灵芝酸作为p53-MDM2相互作用抑制剂的用途[0001] 随着生活方式、环境条件及人口老龄化等影响肿瘤发生发展因素的改变，自20世纪70年代以来，我国肿瘤发生率呈明显上升趋势，现已成为城、乡居民的首要死因。肿瘤的共同特性是由于正常细胞凋亡系统的缺陷导致细胞凋亡失调，具有无限增生的能力(Carcinogenesis，21:485，2000)。因此，直接抑制癌细胞中的细胞凋亡方面起着中心作用的靶向负调节剂代表了新抗癌药物设计的一种很有前景的治疗策略。[0003]灵芝(Ganoderma Iucidum)是一种传统的药用真菌，《中华人民共和国药典》收录了灵芝作为法定中药材，2001年灵芝被列入《可用于保健食品的真菌菌种名单》。灵芝具有抗肿瘤、免疫调节等作用。三萜类化合物是灵芝类的主要化学成分之一，自1982年T Kubota(Helv.Chim.Acta, 65(2)，611-619，1982)等人首次分离得到该类化合物以后，迄今为止已分离得到 140 多种同类化合物。自 Toth O (Tetrahedron Letter, 24: 1081-1084,1983)等报道灵芝三萜类化合物的抗癌活性以来，多种灵芝酸被证实具有抑制肿瘤增殖和转移功倉泛。 [0004]有关灵芝抗肿瘤的专利和文献，主要是灵芝子实体或孢子粉和其他药物配伍及灵芝酸单体，用于抑制癌症的体内体外实验研究:专利CN1483423报道了一种治疗恶性肿瘤的中药制剂及其制备方法，该中药制剂是以半枝莲、灵芝、鸡血藤、生地、枸杞子等为主要原料，对各种肿瘤皆有很好的疗效。专利CN 1480208报道了一种用于放化疗减毒增效的药物组合物及其制备方法，这种药物由黄芪、枸杞、灵芝按重量配比制成。专利CN 1421227报道了包含灵芝的用于治疗与预防辐射线损伤的药物。专利CN 1286119报道了一种灵芝保健品及其制备方法，灵芝酸纯度为15%，对肿瘤的抑制率达30%上。CN 1709264公开了灵芝酸T和灵芝酸Me在肿瘤生长或增殖抑制剂中的应用。文献报道:灵芝酸T体外诱导肿瘤细胞凋亡的途径是依赖于线粒体的内源性凋亡途径(Life sciences, (80): 205-211，2006)。[0005]近年来，关于蛋白-蛋白相互作用小分子抑制剂的研究已经成为药物化学家关注的热点，P53-HDM2 (MDM2的人源同源分子)的相互作用已成为近年肿瘤药物研究的一个主要领域，抑制HDM2与p53相互作用无疑为新药研究提供了一个很好的作用点。[0006]肿瘤抑制基因p53是一个转录激活因子，它可以调控细胞生长，当细胞中DNA受到损伤时，P53会上调有关基因进行DNA修复，使受损细胞处于细胞周期Gl的停滞状态，并诱导过度受损细胞进行凋亡，从而避免发生癌变。P53的突变与很多癌症的发生有关，p53肿瘤抑制基因在控制细胞周期进行和细胞凋亡中起着重要作用(Nature，408:307,2000)。p53的活性由蛋白MDM2来调控。通过两种不同机制起作用:(I)直接与p53结合，抑制其正常结合功能使之不能形成转录复合物；(2)通过蛋白酶体途径靶向p53，使其泛素化并降解。MDM2 (Murine double minute 2)是一种p53的关键负向调节剂。其通过结合至P53的氨基终端转活化区而形成一种负向自动调节回路，所以，在具有野生型p53的肿瘤中，活性p53的平衡浓度可通过拮抗MDM2和p53间的相互作用而增加，将导致在这种肿瘤细胞中P53介导的凋亡。MDM2除了抑制p53的外，还直接与pRb-调节的转录因子E2F1/DPl相互作用，因为MDM2与p53和E2F1的相互作用均位于MDM2的相同结合部位，可预期MDM2/p53拮抗剂将不仅活化细胞的p53，而且也调整E2F1的活性，而E2F1的活性在肿瘤细胞中通常是不受调节的。因此，MDM2和p53的相互作用的抑制提供一种以野生型p53治疗性干预肿瘤的方法，甚至在缺乏功能性P53的肿瘤细胞中也显示抗增殖效果。[0007]关于MDM2和P53间相互作用的抑制剂的专利和文献=Weissman等在2005年通过高通量筛选得到MDM2抑制剂(Cancer Cell, 7:547, 2005.),Hardcastle和Lunec等也在2005年报道了异吲哚啉酮类小分子抑制剂(Mol.Cancer Ther, 4:1019, 2005.)，美国强生公司Koblish等在2006年报道了一种利用Thermo Fluor微量量热法来发现p53_HDM2小分子抑制剂的技术(Mol.Cancer Ther.,5:160, 2006.)。WO 00/15357 提供了哌嗪-4-苯基衍生物作为MDM2和P53间相互作用的抑制剂。EP 1137418提供了三环化合物，用于恢复P53家族蛋白质的构形稳定性。WO 03/041715描述了取代的1，4-苯并二氮杂革及其作为MDM2-p53相互作 用抑制剂的用途。WO 03/51359提供了顺式_2，4，5-三苯基-咪唑酮，其抑制MDM2蛋白质与类p53肽的相互作用且具有抗增殖活性。WO 04/05278公开了双芳基磺酰胺化合物，其结合MDM2且可用于治疗癌症。CN101023074公开了 Mdm2及p53间相互作用的抑制剂的合成的小分子化合物。CN 101405285公开了作为mdm2和p53间相互作用的抑制剂的环状-烷基胺衍生物。CN 102548963公开了新颖的作为MDM2_p53相互作用抑制剂的N经取代的吡咯烷类化合物。CN 102627649公开了几种Mdm2的小分子抑制剂以及其应用。CN 101316823公开了用作抗癌剂的作为p53和MDM2蛋白之间相互作用的抑制剂的2，4，5-三苯基咪唑啉衍生物。在鉴定有效的小分子抑制剂方面，虽然高效的筛选策略取得了十分有限的成功，但还是十分有限的化合物被认为具有活性。因此，迫切需要筛选新的可以抑制P53-MDM2相互作用的药物小分子。而灵芝三萜类化合物作为MDM2-p53相互作用的小分子抑制剂还未见专利和文献报道。[0008]
针对上述现有技术中存在的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种灵芝酸作为P53-MDM2相互作用抑制剂的用途，所述的这种用途要解决现有技术中直接抑制MDM2和P53间相互作用的药物效果不佳，而且毒副作用比较大的技术问题。
[0009]本发明提供了一种灵芝酸作为p53-MDM2相互作用抑制剂的用途，所述的灵芝酸为灵芝酸X、灵芝酸F、灵芝酸Y、灵芝酸Me、灵芝酸T、或者其药物上可接受的盐类和酯类。
[0010]本发明还提供了一种灵芝酸在制备用于治疗由P53介导的诱导肿瘤细胞凋亡的药物的用途，所述的灵芝酸为灵芝酸X、灵芝酸F、灵芝酸Y、灵芝酸Me、灵芝酸T、或者其药物上可接受的盐类和酯类。
[0011]进一步的，所述的肿瘤细胞为肺癌细胞。
[0012]本发明还提供了一种组合物，包括有效量的灵芝酸和药学上可接受的载体，所述的灵芝酸为灵芝酸X、灵芝酸F、灵芝酸Y、灵芝酸Me、灵芝酸T、或者其药物上可接受的盐类和酯类。
[0013]本发明还提供了一种上述的组合物在制备用于治疗由p53介导的诱导肿瘤细胞凋亡的药物的用途，所述的灵芝酸为灵芝酸X、灵芝酸F、灵芝酸Y、灵芝酸Me、灵芝酸T、或者其药物上可接受的盐类和酯类。
[0014]进一步的，所述的肿瘤细胞为肺癌细胞。
[0015]上述的5种灵芝酸分别从赤灵芝(G.Lucidum)子实体中提取纯化，纯度大于99%。
[0016]“相互作用抑制剂”用于本文时指避免或降低一种或多种分子、肽、蛋白质、酶或受体的直接或间接结合；或避免或降低一种或多种分子、肽、蛋白质、酶或受体的正常活性。
[0017]“p53-MDM2相互作用的抑制剂”用于本文时指在药理分析过程中増加p53表达的药剂。此种增加可由(但不限于)一种或多种下列作用机制所引起:
[I]抑制P53与MDM2间的相互作用；[2]与MDM2或p53蛋白质的任一者直接结合；[3]与上游或下游靶，例如激酶，或涉及泛蛋白化修饰的酶活性的相互作用；[4] MDM2与p53在不同细胞区间的隔离或传输；[5]与MDM2结合的蛋白质的调节，例如(但不限于)p73、p21 ；
[6]向下调节或干扰MDM2表达和/或MDM2活性，例如通过(但不限干)影响其细胞局部化、后转译修饰、核输出或泛蛋白连接酶活性；[7]p53蛋白质的直接或间接稳定化，例如通过保持其为其结构形式或通过避免错折叠；[8]促进p53表达或p53家族成员(例如p63及P73)的表达；[9]増加p53活性，例如通过(但不限干)增强其转录活性；[10]增加p53信号传输路径的基因及蛋白质的表达，例如(但不限于)p2 Iwaf 1、c ip I及ATF-3。
[0018]“p53”用于本文时指因p53基因的表达所获得的蛋白质。包含所有被p53基因编码的蛋白质、其变异物、其选择性的切断蛋白质及其磷酸化蛋白质。
[0019]“MDM2”用于本文时指因MDM2基因的表达所获得的蛋白质。在此术语的意义中，MDM2包含所有被MDM2编码的蛋白质、其变异物、其选择性的切断蛋白质及其磷酸化蛋白质。另外，当用于本文时，术语“MDM2”包括MDM2类似物，例如MDMX(也称为MDM4)及MDM2同系物及其它动物的类似物，例如人类同系物HDM2或人类类似物HDMX。
[0020]本发明的化合物具有促进凋亡作用，即使肿瘤细胞没有功能性P53。特别地，本发明的化合物可在具野生型P53的肿瘤中和/或于过量表达MDM2的肿瘤中具有促凋亡作用。
[0021]“肿瘤细胞”用于本文时指医学上所属的各类恶性肿瘤:肺癌，甲状腺癌，恶性黑色素瘤，恶性淋巴瘤，脑部肿瘤，消化器官的肿瘤，乳癌，卵巢癌，子宫癌，睾丸癌，前列腺癌，上颚癌，咽喉癌，舌癌，口腔癌，各类肉瘤，骨肉瘤，白血病，神经系统肿瘤，膀胱肿瘤，皮肤癌，皮肤附属器官癌和皮肤转移癌。
[0022]本发明提供的肿瘤细胞中MDM2-p53相互作用抑制剂，小剂量使用能抑制MDM2活性及MDM2-p53相互作用，导致p53的降解过程被抑制，具有对p53+肿瘤细胞的选择性诱导凋亡作用。大剂量使用直接表现出无选择性的细胞毒性。可将它们作为P53介导的肿瘤治疗药物。所说的小剂量指的是低于0.l-5mg/ (kg.body weight.d)的剂量,大剂量指的是高于 5_50mg/ ( kg.body weight.d)的剂量。
[0023]本发明的p53- MDM2相互作用的抑制剂，在野生型p53和缺陷型p53肿瘤细胞中均有抑制MDM2作用，诱导凋亡作用。
[0024]本发明提供的p53- MDM2相互作用的抑制剂，可经脂溶剂(如乙醇)等溶剂用常规法调制，在剂型上无特殊限制，能与药理学上允许的添加成分(稀释剂，着色剂，安定剂，界面活性剂，助溶剂，缓冲剂，矫味剂，香料，保存剂，糖衣剂)相组合，可以经口给药也可非经口给药。经口给药剂型是指片剂，丸剂，颗粒剂，散剂或胶囊。非经口剂型是指静脉注射剂，肌肉注射剂，皮下注射剂，浴剂，直肠，肛门或阴道给药。[0025]体外研究表明:灵芝酸X，F，Me, Y和T具有显著地抑制人恶性肺癌肿瘤细胞中MDM2活性，抑制P53蛋白降解的功能，可以用于抑制泛素化作用介导的蛋白降解，促进含有P53的肿瘤细胞凋亡。
[0026]


图1为不同浓度GA-T处理对表达p53蛋白的95-D肺癌细胞和不表达p53蛋白的H1299肺癌细胞的细胞毒性比较。
[0027]图2为不同浓度和时间的GA- Me处理对表达p53蛋白的95_D肺癌细胞和不表达P53蛋白的H1299肺癌细胞的抑制作用比较。
[0028]图3为灵芝酸X、灵芝酸F、灵芝酸Me、灵芝酸Y和灵芝酸TGA-X、灵芝酸F、灵芝酸Y对表达P53蛋白的95-D肺癌细胞和不表达p53蛋白的H1299肺癌细胞凋亡的影响。
[0029]图4为灵芝酸X、灵芝酸F、灵芝酸Me、灵芝酸Y和灵芝酸T对表达p53蛋白的95_D肺癌细胞中MDM2表达的影响。
[0030]
下面通过实施例对本
【发明内容】
作进一步说明。所举之例并不限制本发明的保护范围: 实施例1
GA-T对表达p 53蛋白的95-D肺癌细胞和不表达p53蛋白的H1299肺癌细胞的毒性作
用:
GA-T纯度大于99%，用DMSO稀释成所需浓度。采用噻唑蓝(MTT)快速比色法测定GA-T对2种细胞的毒性作用。将对数生长期细胞(106cell.ml_l)接种于96孔培养板，每孔0.2ml，分别加入一定浓度的GA-T处理，每浓度平行4孔，DMSO最终浓度小于0.1%，对照组加等量体积的培养液，置37°C，5% C02及饱和湿度的培养箱培养1-4天，实验终止前4小时每孔加入5mg.ml-l MTT 10 μ 1，培养结束后每孔加入0.04 N 二甲基亚砜(DMS0)，每孔150 μ I，振荡10 min,待MTT还原产物完全溶解，用BioRad 550型酶标仪，以550 nm为实验波长测定其吸收度，计算药物对细胞的抑制率，并以灵芝酸的不同浓度和细胞的抑制率作图，确定细胞的半数抑制浓度(IC50)。实验结果如下图1所示。
[0031]以上实施例说明，GA-T具有抑制2种肺癌肿瘤细胞增殖的作用，但表达p53蛋白的95-D肺癌细胞对GA-T更敏感，比不表达p53蛋白的H1299肺癌细胞的毒性作用要高3.3倍。提示灵芝酸T可以通过刺激P53诱导增殖抑制。
[0032]实施例2
不同浓度和时间的GA- Me处理对表达p53蛋白的95-D肺癌细胞和不表达p53蛋白的H1299肺癌细胞的抑制作用:
GA-Me纯度大于99%，用DMSO稀释成所需浓度。采用噻唑蓝(MTT)快速比色法测定GA-Me对2种细胞的毒性作用。将对数生长期细胞(106cell.ml_l)接种于96孔培养板，每孔0.2ml，分别加入一定浓度的GA-Me处理，每浓度平行4孔，DMSO最终浓度小于0.1%，对照组加等量体积的培养液，置37°C，5% C02及饱和湿度的培养箱培养1-4天，实验终止前4小时每孔加入5mg.ml-l MTT 10 μ 1，培养结束后每孔加入0.04 N 二甲基亚砜(DMS0)，每孔150 μ 1，振荡10 mindtMTT还原产物完全溶解，用BioRad 550型酶标仪，以550 nm为实验波长测定其吸收度，计算灵芝酸对细胞的抑制率，并以灵芝酸的不同浓度和细胞的抑制率作图，确定细胞的半数抑制浓度(IC50)。实验结果见图2。[0033]以上实施例说明，GA-Me对2种细胞均具有增殖抑制作用，但对表达p53蛋白的95-D肺癌细胞比不表达p53蛋白的H1299肺癌细胞的毒性作用要强，且短时间内就可产生较大的抑制。提示灵芝酸Me可以通过刺激P53诱导增殖抑制。
[0034]实施例3
灵芝酸X、灵芝酸F、灵芝酸Me、灵芝酸Y和灵芝酸T诱导表达P53蛋白的95-D肺癌细胞和不表达P53蛋白的H1299肺癌细胞凋亡:
对数生长期95-D细胞培养4h后，经50 μ g/mL的上述各种灵芝酸作用8h后，经胰蛋白酶消化，离心收集细胞(1500 rpm X IOmin)，PBS洗涤两遍，以PBS调整细胞浓度为106个/mL,加入RNase，终浓度为100U/mL，37 ° C保温30 min,加入Annexin V和PI，终浓度为50 118/1^，在常温下暗反应3()1^11，然后200目滤膜过滤，经流式细胞仪分析凋亡，每次记录1000 - 1500个细胞。结果见图3。
[0035]以上实施例说明，灵芝酸可诱导表达p53蛋白的95-D肺癌细胞和不表达p53蛋白的H1299肺癌细胞凋亡，且对表达p53蛋白的95-D肺癌细胞效果更好。
[0036]实施例4
灵芝酸X、灵芝酸F、灵芝酸Me、灵芝酸Y和灵芝酸T抑制95-D肺癌细胞中MDM2表达的效果:
对数生长期95-D细 胞培养4h后，经0，50 μ g/mL的上述各种灵芝酸作用8h后，经胰蛋白酶消化，离心收集细胞(1500 rpm X IOmin)，使用细胞裂解液裂解细胞，收集蛋白样品，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定每个蛋白样品的蛋白浓度，保证后续电泳的蛋白上样量一致。配制15%SDS-PAGE凝胶，在蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白，冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内。电泳时在上层胶时使用80V低电压恒压电泳，下层胶时使用120V高电压恒压电泳，时间为90-120分钟。电泳后切胶，转膜，选用PVDF膜，转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。转膜完毕后洗涤去除膜上的转膜液，加入封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。参考鼠抗人MDM2 —抗的说明书，按照适当比例用一抗稀释液稀释，立即加入稀释好的一抗，室温或4°C在侧摆摇床上缓慢摇动孵育I小时。回收一抗。加入洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟，吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟，共洗涤3次。参考二抗的说明书，按照适当比例用二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4°C在侧摆摇床上缓慢摇动孵育I小时，回收二抗。加入洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟，共洗涤3次。蛋白检测采用化学发光法，通过检测仪检测光密度，与阴性对照比，确定抑制率。结果如图4所不。
[0037]以上实施例说明，灵芝酸抑制了 95-D肺癌细胞中MDM2表达，从而抑制了 P53蛋白
的降解，进一步诱导凋亡。