微生物杀虫剂的制造方法

园山高康, 八木滋雄, 内山孝治, 北垣康男

1992年11月25日

1991年5月9日

1991年5月9日

盐野义制药株式会社

A01N63/02GK1066365SQ9110348

杀虫剂 微生物 制造

1.微生物杀虫剂的制造方法，包括将苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)在培养基中进行培养，使培养液的毒素蛋白沉降，并将含有该沉降的毒素蛋白下层分离液进行干燥，其制造方法包括下面的(a)、(b)以及(c)工程中的至少一个工程(a)作为氮源的一种至少是在含有猪肉粉末的培养基中进行培养的工程(b)将该菌的培养结束以后的培养液的PH值调整至2-4，并将毒素蛋白进行沉降的工程，以及(c)分取含有该毒素蛋白的培养液下层，向其中添加二氧化硅粉末，并将所得的混合物进行喷雾干燥的工程2.权利要求1中记载的制造方法，其中含有上述的猪肉粉末的比例为培养基成分之总重量的2-10重量%3.权利要求1中记载的制造方法，其中上述二氧化硅粉末的平均粒径为6-8μm4.权利要求1中记载的制造方法，其中上述二氧化硅的粉末，以含有沉降毒素蛋白液的2-6重量%的比例添加5.权利要求1中记载的制造方法，包括上述(a)、(b)以及(c)工程的全部

本发明涉及含有苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)的毒素蛋白的微生物杀虫剂的制造方法苏云金杆菌是在革兰氏阳性的土壤细菌中，在胞子形成期产生被称作δ-内毒素的毒素蛋白由于昆虫类，尤其是鳞翅目幼虫摄取该蛋白就会死亡，因此制造含有苏云金杆菌菌体制剂(BT剂)的杀虫剂、BT剂作为农药1965年由美国环境保护局(EFA)所承认，并许可市售，而在日本也由几家公司出售BT剂BT剂以及它的制法，例如，在美国专利第3071519号及第3086922号中已被揭示BT剂，正如这些专利中公开那样，通常，培养苏云金杆菌液体，通过自然沉降，离心分离等的手段采集菌体，然后将其进行干燥，与适当的赋形剂混合的方法得到其中毒素蛋白是如下面叙述那样，存在于苏云金杆菌的菌体内，而且通过菌的分裂等方式以向菌体外溶出的状态存在但是使毒素蛋白沉降，需长时间，或者，如果进行离心分离，含毒素蛋白的菌体成为颗粒状，而为了取出它则需要许多劳动和动力BT剂与化学杀虫剂比较，对于标的害虫显示了选择性的杀虫效果，以及对环境的安全性高，因此，被认为适合于农作物或森林的树木的防虫及除虫，因而希望开发有效地制造BT剂的方法本发明解决了上述过去的课题，其目的在于，提供有效果地制造含有苏云金杆菌的毒素蛋白的微生物杀虫剂的方法本发明的另一个目的是提供包括有效果地培养上述苏云金杆菌，和/或从含毒素蛋白的培养液，通过简单的操作回收毒素蛋白并制剂化的上述微生物杀虫剂的有效果的制造方法本发明的微生物杀虫剂的制造方法是包括将苏云金杆菌在培养基中进行培养，使培养液的毒素蛋白沉降，并将含有该沉降了的毒素蛋白的培养液进行干燥的微生物杀虫剂的制造方法，该方法还包括下面的(a)、(b)以及(c)的工程中的至少一个工程(a)作为氮源的一种至少是在含有猪肉粉末的培养基中进行培养的工程;(b)调节该菌的培养结束后的培养液的PH值至2-4，并将毒素蛋白进行沉降的工程，以及，(c)分取含有该毒素蛋白的培养液下层，并向其中添加二氧化硅粉末，将所得的混合物进行喷雾干燥的工程下面，按工程顺序说明本发明的微生物杀虫剂的制造方法(1)菌体的培养本发明中使用的菌是只要产生对昆虫有害的毒素蛋白的苏云金杆菌的菌株都可以用这些例子有在特公昭58-23365号公报中记载的苏云金杆菌alesti P15A-1(微工研菌寄存号第2458号)，以及该公报中记载的苏云金杆菌aizawai 14511(微工研菌寄存号第2459号)另外，可以使用在美国典型培养物保藏中心中被寄存的苏云金杆菌，苏云金杆菌subsp.israelensis以及苏云金杆菌subsp kurstaki的各菌株例如，可以用ATCC No，10792，13366，13367，19265，19266，19267，19268，19269，19270，29730，33740，39756，35646，39152，33679，33680，33681，35866的菌株上述苏云杆菌的培养是用含有碳源，氮源，各种盐类等通常的培养基，在好气性条件下进行例如，在含有马铃薯淀粉，酪蛋白，大豆糠，玉米淀粉，酵母浸液，磷酸三铵等液体培养基中进行预培养，然后，在含有马铃薯淀粉、猪肉粉末，玉米淀粉等的液体培养基中进行本培养在本发明中，如上所述，作为氮源的主要成分以含有猪肉粉末为好基中所说的“猪肉粉末”是指猪肉的干燥粉末以外，包含猪肉的萃取浸液，猪肉的酵母分解物等猪肉的成分特别是在本培养中通过用含有猪肉粉末的培养基，可以促进δ-内毒素(毒素蛋白)的产生猪肉粉末量，以培养基成分之总重量的10重量%以下，较好的是2-10重量%的比例来使用培养基的PH值为6.7-7.3，通常的PH值为7左右，而培养温度为26-30℃，通常是在28℃左右进行通常，在上述条件下进行预培养16小时左右，然后将其作为种菌，接种于本培养的培养基中，并在通气搅拌条件下进行48小时左右的培养(2)培养液的PH调整以及菌体的分离在培养结束后的培养液中，添加适当的酸，例如硫酸、盐酸、醋酸等，并将该培养液的PH值调整至2-4，较好的是调整至3左右，以迅速地沉降毒素蛋白并且由此可以防止杂菌的繁殖将调整了PH值的培养液，如果在通常室温下放置70小时左右，毒素蛋白就沉降在发酵槽的底部(占培养液的容量的40-60%的部分)不进行上述PH值的调整，而通过离心分离等方法当然也可以使毒素蛋白沉降然后，分取含有沉降的毒素蛋白的培养液下层液，根据需要进行过滤，除去培养液中的漂浮固体物在上述培养结束后的培养液中，δ-内毒素存在于菌体内，但其一部分通过菌的溶菌存在于菌体外的培养基中因此，在本说明书中的所谓毒素蛋白，包含菌体外以及菌体内的δ-内毒素进一步说，例如，“毒素蛋白的沉降”，实质上指“菌体的沉降”，或者“毒素蛋白”，有时是指菌体和δ-内毒素的混合物(3)含有沉降毒素蛋白液的干燥在以上述(2)项中所得的含有沉降毒素蛋白液中，较好的是添加二氧化硅粉末后，送到干燥作为二氧化硅粉末，可以使用粒径为0.1-200μm，较好的是0.5-32μm，更好的是平均粒径为6-8μm的粉末例如，80＃卡普来克斯(盐野羲制药(株)制)为合适二氧化硅的粉末量，可以以含有沉降毒素蛋白液的6重量%以下，较好的是2-6重量%，更好的是2-3重量%的比例添加充分进行搅拌均匀化之后，将PH值调整至7左右后，通过喷雾干燥，通风干燥等的方法进行干燥例如，吹250℃左右的热风进行喷雾干燥，根据需要进行过筛，使粒度一致由于加入上述二氧化硅粉末，在干燥工程中，消除了例如，毒素蛋白粉末在干燥室壁面粘结或者毒蛋白粉末相互之间结合成块状的现象因此，就不必要从腔室的壁面搓落毒素蛋白粉末等，消除了过去的繁杂的作业，可容易地进行干燥在这样得到的苏云金杆菌的毒素蛋白粉末中，通常加入适当的赋形剂就可以成为制品作为赋形剂，可以使用白土粉末，新的卡鲁根(竹本油脂(株)社制)等干燥原末的含有率为，通常，20-50重量%，也可以混合不同菌株的毒素蛋白粉末这样，根据本发明，通过包含下面的(a)、(b)以及(c)工程中的至少一个工程的方法，制造出含苏云金杆菌的毒素蛋白的微生物杀虫剂(a)作为至少的一种氮源，在含有猪肉粉末的培养基中进行培养的工程;(b)将该菌的培养结束后的培养液的PH值调整至2-4，并使毒素蛋白沉降的工程，以及，(c)分取含有该沉降毒素蛋白的培养液的下层，向其中添加二氧化硅粉末，并将所得的混合物进行干燥的工程通过采用上述(a)工程，可以促进菌体的繁殖，而且提高毒素蛋白的生产量通过采用(b)工程，可在短时间内沉降毒素蛋白，而且，能够在发酵槽的底部(培养液的40-60%容量的部分)沉降毒素蛋白，因此，通过采集含有沉降毒素蛋白的下层液，能够在短时间内进行干燥，如果采用(c)工程，就在干燥中没有毒素蛋白粉末粘结在干燥用腔室的壁面的现象，可以容易地进行干燥这样，根据本发明，可以有效地制造含有苏云金杆菌的微生物杀虫剂在该菌体中生成的δ-内毒素，对于占农作物害虫之大多数的鳞翅目昆虫表现了杀虫性能，因此适于作为不破坏自然环境的杀虫剂实施例下面根据实施例具体说明本发明，在本实施例中用的菌是，苏云金杆菌鲇泽(aizawai)亚种以及苏云金杆菌柯式(Kurstaki)亚种，分别以相同的操作进行菌体的培养，然后混合这些菌体得到了杀虫剂(A)菌株的预培养通常使用琼脂培养基(斜面培养基)进行培养的菌株，用表1中所示的液体培养基(600me×12根)，进行了16小时振荡培养表 1马铃薯淀粉 76克酪蛋白 76克大豆糠微粉末 228克磷酸三铵(三结晶水盐) 38克玉米淀粉末 114克碳酸钠(无水) 7.6克酵母浸液 19克消泡剂(P-2000,大日本INK制) 1毫升自来水 7.6升用6N-HCl，调整PH值为7.0±0.2上述振荡培养是用旋转振荡器(转速为200±5rpm、振幅英寸)，在28±1℃的温度下进行该培养液的PH值为5.8，TS(固体含量;成为表示菌体量的指标;测定方法在后面叙述)为2.5%，进一步用显微镜观察该培养液，确认了有无污染以及菌的形态没有异常的现象(B)菌体的本培养将装有搅拌机的本培养用的槽(容量9m3)的内部灭菌后，向该槽中注入表2所示的本培养培养基，加入20%氢氧化钠，调整PH值为7.0±0.1表 2马铃薯淀粉 260kg猪肉粉末 260kg玉米淀粉末 97.5kg碳酸钠(无水) 6.5kgP-2000 5.85kg自来水 4500L然后，向槽内吹入直接蒸汽，在槽内温度121±1℃时，将培养基进行35分钟的灭菌将槽内的温度调整为28±1℃在培养基中，加入以(A)项所得的种菌液，在槽内温度28±1℃，PH6.8～7.3，通气量3.9±0.5Hm3/分，以及搅抖转速160±3rpm的条个下，开始培养，在培养过程中，根据需要添加消泡剂(P-2000)48小时至52小时的之间，当PH值成为7.8以上时，停止了培养培养结束的同时，停止通风，将搅拌转速改变成80rpm进行80分钟的脱气取10毫升的培养液，离心分离10分钟，测定的沉降的固体成分(T·S)为36%，进一步将培养液中的菌体以亮兰碱性藏红(BBS)进行染色，用显微镜扩大1500倍，计测了视野中的颗粒状的毒素蛋白个数算出5个视野中的平均数为54个然后，在培养液中加入62%的硫酸53±7kg，将培养液的PH值调整至2.9～3.0进一步搅拌30分钟以后，取样，确认其PH值为3.0±0.1时，停止搅拌(C)毒素蛋白的沉降以及分取含有毒素蛋白液将PH值调整为3的上述培养液，在室温下放置70±4小时，使毒素蛋白沉降毒素蛋白沉降在全体培养液的约60%容积的部分把培养液的上清液排向培养槽外将约4000升的下层液，搅拌15分钟(搅拌转速为80rpm)进行混合，将其导入与其串连连结的二台布氏过滤机中，(20目及28目)，在加压下进行过滤(D)二氧化硅粉末的添加以及干燥在(C)项中所得的约8000kg滤液中，加入270kg自来水进行混合，并将该混合液移至淤浆槽中向其中加入二氧化硅粉末(卡普来克斯80＃)190kg，搅拌10分钟，加入20%氢氧化钠调PH值为7.0将其进一步搅拌30分钟，确认其PH为7.0±0.1将该中和后的淤浆，以240±20kg/小时的比例供给干燥机，以喷雾器转速17000rpm，热风温度250±2℃的条件下进行了喷雾干燥将干燥物用60目筛子过筛，得到了约750kg的干燥原末(E)制剂的配制将这样得到的苏云金杆菌鲇泽亚种(subsp.aizawai)的干燥原末以及苏云金杆菌柯式亚种(subsp.kurstaki)的干燥原末，以1∶1的重量比进行混合，并将该混合物24份重量，新卡鲁根(竹本油脂(株)社制)3份重量，以及微粉末状白土(粒径1～40μm)73份重量，进行混合就得到了微生物杀虫制剂通过下面记载的方法测定在实施例1(D)项中所得到的苏云金杆菌鲇泽亚种(subsp.aizawai)的干燥原末及苏云杆菌柯式亚种(subsp.kurstaki)的干燥原末活性另外用大豆糠代替表2中的猪肉粉末，与实施例1同样地进行菌体的培养(参考例1)，并对其用同样的方法测定了干燥原末的活性其结果表示于表3在表3中，括弧内的数值为将参考例1中的干燥原末的活性作为1时的活性比干燥原末活性的测定方法配制含有种种浓度的干燥原末的悬浮液，取其0.5ml蚕的加入到10克人工饲料中搅拌混合，得到了含有种种浓度原末的人工饲料把它放在滤纸上，以厚度3～5mm摊开放入皿中，在其上面放上蚕(3令，第2日的幼虫)，在25℃下保持3天此后，除去含有原末的饲料，以不含原末的人工饲料取代，饲育48小时，求出死虫率画出人工饲料的饲料浓度与死虫率之间的关系曲线，用普罗比特(probit)法求出Lc50[(蚕的50%死亡时的人工饲料10g中上述原末的重量(mg)]将Lc50作为1个单位例如，Lc50为0.05mg/10g饲料的时候，原末100kg的总活性为2×109单位表 3 在表3中，Gu表示千兆单位(109单位)从表3的结果看出，使用猪肉粉末作为氮源的方法所生产的毒素蛋白量可高1.6～1.8倍不进行实施例1(C)项中的将PH值配制成3的工程以外，其余以实施例1同样的方法进行操作，得到了杀虫制剂(参考例2)对于实施例1以及参考例2，分别在表4中表示了它们的将菌体沉降70小时后含有毒素蛋白液(下层部分)的固体成分浓度、喷雾干燥的时间、得到的干燥粉末的总活性表4中的括弧内数值为，将参考例2的值作为1时的比值 在表4中，Mu表示千兆单位(106单位)从表4的结果知道，通过调整培养液的PH值，使培养液中的菌体迅速沉降，因此，在大大地缩短干燥需要的时间而且很显然，通过该操作没有活性损失现象使用助滤剂(hy-flo-supercol)(jonmanbuil社利;硅藻土)1.5重量%或者2.0重量%的比例代替卡普来克斯＃80以外，用与实施例1同样的方法得到了杀虫制剂(参考例3-1、3-2)在实施例1以及参考例3-1以及3-2中，测得从含有毒素蛋白液的干燥原末的回收率其结果表示在表5中表5中括号内的值表示将实施例的回收率作为1的情况下的回收率 从表5的结果知道，通过使用二氧化硅粉末的卡普来克斯＃80，可以改善流动性，增加粉末的回收率根据本发明，在含有苏云金杆菌毒素蛋白的杀虫剂的制造中，能够促进菌体的繁殖，而且提高毒素蛋白的生产量，不用进行繁杂的操作处理培养液，可在短时间内，使含毒素蛋白液干燥由于可有效地制造微生物杀虫剂，因此能廉价地提供该制剂