专利名称：一种拟穴青蟹胰蛋白酶基因应用于预测蜕壳周期的方法甲壳动物生长发育总是与蜕壳联系在一起的。蜕壳的整个过程包括蜕去旧甲壳，个体由于吸水迅速增大，然后新甲壳形成并硬化。因此甲壳动物的个体增长在外形上并不连续，呈阶梯形，每蜕一次壳，上一个台阶。蜕壳周期可分为蜕壳、蜕壳后、蜕壳间和蜕壳前。对于甲壳动物，根据Drach和Tchemigovtzef的标准可把脱壳周期进一步划分为E、A、B、C^1 一 C4), D (D0 一 D4)5个时相。青蟹的生长也是不连续的，蜕壳是其生长的标志。在青蟹的生命活动中，包括形态的改变、个体的增大、发育与成熟、断肢的再生、体表附着物和某些病变的剔除等，都是经过不断的蜕皮和蜕壳而完成的。蜕皮与蜕壳，既是外部形态的变化，又是内部错综复杂的生理活动。这种生理作用，对生长发育非常重要。影响蜕壳的环境因子较多，如温度、盐度、pH值、光照期、生存空间等等，饵料、维生素C等均可影响蜕壳过程。其中摄食量的大小对于蜕壳的物质准备至关重要。胰蛋白酶是动物消化道中一种主要的碱性蛋白水解酶，属于丝氨酸蛋白酶家族，专一性水解赖氨酸与精氨酸羧基形成的肽键，其主要功能一是消化蛋白质食物，二是激活所有胰腺分泌的酶原，可以迅速有力地激活其他蛋白酶原(糜蛋白酶原、羧肽酶原、弹性蛋白酶原)而行使消化功能。因此胰蛋白酶基因的表达水平与动物的消化水平和摄食能力密切相关。到目前为止，还未见根据青蟹胰蛋白酶基因的表达水平来预估投饵数量，并预测青蟹蜕壳周期的相关报道。
本发明所要解决的技术问题是提供一种拟穴青蟹胰蛋白酶基因应用于预测蜕壳周期的方法，该方法工艺简单，成本低，能够预测青蟹种苗繁育过程中的蜕壳周期，以满足人们对青蟹生活周期的掌握以及遗传育种中的选用，减少饵料消耗量，提高种苗成活率，从而优化育苗过程。本发明的一种拟穴青蟹胰蛋白酶基因应用于预测蜕壳周期的方法，包括(I)取各个潘状幼体时期的青蟹个体，加液氮并研碎，加入盛有裂解液的I. 5mL EP管，充分振荡，抽提总RNA，用甲醛变形胶电泳鉴定总RNA质量，然后再用分光光度计测定RNA含量；(2)以上述RNA为模板进行反转录，在反转录得到的cDNA中取2μ I分别稀释101、102、103、104、105、106倍作为模板制作标准曲线，取稀释100倍的模板为对象进行样品测定；进行PCR反应，待反应结束后将胰蛋白酶基因的Ct值代入标准曲线，换算出各自的起始模板量，以16SrRNA基因作为参比基因，将胰蛋白酶基因的计算所得的模板量除以同一个样、品中的16SrRNA基因模板量，即得到胰蛋白酶基因的相对表达水平；(3)以潘状幼体I期的胰蛋白酶基因相对表达水平为基准，归一化为I. 0000，对需要检测的拟穴青蟹的幼体的胰蛋白酶基因相对表达水平进行检测，然后与潘状幼体I期的相对表达水平相除得出平均值，以此预测蜕壳周期。所述步骤(I)中的裂解液的组成为TRIzoI溶液(TaKaRa公司)。所述步骤(2)中的反转录条件为42°C下反应15分钟，95°C下反应2分钟。所述步骤(2)中的PCR反应中所使用的引物序列为上游引物见序列表SEQ IDN02 ;下游引物见序列表SEQ ID NO. 3。 所述步骤(2)中的PCR反应条件为95°C下反应10秒进行一次；95°C下反应5秒和62°C下反应5秒循环进行40次。所述步骤⑵中的PCR反应中融解曲解条件95°C下反应15秒；60°C下反应I分钟;60°C升温至95°C，每隔10秒升O. 30C ο拟穴青蟹胰蛋白酶基因的序列已在申请号201010102137X本发明涉及一种拟穴青蟹胰蛋白酶基因应用于预测蜕壳周期的方法，包括(1)抽提总RNA，鉴定总RNA质量，测定RNA含量；(2)测定胰蛋白酶基因的相对表达水平；(3)对需要检测的拟穴青蟹的幼体的胰蛋白酶基因相对表达水平进行检测，然后与溞状幼体I期的相对表达水平相除得出平均值，以此预测蜕壳周期。本发明工艺简单，成本低，能够预测青蟹种苗繁育过程中的蜕壳周期，以满足人们对青蟹生活周期的掌握以及遗传育种中的选用，减少饵料消耗量，提高种苗成活率，从而优化育苗过程。

公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月9日 优先权日2012年4月9日