密码子优化的Cry2Aa基因与重组载体以及改变作物抗性的方法【技术领域】，具体地，涉及一种密码子优化的Cry2Aa基因、一种重组载体和一种改变作物抗性的方法。[0002]苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是自然界中普遍存在的一类细菌，Bt菌及Bt毒蛋白作为生物杀虫剂，在农业上有70多年的安全使用的历史。1981年，Schnepft和Whiteley首次成功地克隆了第一个编码Bt杀虫蛋白基因，迄今为止，已先后分离并克隆了 600多个杀虫蛋白基因,如:CrylA, Cry2A, CrylF等(Chickmore, 2011)。自1987年以来，Bt基因或改造后的Bt基因已被成功地导入烟草、玉米、棉花和水稻等多种植物，获得了一大批具有良好抗虫性的转基因植物品种和种质资源，产生了显著的社会效益和经济效益。目前Bt基因已成为植物基因工程及转基因育种中应用最广泛、最具有应用前景的抗虫基因。[0003]虽然先后获得了转基因烟草(Vaeck et al, 1987;Adang et al, 1987;Bartonet al, 1987)、番爺(Fischhoff et al, 1987)、棉花(Perlak et al, 1990),但是杀虫蛋白(Insecticidal Crystal Protein, ICP)在植物中表达水平普遍低,抗虫效果也差。如美国Agra-cetus 公司的 Barton 等(1985)和 Agrigenefic 公司的 Adang( 1985)分别将 3’端缺失的CrylAa和CrylAc转入烟草得到了抗虫转基因植株。但上述转基因植物的抗虫性都很弱，难以检测出mRNA的转录，杀虫蛋白的表达量很低，以重量计,仅占可溶性蛋白的0.001%。
[0004]本发明的目的是提供克服杀虫蛋白在植物中表达水平普遍低、抗虫效果也差的缺陷，提供一种在植物中表达水平高、抗虫效果好的杀虫蛋白。[0005]为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种Cry2Aa#基因，其为密码子优化的Cry2Aa基因，其特征在于，该因具有SEQ ID No:1所示的序列，且该Cry2Aa#基因能够编码对鳞翅目昆虫具有致死活性的多肽。[0006]另一方面，本发明还提供了一种重组载体，其特征在于，该重组载体插入有如上所述的Cry2Aa#基因，并能使所插入的Cry2Aa#基因得到表达。
[0007]另一方面，本发明还提供了一种改变作物抗性的方法，其特征在于，该方法包括将如上所述的重组载体转化进所述作物中，使所述重组载体中插入的基因在在所述作物中表达。
[0008]通过上述技术方案，杀虫蛋白的表达量能够达到18.88 μ g/g叶片鲜重,可以为水稻提供对稻纵卷叶螟等水稻害虫的高抗性。
[0009]本发明的其他特征和优点将在随后的


[0011]图1:植物表达载体p3300-Cry2Aa#的构建流程；
[0012]图2:a.转基因水稻中Cry2Aa#基因PCR扩增产物的凝胶电泳图。
[0013]b.转基因水稻中Bar基因PCR扩增产物的凝胶电泳图；
[0014]图3:转基因植株B2A4008S的Southern杂交印迹图；
[0015]图4:转基因植株B2A4008S中的Cry2Aa#基因的RT-PCR检测结果；
[0016]图5:转基因B2A4008S的叶片中Cry2Aa蛋白浓度的检测结果；
[0017]图6:转基因植株B2A4008S对稻纵卷叶螟抗性的生物测定结果；
[0018]图7:转基因植株B2A4008S (T1代)的草铵膦抗性检测结果。
[0019]图8 =T2代转基因植株B2A4008S的草铵膦抗性检测结果。
【具体实施方式】
[0020]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0021]本发明提供了一种Cry2Aa#基因，其为密码子优化的Cry2Aa基因，其特征在于，该&5^^#基因具有SEQ ID No:1所示的序列，且该Cry2Aa#基因能够编码对鳞翅目等昆虫具有致死活性的多肽。
[0022]本发明的密码子优化的Cry2Aa基因，其命名为Cry2Aa#基因，相比原始Cry2Aa基因，进行了密码子优化，基本替换掉了存在的水稻稀有密码子，以使其密码子相对使用度与水稻保持一致，同时也大大降低了密码子ACG、TCG、GCG、CCG所占的比例，减少了可能发生甲基化的位点。密码子优化的Cry2Aa基因(即本发明的Cry2Aa#基因)与原始Cry2Aa基因的比较如表1所示，与原始Cry2Aa基因的DNA序列相比，其氨基酸组成不变，改变碱基492个，占碱基总数的25.91%，更改密码子428个，占整个密码子的67.61% ；G+C含量由原始序列的34.81%改变为57.47% ;并且消除了潜在的Poly (A)加尾信号位点、内含子剪切信号位点。而原始序列中存在9个潜在的Poly(A)加尾信号位点及4个内含子剪切信号位点，他们可能会造成转录本的不正常剪切，从而导致成熟mRNA的不完整性。
[0023]根据本发明的Cry2Aa#基因，其中，该Cry2Aa#基因的5’端还含有SEQ ID No:3所不的序列，且该Cry2Aa#基因的3’端还含有SEQ ID No:4所不的序列，且该Cry2Aa#基因能够编码N端具有PRla信号肽序列、C端具有KDEL内质网滞留信号序列并对鳞翅目等昆虫具有致死活性的多肽。
[0024]优选情况下，本发明的Cry2Aa#基因具有如SEQ ID No: 2所示的序列，SEQ ID No:2所示的序列是在以上密码子优化的Cry2Aa#基因序列(SEQ ID No:1)的5’端添加如SEQID No:3所示的序列，3’端添加如SEQ ID No:4所示的序列得到的。SEQ ID No:3为PRla信号肽序列，SEQ ID No:4为内质网滞留信号KDEL序列。SEQ ID No:2所示的序列中的信号肽和定位信号肽可以使表达后的Cry2Aa蛋白(SEQ ID No:5)靶向性的运输到细胞的内质网等质体内并积累。
[0025]根据本发明的Cry2Aa#基因，其中，该Cry2Aa#基因的3’端还具有转录终止子序列，所述转录终止子序列包括SEQ ID No:10所示的序列并能够终止转录。
[0026]根据本发明的Cry2Aa#基因，其中，该Cry2Aa#基因的5’端还具有启动子序列和增强子序列；所述启动子序列包括SEQ ID No:8所示的序列，且能够启动072八3#基因的转录；所述增强子序列包括SEQ ID No:9所示的序列，且能够增强Cry2Aa#基因的转录。
[0027]优选情况下，在上述组合序列(SEQ ID No:2)的5’端分别添加Kozak特征序列及限制性内切酶SmaI识别位点序列(cccggg)、3’端添加SacI识别位点序列(gagctc),最终形成如SEQ ID No:6所示的DNA序列。SEQ ID No:6所示的DNA序列的5’端添加启动子和表达增强子、3’端添加终止子，从而构建基因表达框。优选地，该植物表达框如SEQ ID No:7所示DNA序列，它5’端具有如SEQ ID No:8 (即Ubi启动子)和SEQ ID No:9 (即Ω增强子序列)所示的序列作为表达Cry2Aa#基因的启动子和增强子，3’端具有如SEQ ID No:10所示的序列作为表达Cry2Aa#基因的转录终止子。
[0028]根据本发明的Cry2Aa#基因，其中，该072么&#基因具有SEQ ID No:2所示的序列，且该Cry2Aa#基因能够编码对鳞翅目等昆虫具有致死活性的多肽；优选地，该Cry2Aa#基因具有SEQ ID No:6所示的序列，且该&5^^#基因能够编码对鳞翅目等昆虫具有致死活性的多肽。
[0029]本发明还提供了一 种重组载体，其特征在于，该重组载体插入有如上所述的Cry2Aa#基因，该重组载体能使所插入的Cry2Aa#基因得到表达。
[0030]本发明中，所述重组载体由上述基因序列和载体组成，所述载体可以为T载体、原核表达载体和真核表达载体中的至少一种，其中，T载体和原核表达载体的主要作用是初步验证功能基因和目标蛋白的功能，而真核表达载体的作用是为了后续将其转化进作物中，因此，能够满足上述应用的各种T载体(PMD18-T、PMD19-T等)、原核表达载体(pET32a等)和真核表达载体(pCAMBIA3300、pCAMBIA3301等)均可用于本发明。
[0031]根据本发明的重组载体，其中，该重组载体还插入有Bar基因，并且能使Bar基因得到表达；所述Bar基因具有SEQ ID No:12所示的序列且所述Bar基因能够编码具有抗草铵膦活性的多肽。优选地，所述重组载体由上述Cry2Aa#基因序列和真核表达载体(pCAMBIA3300、pCAMBIA3301 等)组成。
[0032]根据本发明的重组载体，其中，所述Bar基因的5’端还具有启动子序列，所述Bar基因的3’端还具有终止子序列；所述启动子序列包括SEQ ID No:11所示的序列，且能够启动Bar基因的转录；所述终止子序列包括SEQ ID No:13所示的序列，且能够终止Bar基因的转录。优选地，筛选标记基因的表达框依次由CaMV35S启动子(SEQ ID No:11)、筛选标记基因 Bar 基因(SEQ ID No:12)以及 CaMV35S polyA 终止子(SEQ ID No:13)组成。
[0033]本发明还提供了一种改变作物抗性的方法，其特征在于，该方法包括将如上所述的重组载体转化进所述作物中，使所述重组载体中插入的基因在所述作物中表达。
[0034]根据本发明，术语“作物”为本领域公知的概念，指大面积栽种或大面积收获，供盈利或口粮用的植物。本发明的基因不仅可用于转入水稻，也可以用于转入玉米、高粱、小麦、棉花、油菜、大豆、土豆、蔬菜等。优选地，所述作物为水稻，所述水稻包括各种水稻，如各亚种(籼稻、粳稻、爪哇稻)、各生态型(早稻、中稻、晚稻)水稻等。为了将该基因应用于两系法杂交水稻的育种，本发明中，所述水稻为光温敏核不育系水稻，具体地，可为光温敏核不育系水稻 7001S、农垦 58S、P88S、4008S、Y58S、培矮 64S、N5088S、香 125S、测 64S、广占 63S、GD-2S等。优选地，本发明中选光温敏核不育系水稻4008S作为转化的受体作物。
[0035]实现转基因的方法有本领域公知的农杆菌介导转化法、基因枪法和花粉管通道法等。优选地，本发明所用的转化方法为农杆菌介导转化法。所述农杆菌介导转化法可以为传统的常规法，如(Yukoh Hiei, et al.Transformation of rice mediatedby Agrobacterium tumefaciens.Plant Molecular Biology,1997, 35, 205-218)中报道的方法，也可米用(Seiichi Toki, et al.Early infection of scutellum tissuewith Agrobacterium allows high-speed transformation of rice.The PlantJournal, 2006, 47，969-976.)中报道的快速转化方法。本发明的发明人对现有技术的快速农杆菌转化法进行了改进，具体地，Seiichi Toki等人进行农杆菌转化时，愈伤组织诱导后不进行继代而直接浸染，而本发明的发明人发现，根据所用的愈伤组织的状态，诱导产生的愈伤组织继代第3天达到最佳状态时再进行浸染能够得到更高的侵染效率。即，优选地，所述农杆菌转化法包括，用上述的重组载体的农杆菌菌液与作物的愈伤组织共培养，并对共培养后的愈伤组织进行筛选、预分化和分化，其中，所述愈伤组织为诱导后继代的愈伤组织。
[0036]此外，本发明的发明人发现，农杆菌转化法中，在共培养和预分化愈伤组织时，所用固体培养基中的琼脂粉含量为10_15g/L，优选为12g/L能够使愈伤组织的状态良好，分化效率提高。
[0037]以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
[0038]其中，DNA序列SEQ ID No:6委托大连宝生物公司合成并连接在pMD19T载体上；各种PCR引物的合成和基因测序工作委托华大基因公司进行；各种酶均购自大连宝生物公司；pMD19T载体购自大连宝生物公司；pCAMIA3300载体提供自澳大利亚农业分子生物学应用中心(CAMBIA, http://www.cambia.0rg);质粒的提取、纯化和酶切以及其他常规分子生物学操作参考《分子克隆》(科学出版社，第三版)进行。
[0039]实施例1
[0040]本实施例用于说明本发明的Cry2Aa#基因的密码子优化方法
[0041]Cry2Aa 原始基因序列来自 NCBI (http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/)，其查询号为AY496458。选择水稻品种日本晴基因组数据库作为分析对象，网址为http://rgp.dna.affrc.g0.jp/giot/INE.html。首先筛选蛋白表达量较高、功能注释详细的基因的编码序列作为分析对象，运用 Codonff (http: //mobyle.pasteur.fr/cg1-bin/portal.py?form=codonw)及 SeqnConverter (http://www.cibj.com/seqnconverter.zip)分析软件，对筛选得到的101条完整的蛋白编码序列进行密码子使用频率分析，结果见表1。
[0042]在保持Cry2Aa蛋白氨基酸顺序不变的前提下，把其中RSCU值(即同义密码子相对使用度，指某一密码子所使用的频率与其在无偏性使用时预期频率之间的比值)小于0.5的密码子替换成水稻偏爱的密码子，即在同义密码子组中RSCU值最大的水稻密码子；RSCU值在0.5-1之间的密码子只是部分替换成水稻偏爱的`密码子；而RSCU值在I以上的密码子不作改变。同义密码子替换过程中，降低密码子ACG、TCG、GCG、CCG所占的比例，以减少可能发生甲基化的位点。
[0043]Cry2Aa基因经过水稻偏爱密码子替换后，已不存在造成植物转录不稳定的AT富集区及PolyA加尾识别信号序列。但仍然存在4处内含子切割识别信号位点，继续通过同义密码子替换法消除内含子切割识别信号位点。
[0044]表1人工优化合成的Cir2Aa基因、原始的Cir2Aa基因与水稻编码蛋白基因的密码子相对使用度(RS⑶)比较
[0045]
"TT3 ^^RSCU C密码子相对使MJ度)
氨基酸密码f_|_^_

水稻蛋ft编码基因imm Cfy2Aa mm优化的0>,2如基W
Ala GCT0,45(335}1.20(9)0,77(6)
GCC1.70(1262)0.93(7)2.19(17)
GCA0.32(239)1.07(8)0,13(1)
GCG1,53(1137)0.80(6)0,90(7)
Cys TGT0.37(77)1.50(3)0.00(0)
TGC1.63(339)0.50(1)2.00(5)
Asp GAT0.51(355)2.00(24)0.56(7)
GAC1,49(1034)0.00(0)1.44(18)
Glu GAA0.43(310)1.58(15)0.20(2)
GAG1,57(1127)0.42(4)1.80(18)
Phe TTT0.31(120)1.70(28)0.16(3)
TTC1.69(660}0.30(5)1.84(34)
[0046]