。
阴性对照中层粘连蛋白332的浓度为I. 7ng/mL。在添加10nM、100nM和IOOOnM的 L-天冬氨酸的培养基及D-天冬氨酸的培养基中所培养的HaCaT细胞的层粘连蛋白332浓度分别为 I. 8ng/mL 和 I. 9ng/mL, I. 8ng/mL 和 I. 9ng/mL,及 2. Ong/mL 和 I. 7ng/mL。从以上结果示出了 L-和D-天冬氨酸不促进层粘连蛋白332的生成。
(4)添加天冬酰胺
图10示出了调查添加各种浓度的天冬酰胺对在HaCaT细胞中生成层粘连蛋白332 效果的实验结果。图10的坐标图的纵轴显示为各孔的培养上清中的层粘连蛋白332浓度 (ng/mL)。各实验条件的误差柱表示在同一条件下重复4次的实验结果的测定值的标准偏差。
阴性对照中层粘连蛋白332的浓度为I. 5ng/mL。在添加10nM、100nM和IOOOnM的 L-天冬酰胺的培养基及D-天冬酰胺的培养基中所培养的HaCaT细胞的层粘连蛋白332浓度分别为 I. 6ng/mL 和 I. 5ng/mL, I. 5ng/mL 和 I. 5ng/mL,及 I. 6ng/mL 和 I. 5ng/mL。从以上结果示出了 L-和D-天冬酰胺不促进层粘连蛋白332的生成。
(5)添加脯氨酸
图11示出了调查添加各种浓度的脯氨酸对在HaCaT细胞中生成层粘连蛋白332 效果的实验结果。图11的坐标图的纵轴显示为各孔的培养上清中的层粘连蛋白332浓度 (ng/mL)。各实验条件的误差柱表示在同一条件下重复4次的实验结果的测定值的标准偏差。
阴性对照中层粘连蛋白332的浓度为I. 8ng/mL。在添加10nM、100nM和IOOOnM的 L-脯氨酸的培养基及D-脯氨酸的培养基中所培养的HaCaT细胞的层粘连蛋白332浓度分别为 I. 8ng/mL 和 2. Ong/mL, I. 9ng/mL 和 I. 9ng/mL,及 I. 9ng/mL 和 I. 9ng/mL。从以上结果示出了 L-和D-脯氨酸不促进层粘连蛋白332的生成。
(6)添加丝氨酸
图12示出了调查添加各种浓度的丝氨酸对在HaCaT细胞中生成层粘连蛋白332 效果的实验结果。图12的坐标图的纵轴显示为各孔的培养上清中的层粘连蛋白332浓度 (ng/mL)。各实验条件的误差柱表示在同一条件下重复4次的实验结果的测定值的标准偏差。10
阴性对照中层粘连蛋白332的浓度为I. 7ng/mL。在添加10nM、100nM和IOOOnM的 L-丝氨酸的培养基及D-丝氨酸的培养基中所培养的HaCaT细胞的层粘连蛋白332浓度分别为 I. 8ng/mL 和 I. 8ng/mL, I. 9ng/mL 和 I. 8ng/mL,及 I. 9ng/mL 和 I. 8ng/mL。从以上结果示出了 L-和D-丝氨酸不促进层粘连蛋白332的生成。
结论
从实施例I和2的实验结果，确认D-丙氨酸和D-羟脯氨酸具有层粘连蛋白332 生成的促进效果，天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸和丝氨酸不具有层粘连蛋白332生成的促进效果。因此，启示了 D-丙氨酸和D-羟脯氨酸通过促进对基底膜的构造和功能具有重要作用的层粘连蛋白332的生成，可抑制和/或改善皮肤状态。
实施例3
以下示出基于本发明的含有D-丙氨酸和/或D-羟脯氨酸的乳液制剂、贴剂、片剂、软胶囊、颗粒、饮料、糖果、饼干、味噌、法式色拉调味汁、蛋黄酱、法式面包、酱油、酸奶、 撒在饭上的粉状食品、调料·纳豆的佐料汁、纳豆、醪黑醋、乳霜、身体用乳霜、凝胶剂、剥离型面膜、浸渗型面膜、乳液、化妆水及气雾剂的的配合例。这些配合例以例示为目的而被列举，并不意图限定本发明的保护范围。
配合例I (乳液制剂)(组合物)D-丙氨酸或D-羟脯氨酸山嵛醇鲸蜡醇甘油单脂肪酸酯氢化蓖麻油POE(60)白色凡士林液体石蜡肉豆蔻酸异丙醋曱基聚硅氧烷(6cs)
浓甘油二丙二醇羧基乙烯基聚合物透明质酸钠氢氧化钾乳酸乙二胺四乙酸钠尼泊金乙酯纯化水配合量(重量％) 0.42 0.2 0.5 1.8 1.0 2.0 10.03.0 1.513.02.0 0.25 0.005 适量适量适量适量余量
配合例2 (贴剂)
(组合物)100.000配合量(重量％


开发一种具有促进层粘连蛋白332生成作用的新颖组合物，该组合物可日常使用，稳定且安全。本发明提供一种层粘连蛋白332生成促进组合物，其含有由D-丙氨酸和D-羟脯氨酸及其衍生物和/或盐组成的组中的1种或2种以上的化合物。所述组合物根据情况为了抑制和/或改善皮肤状态而被使用。所述皮肤状态包括光老化、皱纹、皮肤粗糙、细小皱纹和干燥，但并不限定于这些。所述组合物根据情况被用作皮肤外用剂或食品。