专利名称：醋酸杆菌在水果组织上吸附固定化的方法醋酸杆菌的固定化方法主要有吸附法和包埋法。目前就醋酸杆菌固定化的专利主要以海藻酸钙固定化为主，但由于醋酸杆菌属于好氧微生物，在发酵液中为获得足够的氧，醋酸杆菌细胞最好直接暴露于发酵液中，否则影响氧的传质和醋酸发酵的速度，如果缺氧易造成醋酸杆菌的快速死亡。在食醋生产技术中可大致分为传统工艺(固体发酵一液一固发酵)和现代工艺(液态深层发酵)。总体上来看，固体发酵法和液、固发酵法所酿制的醋成品香气浓郁，口味醇厚，色深质浓，但生产周期长，劳动强度大，出品率低。而液态深层发酵技术自动化程度高、发酵工艺参数和卫生条件均较易控制，生产效率高，目前国外市场上绝大部分品种的果醋均采用此工艺生产。但液态深层发酵也存在一些缺陷，如在醋酸发酵阶段由于供氧搅拌的蒸腾作用常导致挥发性原果风味物质的损失，同时还导致乙醇挥发损失，最后造成醋酸转化率降低。
为了克服现有技术的上述缺点，本发明提供一种将动植物或微生物细胞固定在合适的不溶性载体上，既能提高生产效率，延长细胞寿命，又能增加生产能力，而且在生产后期易于细胞分离，可回收再利用的醋酸杆菌在水果组织上吸附固定化的方法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种醋酸杆菌在水果组织上吸附固定化的方法，其工艺步骤是 步骤一、载体预处理选取质量较好的甘蔗2kg，削掉外皮，切成Icm方块，按甘蔗蒸馏水=1 :1 15 (W / W)加蒸馏水浸泡并加热至60 100°C保持I 3h，再更换蒸馏水2 次，4000r min离心15min,然后将收集的甘鹿粒于50°C烘干,备用； 选取质硬的苹果或梨，洗净后连皮切成5mm厚的果片，按苹果片或梨片与抗坏血酸质量比I :3 10添加浓度为400ppm抗坏血酸，常温浸泡Ih后，再更换I次蒸馏水浸泡lh，然后浙干水份，于50°C烘干后，备用； 步骤二、将斜面保藏的恶臭醋酸杆菌GMl. 67进行菌种活化，活化次数为3次； 步骤三、选用经上述处理后的甘蔗粒、苹果片或梨片作为载体，将吸附固定化载体进行脱糖前于121°C高温灭菌处理； 步骤四、将活化后的恶臭醋酸杆菌、灭菌处理后的载体和已灭菌的乙醇基质接入发酵罐，于25 32°C发酵I 5d进行吸附固定化发酵3 8d制备乙酸。所述恶臭醋酸杆菌接种量为1% 5% (V / V)。所述载体对恶臭醋酸杆菌的细胞负载率大于I X IO5个/mg载体。所述乙醇基质乙醇浓度为
本发明的有益效果是固定化细胞技术可多批次使用，且其连续的批次发酵时间可达到180天以上，相应转酸率> 90%，不但可以提高生产效率，延长细胞寿命，增加生产能力，而且在生产后期易于细胞分离，可回收再利用；固定化细胞发酵解决了传统工艺和现代工艺的难题，它可以重复利用微生物进行多级反应，使用反应器可实现批次发酵，避免反馈调节或产物消耗，提高发酵生产率，降低设备费用，同时也消除了发酵过程中原果风味及营养功能成分的损耗；而利用可食用且多孔性的水果组织吸附醋酸杆菌进行固定化，能解决包埋法中传质、输氧等问题。

下面结合实施例对本发明进一步说明。一种醋酸杆菌在水果组织上吸附固定化的方法，其工艺步骤是
步骤一、载体预处理选取质量较好的甘蔗2kg，削掉外皮，切成Icm方块，按甘蔗蒸馏水=1 :1 15 (W / W)加蒸馏水浸泡并加热至60 100°C保持I 3h，再更换蒸馏水2次，4000r min离心15min,然后将收集的甘鹿粒于50°C烘干,备用；
选取质硬的苹果或梨，洗净后连皮切成5mm厚的果片，按苹果片或梨片与抗坏血酸质量比I :3 10添加浓度为400ppm抗坏血酸，常温浸泡Ih后，再更换I次蒸馏水浸泡lh，然后浙干水份，于50°C烘干备用；
步骤二、将斜面保藏的恶臭醋酸杆菌GMl. 67进行菌种活化，活化次数为3次；
步骤三、选用经上述处理后的甘蔗粒、苹果片或梨片作为载体，将吸附固定化载体进行脱糖前于121°C高温灭菌处理；
步骤四、将活化后的恶臭醋酸杆菌、灭菌处理后的载体和已灭菌的乙醇基质接入发酵罐，于25 32°C发酵I 5d进行吸附固定化发酵3 8d制备乙酸，所述恶臭醋酸杆菌接种量为1% 5% (V / V)，所述载体对恶臭醋酸杆菌的细胞负载率大于I X IO5个/mg载体，所述乙醇基质乙醇浓度为2% 8% (V / V)。实例一 1、载体预处理选取质量较好的甘蔗2kg，削掉外皮，切成Icm方块，按甘蔗与蒸馏水的质量比I :6添加蒸馏水浸泡并加热至90°C保持lh，再更换蒸馏水2次，4000r / min离心15min,然后将收集的甘鹿粒于50°C烘干,备用。2、将15g已灭菌处理的上述甘蔗粒放入IOL发酵罐，接入200mL扩大培养的恶臭醋酸杆菌液，然后将6L乙醇浓度为2% ((V / V))发酵基质输入，于28°C进行吸附固定化发酵，发酵期间溶解氧始终控制>2. Omg / L，发酵7d得到乙酸，乙酸的转化率达到100%，载体对恶臭醋酸杆菌的细胞负载率为3. 5 X IO6个/ mg载体。3、采用无污染方式将上述发酵罐中的液体放出，固定化恶臭醋酸杆菌保留在罐中，重新输入7L乙醇浓度为4. 5% (V / V)的发酵基质，于28°C进行固定化发酵，发酵期间溶解氧控制彡2.0 mg / L，发酵6d后乙酸的转化率达到96%。重复上述操作，进行了 23批次发酵，转酸率均介于90% 98%之间，固定化细胞活性持续时间达到192d。实例二 1、载体预处理选取质硬的苹果3 kg,洗净后连皮切成5 mm厚果片,按苹果片与抗坏血酸质量比I :8添加浓度为400 ppm抗坏血酸，常温浸泡I h后，再更换I次蒸馏水浸泡I h，然后浙干水份，于50 °C烘干，备用。2、将20 g已灭菌处理的上述苹果片放入IOL发酵罐，接入300mL扩大培养的恶臭醋酸杆菌液，然后将6L乙醇浓度为2% (V / V)发酵基质输入，于30°C进行吸附固定化发酵，发酵期间溶解氧控制> 2.0 mg/L，发酵6d后乙酸的转化率达到92%，载体对恶臭醋酸杆菌的细胞负载率为6. I X IO5个/ mg载体。3、采用无污染方式将上述发酵罐中的液体放出，固定化恶臭醋酸杆菌保留在罐中，重新输入7L乙醇浓度为4.0% (V / V)的发酵基质，于30°C进行固定化发酵，发酵期间溶解氧控制彡2. Omg / L，发酵5d后乙酸的转化率达到91%。重复上述操作，进行了 20批次发酵，转酸率均介于90% 93%之间，固定化细胞活性持续时间达到186d。实例三I、载体预处理选取质硬的贡梨2kg,洗净后连皮切成5mm厚果片，按梨片 与抗坏血酸质量比I : 10添加浓度为400 ppm抗坏血酸，常温浸泡Ih后，再更换I次蒸馏水浸泡lh，然后浙干水份，于50°C烘干，包装备用。2、将30g已灭菌处理的上述梨片放入IOL发酵罐，接入300mL扩大培养的恶臭醋酸杆菌液，然后将6L乙醇浓度为3% (V / V)发酵基质输入，于25 1进行吸附固定化发酵，发酵期间溶解氧控制> 2. Omg/L，发酵8d后乙酸的转化率达到96%，载体对恶臭醋酸杆菌的细胞负载率为I. 2 X IO5个/ mg载体。3、采用无污染方式将上述发酵罐中的液体放出，固定化恶臭醋酸杆菌保留在罐中，重新输入6L乙醇浓度为3. 5%(V / V)的发酵基质，于25°C进行固定化发酵，发酵期间溶解氧控制彡2.0 mg / L，发酵7 d后乙酸的转化率达到94%。重复上述操作，进行了 18批次发酵，转酸率均介于90% 96%之间，固定化细胞活性持续时间达到182d。本发明的固定化细胞技术可多批次使用，且其连续的批次发酵时间可达到180天以上，相应转酸率> 90%，不但可以提高生产效率，延长细胞寿命，增加生产能力，而且在生产后期易于细胞分离，可回收再利用；固定化细胞发酵解决了传统工艺和现代工艺的难题，它可以重复利用微生物进行多级反应，使用反应器可实现批次发酵，避免反馈调节或产物消耗，提高发酵生产率，降低设备费用，同时也消除了发酵过程中原果风味及营养功能成分的损耗；而利用可食用且多孔性的水果组织吸附醋酸杆菌进行固定化，能解决包埋法中传质、输氧等问题。


本发明涉及一种醋酸杆菌在水果组织上吸附固定化的方法，首先进行载体预处理，然后将斜面保藏的恶臭醋酸杆菌GIM1.67进行菌种活化，活化次数为3次；再选用经上述处理后的甘蔗粒、苹果片或梨片作为载体，将吸附固定化载体进行脱糖前于121℃高温灭菌处理，最后将活化后的恶臭醋酸杆菌、灭菌处理后的载体和已灭菌的乙醇基质接入发酵罐，于25～32℃发酵1～5d进行吸附固定化发酵3～8d制备乙酸。固定化细胞技术可多批次使用，且其连续的批次发酵时间可达到180天以上，相应转酸率≥90%，提高了生产效率，延长细胞寿命，增加生产能力，而且在生产后期易于细胞分离，可回收再利用。