专利名称：一种治疗大肠癌的药物的制作方法大肠癌为结肠癌和直肠癌的总称，是指大肠粘膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的恶性病变，即大肠粘膜上皮起源的恶性肿瘤，和最常见的消化道恶性肿瘤之一，预后差、死亡率高。据不完全统计，2005年，大肠癌已成为发病率第二位的恶性肿瘤。关于大肠癌发病率年龄方面资料，据国内统计，以4(T50岁为主，但40岁以下者占全部病例的1/3左右，而且我国大肠癌好发年龄比国外提早1(T15岁，30岁以下者占119^13%，尤其是，随着流行病学研究的深入，大肠癌与遗传相关的证据越来越多。因此，大肠癌的治疗不容忽视。早期切除癌肿是根治大肠癌的一种有效方法，但是癌症一般不易早期发现，使得外科手术的效果大大降低；化学药物治疗方法的复发率高，治疗后仍有50%比例复发和转移,而且对人体危害大；放射治疗通常作为手术和化疗的辅助手段，疗效并不能令人满意；冷冻疗法也能够有效杀伤和破坏肿瘤组织，但会带来巨大的痛苦，需要酌情使用。为了研究治疗大肠癌的药物和方法，人们付出了大量的努力，并获得了一些成果。其中，中药如专利CN1806841A公开了一种用于治疗胃癌、大肠癌与直肠癌的药物，采用丹参、半夏、鸡内金等中药材文火敖浓取汁制备得到；西药如专利W02009/089900A1公开了一种咪唑喹啉衍生物，能够调节局部用药进行早期结肠癌、直肠癌的治疗；专利CN101292992A公开的用于治疗大肠癌的药物组合物，采用5-氮脱氧胞苷和雷帕霉素的组合物作为活性成分；专利W02010/ 143986A1公开的一种大肠癌的组合疗法，采用维生素D衍生物进行食疗、细胞抑制剂、5-氟尿嘧啶和/或其前体作为药物治疗。但是传统药物在治疗大肠癌的应用中，或副作用大，或效果差，难以令人满意。随着生物技术的发展，新的治疗大肠癌的药物和方法引起了人们的广泛关注，专利JP2009-278976(A)公开了一种用于治疗结肠癌的基因和多肽，主要是人类基因WDRPUH、LRZFPUH、PPILI和APCDDl编码的基因和多肽用来检测细胞病变和用来制备治疗结肠癌的药物；专利US2010/0284918A1公开了一种治疗癌症的方法和组合物，采用整合素3 4、亲和试剂(如抗体)与载体或稀释剂组合得到治疗胃癌、大肠癌等的药物；专利US2010/0310559A1公开了一种重组单克隆抗体，组成主要包括含有如下氨基酸序列的⑶R(互补决定区)SASSSISYMY, DTSKLAS, HQRDSYPffT, SKFGVN、VIffGDGSTSYNSGLIS, CVKPGGDY。RNA干扰现象的发现是近些年来生物学的最重要进展，RNA干扰技术(RNAi)是把与内源mRNA编码区同源的小片段外源双链RNA导入细胞中，导致特定基因沉默的一种技术，能够在哺乳动物中灭活或降低特异性基因的表达，产生类似于基因敲除的效应；目前作为HIV相关淋巴瘤、AMD等人类疾病的可能治疗手段，RNA干扰技术的相关研究已经进入了I期和II期临床试验，无疑为实体肿瘤的治疗开辟了新的途径。而关于采用RNA干扰技术制备治疗大肠癌药物方面的研究也有一些报道，如冉志华等人在《RNA干扰介导转化生长因子P I沉默抑制大肠癌细胞生长》(《中华消化杂志》2006年第3期，167^170页)一文中报道了用小片段TGFP I的双链RNA (siRNA)转染大肠癌HCT116细胞，能够抑制肿瘤细胞TGFP I的表达；袁超君等人在《RNA干扰技术对大肠癌细胞人端粒酶逆转录酶基因的抑制作用》(《中华实验外科杂志》2009年第4期)一文中报道了靶向于hTERT的siRNA能特异性沉默大肠癌细胞hTERT基因和抑制癌细胞生长增殖，从而促进大肠癌细胞凋亡；孙海波等人在《RNA干扰沉默STAT3基因表达对人体大肠癌细胞生物学行为的影响》(《中国老年学杂志》2010年第30卷第17期)一文中公开了 pSilencer 3. 0 Hl siRNA STAT3重组质粒对大肠癌细胞的增殖具有明显的抑制作用；专利CN101606948A公开的一种小干扰RNA在制备治疗大肠癌药物中的应用，主要采用能够抑制mTOR基因表达的siRNA作为活性成分。但是大肠癌的发病原因并不明确，因此上述技术并不能彻底解决大肠癌的治疗难题，对治疗大肠癌药物和方法的进一步研究仍然是重要的课题。
本发明提供了一种治疗大肠癌的药物,通过RNA干扰技术抑制Gankyrin (Gannankyrin repeats,癌性锚蛋白重复序列,基因ID :5716)基因的表达,从而解决现有技术中采用化疗来治疗中晚期大肠癌时疗效以及患者预后均较差的技术问题，同时为治疗大肠癌提供了一种新的选择。本发明所述治疗大肠癌的药物，活性成分为能够抑制癌性锚蛋白重复序列(Gankyrin基因)表达的双链小干扰RNA中的一种或多种的任意混合物；或者活性成分为含有所述小干扰RNA的载体、细胞或宿主菌中的一种或多种的任意混合物；或者是所述小干扰RNA与所述载体、细胞或宿主菌的任意混合物。其中，本发明所述能够抑制Gankyrin基因表达，指的是所述小干扰RNA能够与Gankyrin基因mRNA核苷酸相结合，并切割、降解Gankyrin基因,进而抑制所述Gankyrin基因的表达；所述载体、细胞和宿主菌指的是本技术领域可用的载体、细胞和宿主菌，因此，本发明所述“能够抑制Gankyrin基因表达”和“载体、细胞和宿主菌”的含义对本领域技术人员来讲是明确的。其中，在所述小干扰RNA中，全长双链小干扰RNA含量优选为> 97%，即制备过程中，将所述小干扰RNA提纯至97% 100%。优选地,所述小干扰RNA为能够与Gankyrin基因mRNA结合的小干扰RNA中的一种或多种的任意混合物；并进一步优选为从第313、661或1381位点核苷酸开始结合的小干扰RNA中的一种或几种的任意混合物；尤其优选为从Gankyrin基因mRNA第1381位点核苷酸开始结合的小干扰RNA。本发明所述小干扰RNA由正义链(Sense Strand)和反义链(Antisense Strand)组成；一般情况下，所述正义链和反义链为23个碱基长度，本发明优选为21个碱基。其中，所述正义链的21个碱基是由19个碱基的基因靶序列在3’端加上两个碱基悬头得到，一般小干扰RNA正义链悬头可以为TT或UU (T为胸腺嘧啶，U为尿嘧啶)；所述反义链21个碱基与Gankyrin基因祀序列互补。 优选地，本发明治疗大肠癌的药物，活性成分包括如下小干扰RNA中的一种或几种的混合物正义链序列为SEQ ID NO :I、反义链序列为SEQ ID NO :2的小干扰RNA ；正义链序列为SEQ ID NO :3、反义链序列为SEQ ID NO :4的小干扰RNA ； 正义链序列为SEQ ID NO :5、反义链序列为SEQ ID NO 6的小干扰RNA。优选地，所述小干扰RNA进行2’ -甲氧修修饰，以增加小干扰RNA稳定性。其中，上述的治疗大肠癌的药物的剂型为冻干粉剂。所述冻干粉剂药物溶于溶剂中即可使用(如制成针剂)，所述溶剂可以是水、葡萄糖水溶液、生理盐水、或DEPC水(即焦碳酸二乙酯处理并高温高压消毒的MiliQ级纯水)。所述葡萄糖水溶液质量浓度优选为59TlO%。癌蛋白Gankyrin定位于人染色体Xq22. 3,由226个氨基酸组成,结构上形成7个ankyrin重复序列,编码蛋白质分子量为25 28KDa。Gankyrin可通过促进抑癌蛋白p53泛素化和Rb磷酸化而参与肿瘤的发生发展。由于抑癌基因p53和Rb在肿瘤生物学中发挥核心作用，这两条通路的失活是肿瘤形成的重要条件，因此Gankyrin作为p53和Rb共同的负调节物，可以成为肿瘤治疗的靶点。本发明使用能够抑制Gankyrin基因的小干扰RNA片段作为活性成分，制备了一种能够治疗大肠癌的药物。小干扰RNA转染入细胞后，即启动RNA干扰效应阶段，siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RISC) ；RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，并在距离siRNA的3’端12个碱基的位置切割mRNA。被切割后的断裂mR NA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RdRP)作用下合成更多新的双链RNA (dsRNA)，新合成的dsRNA再由胞质中的核酸内切酶(Dicer)切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。通过上述机理，本发明小干扰RNA制备的治疗大肠癌的药物，能够抑制大肠癌细胞增殖活力，阻滞大肠癌细胞生长周期，诱导大肠癌细胞凋亡，显著抑制P53蛋白泛素化(ubiquitination)和Rb蛋白磷酸化,对大肠癌移植瘤具有有效的治疗作用。同时RNA干扰技术尚未发现具有毒副作用，因此本发明制备的药物安全性更好。图I为本发明小干扰RNA静默Gankyrin蛋白表达检测结果 图2为本发明siRNA1381转染抑制大肠癌细胞增殖活力检测结果 图3为本发明siRNA1381转染诱导大肠癌细胞PARP蛋白剪切体(89kDa)形成检测结果 图4为本发明siRNA1381转染上调p53蛋白表达和抑制Rb蛋白磷酸化检测结果图； 图5为本发明siRNA1381转染抑制p53蛋白泛素化检测结果 图6为本发明siRNA1381抑制裸鼠大肠癌移植瘤生长检测结果 图7为本发明siRNA1381转染抑制裸鼠大肠癌移植瘤Gankyrin蛋白表达检测结果图。
从Gankyrin基因mRNA第313位点核苷酸结合的小干扰RNA (记为siRNA313)的分子量为13320. 74 (g/mole);其正义链和反义链序列(分别记为siRNA313_S和siRNA313_A)如下
siRNA313-S :GGUUG⑶CUCCUCUUCAUATT (SEQ ID NO :1);siRNA313-A UAUGAAGAGGAGACCAACCTG (SEQ ID NO :2)。实施例2
从Gankyrin基因mRNA第661位点核苷酸结合的小干扰RNA (记为siRNA661)的分子量为13331. 72 (g/mole);正义链和反义链序列(分别记为siRNA661_S和siRNA661_A)如下
siRNA661-S :GCCUGGGUUUAAUACUCAATT (SEQ ID NO :3)；s i RNA661 -A UUGAGUAUUAAACCCAGGCCA (SEQ ID NO :4)。实施例3
从Gankyrin基因mRNA第1381位点核苷酸结合的小干扰RNA (记为siRNA1381)的分子量为13275. 71 (g/mole);正义链和反义链序列(分别记为siRNA313_S和siRNA313_A)如下
siRNA1381-S GAAUGUCAAGCUUGUUAAATT (SEQ ID NO :5)；s i RNA1381 -A UUUAACAAGCUUGACAUUCTT (SEQ ID NO :6)。所述三种siRNA按照IS09000标准合成和生产，HPLC纯化至全长双链siRNA含量在979^100% ;为了增加稳定性，上述三种siRNA还可以进行2’ -甲氧修饰。将上述siRNA制成冻干粉剂，_20°C保存。冻干粉剂使用时用溶剂溶解制成针剂即可。
I.体外实验 实验材料
人大肠癌细胞系HCT116，SW1116，SW480, HT29 (均购自中科院细胞生化所)；RPMI1640培养基、McCOY’ S 5A培养基(均购自美国Sigma公司)； 上述三种siRNA (见表I )，及阴性对照(上海吉玛制药技术有限公司合成)；DharmaFECT 4 (T-2004-03)、DharmaFECT I (T-2004-03)小干扰 RNA 转染试剂，5倍稀释siRNA缓冲溶液(均购自Dharmacon公司)；Triton X-100,碘化丙唳(Sigma公司)；RNase A (Roche公司)；CCK_8试剂盒(日本同仁化学研究所)；免疫沉淀用Protein A/GPLUS-Agarose (sc-2003，Santa Cruz Biotechnolog 公司)；Annexin V /PI 双染色细胞凋亡检测试剂盒(Beckman公司)；试验所用抗体见表2 ；
化学发光检测用试剂盒Super Signal West Femto Maximum SensitivitySubstrate (34095) ；Super Signal West Pico Chemilu-minescent Substrate (34077)(Pierce 公司)；
细胞培养耗材(Greiner 公司);PVDF 膜 Milipore (Bedford 公司);8%SDS PAGE、12%SDSPAGE (PIERCE 公司)；酶标仪 Microplate Reader，Model 550 (Bio Rad 公司)；流式细胞仪 EPICS-XL (Beckman Coulter 公司)；蛋白电泳系统 Mini Protein II (BI0-RAD 公司)；超净工作台YJ-875 (苏州净化设备公司)；二氧化碳培养箱SHELLAB M0DEL2300 (SheldonManufacturing Inc 公司)；低温超速离心机 Eppendorf Centrifuge 5417R。


本发明涉及一种治疗大肠癌的药物，采用能够抑制Gankyrin基因表达的小干扰RNA作为活性成分，制成针剂或冻干粉剂。本发明制备的药物能够抑制大肠癌细胞增殖活力，阻滞大肠癌细胞生长周期，诱导大肠癌细胞凋亡，显著抑制p53蛋白泛素化和Rb蛋白磷酸化，对大肠癌移植瘤具有有效的治疗作用。