一种大肠癌筛查试剂盒的制作方法[0002]大肠癌，是最常见的恶性肿瘤之一，其在美国人肿瘤发病率中排名第五，在中国人肿瘤发病率中排名第四，是欧洲人第三大致死肿瘤疾病。当大肠癌处于早期时，其治愈率较高，大肠癌的早期筛查是成 功治疗和患者存活的关键，也是公共卫生领域的一大挑战。[0003]传统检测方法包括大便潜血实验、乙状结肠镜检查、结肠镜检查、双重对比钡餐检查和直肠指检。这些检查的患者依从性低，操作复杂。需要寻找患者依从性高，操作简便的方法。[0004]寻找外周血中的生物标志物，检测大肠癌是近年来比较热门的方法。Han等比较101例大肠癌和110例对照的外周血基因表达谱，构建基于5个基因的预测模型，模型的敏感度和特异度分别为88%和64% (Han M, Liew C T, Zhang H W，et al.Novelblood-based, five-gene biomarker set for the detection of colorectal cancer[J].Clin Cancer Res, 2008，14(2):455-460.)。Marshall 等从 314 例大肠癌和 328 例正常对照研究中发现7个显著基因，预测模型的敏感度和特异度分别为72%和70% (Marshall K W,Mohr S，Khettabi F E，et al.A blood-based biomarker panel for stratifying currentrisk for colorectal cancer[J].1nt J Cancer，2010，126(5):1177-1186);Rosenthal 等比较314例大肠癌和328例正常对照的外周血基因表达谱，构建了 202个显著基因的预测模型，模型的敏感度和特异度分别为90%和88% (Rosenthal A, Nuernberg D，Pross M，etal.Detector-C:A blood-based IVD with high sensitivity and specificity for earlydetection of colorectal cancer[J].J Clin 0ncol28:15s，2010(suppl;abstr3580)o 上述检测方法中，检测基因数目较少时，敏感度和特异度低，而敏感度和特异度较高时，检测基因数目过大,成本高。
[0005]为了解决上述问题，本发明提供了一种新的大肠癌筛查试剂盒。[0006]一种大肠癌筛查试剂盒，它包括检测如下18个基因中的任意一个或者多个基因的表达水平的相关试剂:DUSP2，如SEQ ID N0:1所示;NEAT1，如SEQ ID N0:2所示；MYBLl,如 SEQ ID N0:3 或者 4 所示；ITGAM，如 SEQ ID NO: 5 或者 6 所示；P2RY10，如 SEQ ID NO: 7或者 8 所示；GZMB，如 SEQ ID NO:9 所示；SH2D2A，如 SEQ ID NO: 10、11、12 或者 13 所示;PDE4D，如 SEQ ID NO: 14、15、16、17、18、19、20、21 或者 22 所示；FAM198B，如 SEQ ID NO: 23、24 或者 25 所示；GLT2OT2，如 SEQ ID NO: 26 所示；CD36，如 SEQ ID NO: 27、28、29、30 或者31所示；NUDT16 JnSEQ ID NO: 32 或者 33 所示;FKBP5 JnSEQ ID NO: 34、35 或者 36 所示;ITPRIPL2，如 SEQ ID NO:37所示；IL1B，如 SEQ ID N0:38所示;DHRS13，如 SEQ ID N0:39所示；PDZK1IP1，如 SEQ ID NO: 40 所示；VSIG10，如 SEQ ID NO: 41 所示。[0007]其中，所述试剂为检测所述基因转录的RNA，特别是mRNA的量的试剂。
[0008]其中，所述试剂为检测与所述mRNA互补的cDNA的量的试剂。
[0009]其中，所述试剂为检测与所述cDNA互补的cRNA的量的试剂。
[0010]其中，所述试剂为探针。
[0011]其中，所述试剂为检测所述基因编码的多肽的量的试剂。
[0012]其中，所述试剂为抗体、抗体片段或者亲和性蛋白。
[0013]本发明还提供了如下18个基因中任意一个或者任意多个基因在制备大肠癌筛查试剂中的用途:DUSP2，如 SEQ ID N0:1 所示;NEAT1 JnSEQ ID N0:2 所示;MYBL1，如 SEQ IDN0:3或者4所示；ITGAM，如SEQ ID NO: 5 或者 6 所示；P2RY10 JnSEQ ID NO: 7 或者 8 所示；GZMB，如 SEQ ID NO: 9 所示；SH2D2A，如 SEQ ID NO: 10、11、12 或者 13 所示；PDE4D，如 SEQ IDN0:14、15、16、17、18、19、20、21 或者 22 所示;FAM198B，如 SEQ ID NO: 23、24 或者 25 所示；GLT25D2 JBSEQ ID NO: 26 所示；CD36，如 SEQ ID NO: 27、28、29、30 或者 31 所示；NUDT16，如 SEQ ID NO: 32 或者 33 所示;FKBP5 JnSEQ ID NO: 34、35 或者 36 所示；ITPRIPL2，如 SEQID N0:37 所示；IL1B，如 SEQ ID N0:38 所示;DHRS13，如 SEQ ID NO:39 所示；PDZK1IP1，如SEQ ID NO: 40 所示；VSIG10，如 SEQ ID NO: 41 所示。
[0014]其中，所述试剂是检测18个基因中的任意一个或者多个基因的表达水平的相关试剂。
`[0015]其中，所述试剂还包括大肠癌阳性样品和大肠癌阴性样品。
[0016]其中，所述试剂为检测所述基因转录的RNA，特别是mRNA的量的试剂。
[0017]其中，所述试剂为检测与所述mRNA互补的cDNA的量的试剂。
[0018]其中，所述试剂为检测与所述cDNA互补的cRNA的量的试剂。
[0019]其中，所述试剂为探针。
[0020]其中，所述试剂为检测所述基因编码的多肽的量的试剂。
[0021 ] 其中，所述试剂为抗体或者亲和性蛋白。
[0022]本发明检测人体样本，特别是人血液样本中基因表达的方法，包括:(I)测定受试者血样的基因组中任意一个或者任意多个基因转录的RNA的水平，所述基因组包括如下基因:DUSP2 JBSEQ ID NO:1 所示;NEAT1 JnSEQ ID NO: 2 所示;MYBL1 JnSEQ ID NO: 3 或者4 所示；ITGAMJn SEQ ID NO: 5 或者 6 所示；P2RY10，如 SEQ ID NO: 7 或者 8 所示;GZMB，如SEQ ID N0:9K*;SH2D2AjnSEQ ID NO: 10、11、12 或者 13 所示;PDE4D，如 SEQ ID NO: 14,15、16、17、18、19、20、21 或者 22 所示;FAM198B，如 SEQ ID NO: 23、24 或者 25 所示；GLT25D2,如 SEQ ID N0:26 所示；CD36，如 SEQ ID NO: 27、28、29、30 或者 31 所示；NUDT16，如 SEQ IDNO: 32 或者 33 所示;FKBP5 JBSEQ ID NO: 34、35 或者 36 所示；ITPRIPL2，如 SEQ ID NO: 37所示；IL1B，如 SEQ ID NO: 38 所示；DHRS13，如 SEQ ID NO: 39 所示；PDZKlIPl，如 SEQ IDNO: 40 所示；VSIG10，如 SEQ ID NO: 41 所示；
[0023](2)检测受试者血样中的基因表达。
[0024]优选地，所述步骤(1)是测定基因组中任意六个基因转录的RNA的水平。所述六个基因为 NEATl、FAM198B、ITGAM、MYBLl、PDZKITPI 和 VSIGlO。
[0025]优选地，所述步骤(1)是测定基因组中18个基因转录的RNA的水平。
[0026]其中，所述样本是大肠癌阳性样本。[0027]其中，所述样本是大肠癌阴性样本。
[0028]其中，所述步骤(1)使用至少一个寡核苷酸。
[0029]其中，一个寡核苷酸仅与一个基因转录的RNA杂交，和/或可以与所述基因转录的RNA互补的cDNA杂交。
[0030]其中，所述步骤(1)包括如下步骤:
[0031]a、扩增所述基因转录的RNA，得扩增产物；
[0032]b、使用至少一个引物检测步骤a所得扩增产物的量。
[0033]其中，所述步骤(1)包括如下步骤:
[0034]1、用至少一个探针与所述基因转录的RNA互补的cDNA杂交，得杂交产物；
[0035]?、检测步骤i所得杂交产物的量。
[0036]其中，所述步骤(1)包括扩增所述基因转录的RNA的方法。
[0037]其中，所述步骤(1)包括检测所述基因转录的RNA互补的cDNA的量的方法。
[0038]其中，所述步骤(1)至少使用一个探针。
[0039]其中，所述步骤(1)至少使用一个引物。
[0040]本发明寡核苷酸，它仅与一个基因转录的RNA杂交，和/或可以与所述基因转录的RNA互补的cDNA杂交，所述属于一个基因组的基因由如下基因组成:DUSP2，如SEQ ID NO:1所示；NEAT1，如 SEQ ID NO: 2 所示；MYBLl，如 SEQ ID NO: 3 或者 4 所示；ITGAM，如 SEQ IDN0:5或者6所示；P2RY10，如 SEQ ID N0:7或者8所示;GZMB，如 SEQ ID NO:9所示；SH2D2A，如SEQ ID N0:10、ll、12或者 13所示；PDE4D，如SEQ ID NO: 14、15、16、17、18、19、20、21 或者22所示；FAM198B，如 SEQ ID NO: 23、24或者 25 所示;GLT25D2，如 SEQ ID NO: 26所示；CD36，如 SEQ ID NO: 27、28、29、30 或者 31 所示;NUDT 16 JnSEQ ID NO: 32 或者 33 所示;FKBP5，如SEQ ID N0:34、35 或者 36 所示；ITPRIPL2，如 SEQ ID NO: 37 所示；IL1B，如 SEQ ID NO: 38所示；DHRS13，如 SEQ ID NO: 39 所示；PDZKlIPl，如 SEQ ID NO: 40 所示；VSIG10，如 SEQ IDN0:41所示。
[0041]所述的寡核苷酸选自SEQ ID N0.42~77所示的核苷酸序列。
[0042]本发明检测人体样本，特别是人血液样本中基因表达的试剂盒，包括18个基因的18种表达产物的特异配偶体，每个配偶体与每个基因特定配合，所述18个基因如下所示:DUSP2 JBSEQ ID NO:1 所示;NEAT1 JnSEQ ID NO: 2 所示;MYBL1 JnSEQ ID NO: 3 或者 4 所示；ITGAM，如 SEQ ID NO: 5 或者 6 所示；P2RY10，如 SEQ ID NO: 7 或者 8 所示;GZMB，如 SEQID N0:9 所示；SH2D2A，如 SEQ ID NO: 10、11、12 或者 13 所示;PDE4D JnSEQ ID N0:14、15、16、17、18、19、20、21 或者 22 所示；FAM198B,如 SEQ ID N0:23、24 或者 25 所示；GLT25D2,如 SEQ ID N0:26 所示；CD36，如 SEQ ID NO: 27、28、29、30 或者 31 所示；NUDT16，如 SEQ IDNO: 32 或者 33 所示;FKBP5 JBSEQ ID NO: 34、35 或者 36 所示；ITPRIPL2，如 SEQ ID NO: 37所示；IL1B，如 SEQ ID NO: 38 所示；DHRS13，如 SEQ ID NO: 39 所示；PDZKlIPl，如 SEQ IDNO: 40 所示；VSIG10，如 SEQ ID NO: 41 所示。
[0043]其中，所述特异配偶体是寡核苷酸，特别是探针和/或引物。
[0044]其中，所述特异配偶体选自SEQ ID N0.42~77所示的核苷酸序列的集合。
[0045]其中 ，所述特异配偶体包含抗体和/或亲和性蛋白。
[0046]本发明通过血液样本体外筛查人大肠癌患病风险的方法，它包括如下步骤:[0047]a)取血液样本，检测如下18个基因中任意一个或者任意多个基因的表达产物的量:DUSP2 JBSEQ ID NO:1 所示;NEAT1 JnSEQ ID NO: 2 所示;MYBL1 JnSEQ ID NO: 3 或者
4所示；ITGAM，如 SEQ ID NO: 5 或者 6 所示;P2RY10,如 SEQ ID NO: 7 或者 8 所示;GZMB，如SEQ ID N0:9K*;SH2D2AjnSEQ ID NO: 10、11、12 或者 13 所示;PDE4D，如 SEQ ID NO: 14,
15、16、17、18、19、20、21 或者 22 所示;FAM198B，如 SEQ ID NO: 23、24 或者 25 所示；GLT25D2,如 SEQ ID N0:26 所示；CD36，如 SEQ ID NO: 27、28、29、30 或者 31 所示；NUDT16，如 SEQ IDNO: 32 或者 33 所示;FKBP5 JBSEQ ID NO: 34、35 或者 36 所示；ITPRIPL2，如 SEQ ID NO: 37所示；IL1B，如 SEQ ID NO: 38 所示；DHRS13，如 SEQ ID NO: 39 所示；PDZKlIPl，如 SEQ IDNO: 40 所示；VSIG10，如 SEQ ID NO: 41 所示；
[0048]b)将步骤a)所得表达产物的量与大肠癌阳性样品以及大肠癌阴性样品的表达产物的量进行对比，所述大肠癌阳性样品来自确诊的大肠癌患者，所述大肠癌阴性样品来自已证实的非大肠癌个体；
[0049]c)根据步骤b)的分析结果作出判断:
[0050]如果步骤a)所得表达产物的量与大肠癌阳性样品的表达产物的量相近或相同，则诊断为大肠癌患者；
[0051]如果步骤a)所得表达产物的量与大肠癌阴性样品的表达产物的量相近或相同，则诊断为非大肠癌患者。
[0052]优选地，所述步骤a)是检测18个基因中任意6个基因的表达产物的量。所述6个基因为 NEATl、FAM198B、ITGAM、MYBLl、PDZKITPI 和 VSIGlO。
[0053]优选地，所述步骤a)是检测18个基因中每个基因的表达产物的量。
[0054]其中，所述步骤a)中，检测至少一个基因的表达产物的量是将所述基因的表达产物与该表达产物的特异配偶体接触。
[0055]其中，步骤a)中，检测基因的表达产物的量，所述基因的核酸序列选自SEQ IDNO:1~41所示序列集合。
[0056]其中，步骤a)所述表达产物包括至少一个RNA转录物或者一个多肽。
[0057]其中，所述表达产物包括至少一个mRNA。
[0058]其中，所述RNA转录物通过杂交、扩增或者测序的方法来检测和定量。
[0059]其中，所述RNA转录物在预设条件下与至少一个探针和/或至少一个引物接触，在预设条件下，所述探针和/或引物可以与RNA转录物杂交。
[0060]其中，与所述RNA转录物的cDNA在预设条件下与至少一个探针和/或至少一个引物接触，在预设条件下，所述探针和/或引物可以与cDNA杂交。
[0061]其中，所述多肽的检测是通过将多肽与至少一个特异配体接触来检测的，特别是与抗体或者亲和性蛋白接触。
[0062]其中，所述多肽与至少两个特异配体接触，特别是与两个抗体、两个亲和性蛋白或者一个抗体和一个亲和性蛋白接触。`
[0063]本发明通过血液样本体外筛查人大肠癌患病风险的试剂盒，包括18个基因中任意一个或者任意多个基因表达产物的特异配偶体，每个配偶体与每个基因特定配合，所述18个基因如下所示:DUSP2，如SEQ ID N0:1 所示;NEAT1，如SEQ ID N0:2所示;MYBL1 JnSEQID N0:3或者4所示；ITGAM，如SEQ ID NO: 5 或者 6 所示；P2RY10 JnSEQ ID NO: 7 或者 8 所示；GZMB，如 SEQ ID NO: 9所示；SH2D2A，如 SEQ ID NO: 10、11、12 或者 13所示;PDE4D，如 SEQID N0:14、15、16、17、18、19、20、21 或者 22 所示；FAM198B，如 SEQ ID NO: 23、24 或者 25 所示；GLT25D2 JBSEQ ID N0:26所示;CD36，如SEQ ID NO:27、28、29、30或者31 所示；NUDT16,如 SEQ ID NO: 32 或者 33 所示;FKBP5 JnSEQ ID NO: 34、35 或者 36 所示；ITPRIPL2，如 SEQID N0:37 所示；IL1B，如 SEQ ID NO: 38 所示；DHRS13，如 SEQ ID NO: 39 所示；PDZK1IP1，如SEQ ID NO: 40 所示；VSIG10，如 SEQ ID NO: 41 所示；
[0064]所述特异配偶体与基因的表达产物特异结合；
[0065]所述18个基因的核酸序列选自SEQ ID NO: 1~41所示序列的集合。
[0066]优选地，所述试剂盒包括18个基因中任意六个基因的表达产物的特异配偶体。所述六个基因为 NEATl、FAM198B、ITGAM、MYBLl、PDZKITPI 和 VSIGlO。
[0067]优选地，包括18个基因中每个基因的表达产物的特异配偶体。
[0068]其中，所述特异配偶体包括至少一个杂交探针。
[0069]其中，所述特异配偶体包括至少一个杂交探针和至少一个引物。
[0070]其中，所述特异配偶体包括至少一个杂交探针和两个引物。
[0071]其中，所述特异配偶体包括至少一个特异配体，特别是抗体或者亲和蛋白。
[0072]其中，所述特异配偶体包括至少两个特异配体，特别是两个抗体、两个亲和性蛋白或者一个抗体和一个亲和性蛋白。
[0073]本发明核酸序列如SEQ ID NO: 1~41所示的18个基因的表达产物的特异配偶体在制备体外筛查大肠癌患病风险的试剂中的用途，所述特异配偶体与18个基因的表达产物特异结合。
[0074]优选地，所述特异配偶体是18个基因中任意6个基因的表达产物的特异配偶体。所述六个基因为 NEATl、FAM198B、ITGAM、MYBLl、PDZKITPI 和 VSIGlO。
[0075]优选地，所述特异配偶体是18个基因中每个基因的表达产物的特异配偶体。其中，所述特异配偶体包括至少一个杂交探针。
[0076]其中，所述特异配偶体包括至少一个杂交探针和至少一个引物。
[0077]其中，所述特异配偶体包括至少一个杂交探针和两个引物。
[0078]其中，所述特异配偶体包括至少一个特异配体，特别是抗体或者亲和蛋白。
[0079]其中，所述特异配偶体包括至少两个特异配体，特别是两个抗体、两个亲和性蛋白或者一个抗体和一个亲和性蛋白。
[0080]本发明基因表达水平的检测可以通过检测RNA转录物来实现。
[0081 ] 术语“RNA转录物”是指总RNA，即编码或者非编码RNA，包括直接来自于外周血样本中，也包括间接来自于细胞裂解后的血液样本中的RNA。细胞裂解的方法可以采用申请号:W099/05338的专利申请公开的磁性和机械裂解方法，或者采用申请号:W099/53340的专利申请公开的磁裂解方法，或者采用申请号:W099/15321的专利申请公开的机械裂解方法，当然，也可以采用本领域公知的方法，如，热裂解、高渗透压裂解或者使用胍盐等裂解液的化学裂解方法。细胞裂解后，还需要将核酸从裂解步骤产生的其他细胞组成物中分离出来，通常来讲，离心即可纯化核酸。总RNA包含tRNA，mRNA和rRNA，其中，mRNA包括目标基因转录的mRNA，也包括来自于其他非目标基因的mRNA。
[0082]本发明中，RNA转录物可以通过杂交、扩增或者测序的方法来检测和量化。比如，将RNA转录物与探针或者引物杂交。[0083]术语“杂交是指在适当条件下，两个核酸片段通过稳定且特异的氢键结合，形成双螺旋复合物的过程。所述氢键存在于互补的腺嘌呤A和胸腺嘧啶T (或者尿嘧啶U)之间，简称A-T键，或者存在于互补的鸟嘌呤G和胞嘧啶C之间，简称G-C键。
[0084]两段核酸片段的杂交可能是完全的(即形成完全互补的核苷酸片段或者序列)，杂交过程中形成双螺旋复合物仅包含A-T键和G-C键；也可能是局部的(即形成充分互补的核苷酸片段或者序列)，杂交过程中形成双螺旋复合物包含A-T键和G-C键，使得其可以形成双螺旋结构，也包含未绑定到双螺旋复合物上的碱基。
[0085]两段核酸片段的杂交程度取决于杂交的反应条件，特别是严格程度。所述严格程度是指两个核酸片段的碱基组成函数，也指两个核酸片段的错配程度。严格程度取决于反应条件，比如，杂交溶液中，离子的浓度和种类，变性剂的性质和浓度，和/或杂交温度。这些条件是常规条件，本领域技术人员能确定合适的条件。通常来讲，根据待杂交核酸片段的长度，杂交温度在2(T70°C之间，优选在35~65°C之间，生理盐水的浓度在0.5~IM之间。
[0086]术语“扩增引物”，是指包含5~100个核苷酸的核酸片段，优选地，包含能起始酶促反应(比如，酶促扩增反应)的15~30个核苷酸。
[0087]术语“酶促扩增反应”是指通过在至少一种酶的作用下产生核酸片段多拷贝的过程。所述扩增反应是本领域公知常识，且在如下技术中被提及:美国专利N0.4，683，195、美国专利N0.4，683，202和美国专利N0.4，800，159中描述的PCR(多聚酶链式反应)，申请号为:EP0201184的专利申请中公开的LCR(连接酶链式反应)，申请号为:W090/01069的专利申请中公开的RCR (修复链式反应)，申请号为:W090/06995的专利申请中记载的3SR (自主序列复制)，申请号为:W091/02818的专利申请中记载的NASBA(依赖核酸序列的扩增技术)，美国专利N0.5，399，491中记载的TMA (转录介导的扩增)。
[0088]当酶促扩增反应为PCR时，扩增一个目标基因至少需要2个目标基因特异性的引物，保证扩增产物与目标基因特异性一致。如，扩增产物可以为目标基因mRNA逆转录制备的互补DNA (cDNA),或者，与该cDNA互补RNA (cRNA)。当酶促扩增反应是反转录酶介导的PCR,即为 RT-PCR。
[0089]术语“杂交探针”是指包括至少5个核苷酸的核酸序列，比如，包含5~100个核苷酸，其能在指定条件下与目标基因的表达产物或者该表达产物的扩增产物杂交形成复合物。在本发明中，所述目标基因的表达产物包含目标基因mRNA，所述目标表达产物的扩增产物包括与目标产物mRNA互补DNA cDNA或者与cDNA互补的cRNA。杂交探针上还包括用于检测的标志物。
[0090]术语“检测”是指计数方式等直接检测法和使用标志物方式等间接检测方法。目前，有很多用于核酸检测的方法(比如，Kricka et al., Clinical Chemistry, 1999, no45 (4),p.453-458or Keller G.H.et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections5and6, p.173-249 记载的方法)。
[0091]术语“标志物”是指可以产生能被检测的信号的示踪剂。示踪剂列表:包括产生能被侦测到的信号的酶，比如，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β -半乳糖苷酶，葡萄糖-6-磷酸或者脱氢酶，通过比色法，荧光或发光法检测；发色团，如荧光，发光，染料化合物；电子密度基团，通过电子显微镜或凭借其导电性等电学性能、由安培法、伏安法或者阻抗测量的方法检测；基团，通过光学方法，比如，衍射，表面等离子体共振，或接触角变化，或原子力光谱隧道效应等物理方法检测；放射性分子，比如32P，35S或者125I。
[0092]上述杂交探针是一种检测探针。检测探针被标志物标记的探针，如，Tyagi &Kramer (Nature biotech, 1996, 14:303-308)所述,检测探针具体是指“分子信标”检测探针。“分子信标”具有茎-环形结构，包括一个荧光基团和一个淬灭基团，当“分子信标”特异的环序列与其互补的目标基因的结合将会导致茎展开，并在适当的波长的激发过程中发射荧光。检测探针具体还包括“报告探针”，如NanoString?’s技术所示，其包括一个“颜色编码的条形码”。
[0093]检测探针包括荧光团和淬灭剂，如，6-羧基-荧光素或者6-羧基-X-罗丹明，3’末端有淬灭剂:4_ 二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯。
[0094]为了检测杂交反应，需要对目标序列进行标记，可以是直接标记，具体是在目标序列内部加入标志物，也可以是间接标记，即使用检测探针。具体是在杂交之前，实施包括标记和/或剪切目标序列的步骤，比如，在酶促扩增反应中使用被标记了的脱氧核糖核三磷酸。咪唑或者氯化锰可以达到剪切的作用。目标序列也可以在扩增步骤之后再标记，比如，通过申请号:W091/19812的专利申请文件中记载的三明治杂交技术杂交一个检测探针。另外一种优选的方法是申请号:FR2780059的专利申请文件中记载的标记核酸序列的方法。
[0095]上述杂交探针也是一种“捕获”探针。“捕获”探针可以通过任何适合的方法，直接地或者间接地固定在固体基质上，比如，通过共价键结合或者吸附。所述固体基质，可以是合成材料，也可以是化学修饰或者非化学修饰的天然材料，具体可以是多糖，如，基于纤维素的材料、葡聚糖、共聚物和聚合物，基于纤维素的材料包含纸、纤维素衍生物，纤维素衍生物包括醋酸纤维素、硝酸纤维素；可以是苯乙烯型单、棉等天然纤维或者等合成纤维；可以是无机材料，如，二氧化硅、石英、玻璃或者陶瓷；还可以是乳胶、磁性粒子、金属衍生工具、凝胶等。固体基质可以是微量滴定板，可以是申请号:W0-A-94/12670的专利申请文件中的固定膜，也可以是颗粒。针对每个目标基因，也可以在基质上固定不同捕获探针，具体地，一个能够固定大量探针的基因芯 片作为基质即可以实现。“基因芯片”是指很微小但固定了许多捕获探针的固体基质，捕获探针固定在预定位置上。
[0096]基因芯片，或者说DNA芯片的概念可以追溯到20世纪90年代初。它基于多学科技术，结合了微电子技术，核酸化学，图像分析和信息技术。它的工作原理是分子生物的基础:杂交现象，即，两个DNA或者RNA序列的互补配对。基因芯片的方法基于固定在固体基质上的捕获探针，直接或者间接荧光素标记的目标核酸片段的样本可以与该探针相互作用。捕获探针特异的固定在基质或者芯片上，每个杂交均可以给出一条与目标基因相关的特定信息。特定信息的集合使得计量一个或者多个目标基因的表达水平成为可能。为了分析目标基因的表达水平，需要准备包含大量探针的基质，这些探针与所有或者部分转录为mRNA的目标基因相关。其中，“低密度基质”是指包含的探针低于50个的基质，“中等密度基质”是指包含的探针数量为50-10000的基质，“高密度基质”是指包含超过10000个探针的基质。
[0097]目标基因的cRNA或者cDNA与特定的捕获探针杂交后,清洗芯片或者基质,被标记的cDNA或者cRNA与捕获探针的复合物可以通过绑定了荧光标签的高亲和力配体显示出来。并通过信息技术作出分析荧光，得出结果。进行分子诊断时，不得不提Affymetrix公司制备的 DNA 芯片(("Accessing Genetic Information with High-Density DNAarrays", M.Chee et al., Science, 1996, 274, 610-614.^Light-generated ligonucleotidearrays for rapid DNA sequence analysis", A.Caviani Pease et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1994，91，5022-5026)，在该技术中，捕获探针往往很小，含有25个左右的核苷酸。其他一些生物芯片分别在如下文献中公开:G.Ramsay, Nature Biotechnology, 1998, N0.1
6,p.40-44;F.Ginot, Human Mutation, 1997, N0.10, p.1-10;J.Cheng et al, Molecular diagnosis,1996, N0.1(3), p.183-200;T.Livache et al, Nucleic Acids Research, 1994, N0.22 (15), p.2915-2921J.Cheng et al, Nature Biotechnology, 1998，N0.16，p.541-546,或者在美国专利N0.4，981，783、美国专利N0.5，700，637、美国专利N0.5，445，934、美国专利N0.5，744，305和美国专利N0.5，807，522中。固体基质的主要特征是保守捕获探针与目标核酸片段的杂交，但产生的背景噪音却很小。
[0098]捕获探针固定在基质上的方式主要有二种:
[0099]1、将预先合成的探针布放于玻片载体上。通过微量、缩微或喷墨装置，这种探针可以被直接附着到芯片上。这个技术允许附着的探针具有一系列大小不等的碱基，从几个碱基(5~10个)，到较大尺寸的60个碱基(印刷)，再到几百个碱基(微印刷)。
[0100]所述印刷与打印机的方式相似，是基于小球体流体以4000转/s的速度推进。所述微印刷包括将含有几十到几百个碱基的长探针附着到玻璃载片表面上。这些探针通常来自于数据库，是扩增和纯化的产物。DNA可以处在小于4cm2大小的面积范围内，制备得到微阵列芯片，微阵列可以携带大约I万个识别区域的斑点。使用直径为0.5^1mm的尼龙膜，携带扩增的产物(通常是PCR扩增的)，称为巨阵列，其最大密度为25斑点/cm2。许多实验室采用该技术。本发明中，微印刷技术是包含生物芯片的，如申请号:W0-A-00/71750或者FR00/14896的专利申请文件所示，一定体积的样品可以沉积在微量滴定板的底部，或者依照如申请号:FR 00/14691的专利申请文件，一定数目的其他液滴能够沉积在微量滴定板或者裴氏培养皿底部。
[0101]2、第二种在基质和芯片上附着芯片方法是原位杂交。这种技术在芯片表面直接产生短探针。该技术基于原位寡核苷酸合成(详见申请号:W089/10977和申请号:W090/03382的专利申请文件)和寡核苷酸合成程序。它包括一个移动的反应室，在该反应室中，寡核苷酸衍生反应可以沿着玻璃表面进行。
[0102]3、第三种技术叫做光刻，即Affymetrix公司开发的专门用于基因芯片的程序。它也是一种原位杂交技术，来自于微处理器技术。具体地，芯片表面被附着物活化，附着物是能够被光活化的不稳定化学基团。这些基团一旦被活化就可以与寡核苷酸序列的3’末端反应。通过在芯片表面用预定形状掩膜掩盖的方式可以选择性的活化和激活芯片区域，在该掩盖区域，可以结合四种核苷酸一个或者其他。不同掩膜的成功使用使得保护/反应可以交替循环，因而可以在大小约几十平方微米的斑点产生寡核苷酸探针。该方式可以在几平方厘米的表面区域产生成百上千的斑点。光刻的优点:可以通过4倍N循环产生N-mers的芯片。
[0103]扩增检测目标基因的表达水平包括如下步骤:(I)提取全血的总RNA(包括tRNAs、rRNAs和mRNAs),逆转录得到所述mRNAs的cDNA。逆转录反应是通过逆转录酶实现的，比如，来自于禽骨髓母细胞瘤病毒AMV或者来自于莫洛尼鼠白血病病毒MMLV逆转录酶。若希望仅仅得到mRNAs的cDNA，应当在仅有胸腺嘧啶时逆转录，胸腺嘧啶与含有polyA的mRNA序列杂交形成polyA-polyT复合物,该复合物作为逆转录的起始点，即可得到目标基因特定的cDNAs和非目标基因特定的cDNAs。(2)将目标基因的引物与步骤(1)得到的cDNAs混合。引物会与目标基因cDNAs杂交，特异性的扩来自于目标基因的cDNAs，非目标基因cDNAs则不会扩增，从而得到得到大量目标基因特异的cDNAs。依照本发明的目的，目标基因特异的cDNAs与源自目标基因来源的mRNAs的cDNA。本步骤可以通过通过PCR扩增更或者其他上述定义的扩增方式来实现。若用PCR进行扩增，可以使用多对引物多重PCR同时扩增多个目标基因。(3)检测或者定量步骤(2)得到的目标基因cDNAs来测定目标基因的表达水平。可以根据获得的特定目标基因cDNAs电泳距离，按照它们的分子量大小来检测。电泳检测时，迁移的凝胶和介质包括溴化乙锭，经过一段时间的迁移后，在紫外光下检测电泳条带，即可直接确定目标基因特异性的cDNAs的表达，目标基因特异性的cDNAs的表达量越高，电泳条带就越亮。电泳技术是本领域的公知常识。还可以用表达量的范围来确定，考虑到各个步骤中酶效率的多样性，目标基因的表达可以通“管家”基因来校正，“管家”基因在正常人中也有表达。通过确定目标基因和管家基因的比值来检测，即目标基因特异性的cDNAs的表达量与管家基因特异性的cDNAs的表达量的比值，实验间的多样性就可以得到校正。本领域技术人员所知晓的该技术记载在如下出版物:Bustin SA, J Mol Endocrinol，2002，29:23-39;Giulietti A Methods, 2001，25:386-401。
[0104]杂交检测目标基因表达的步骤如下:(I)同上述方法步骤(I )，提取全血的总RNA，逆转录得到所述mRNAs的cDNAs,该mRNAs包括目标基因的mRNAs,也包括非目标基因的mRNAs。(2)将cDNAs与固定了目标基因特异性的捕获探针的基质混合，目标基因特异性的捕获探针将与目标基因特异性的cDNAs发生杂交反应，而与非目标基因特异性的cDNAs不发生杂交反应。杂交反应可以在包括前述提到的所有材料的固体基质上进行。在本发明优选实施例中，基质是前述定义的低、中或者高密度基质。在杂交反应之前，可以先用前述方法对目标基因特异性的cDNAs进行扩增，以提高杂交的可能性。在杂交反应之前还可以先对目标基因特异性的cDNAs按照前述方法进行标记和/或剪切，如，在扩增反应中使用被标记的脱氧核苷三磷酸。剪切可以使用咪唑和氯化锰。目标基因特异性的cDNAs也可以在扩增步骤完成后再标记，比如，通过W0-A-91/19812描述的三明治杂交技术杂交一个标记的探针。另一个优选的标记和/或剪切核酸的方法如申请号:W099/65926，W001/44507, W001/44506, W002/090584或者W002/090319的专利申请文件所示。(3)检测杂交反应的结果。检测是通过将基质与带有标签的检测探针混合后，检测标签发出的信号实现的，所述基质上带有目标基因特异性的捕获探针，该探针可以与目标基因特异性的cDNAs杂交。若之前已经对目标基因特异性的cDNAs进行标记，则直接检测即可。
[0105]杂交检测目标基因表达还可以使用如下方法:(1)同上述方法步骤(I )，提取全血的总RNA，逆转录得到该生物材料mRNAs的cDNAs。使用T7聚合酶，在启动子的作用下，使cDNA的互补RNA发生聚合，得到以DNA为模版的互补RNA (cRNA)。得到包含目标基因特异性cRNAs与非目标基因特异性的cRNAs的混合物。(2)将cRNAs与固定了目标基因特异性的捕获探针的基质混合，目标基因特异性的捕获探针将与目标基因特异性的cRNAs发生杂交反应，而与非目标基因特异性的cRNAs不发生杂交反应。通过在基质上同时固定不同的捕获探针(一个探针与一个目标基因对应)，可以同时检测不同目标基因的表达水平。在杂交反应之前也可以先对目标基因特异性的cRNAs按照前述方法进行标记和/或剪切。(3)检测杂交反应的结果。检测是通过将基质与带有标签的检测探针混合后，检测标签发出的信号实现的，所述基质上带有目标基因特异性的捕获探针，该探针可以与目标基因特异性的cRNAs杂交。若之前已经对目标基因特异性的cRNAs进行标记，则直接检测即可。当基质上有大量探针时，cRNA的优势尤其明显。
[0106]本发明基因表达水平的检测可以通过检测多肽来实现。具体是将多肽与至少一种特定配体相结合。前述试剂为检测所述基因编码的多肽的量的试剂。
[0107]优选地，所述试剂为抗体或者亲和性蛋白。
[0108]在本发明优选实施例中，是将表达的多肽与至少两个特定配体结合。本发明特定配体可以是抗体或者名叫“NanofitinTM”的亲和蛋白。
[0109]所述“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体和重组抗体，它们的制备方法是本领域公知常识。
[0110]本发明提供的试剂盒可以准确检测待检样本患大肠癌的可能性，并且操作简单，仅需血液检查，患者依从性高，为临床大肠癌的筛查提供了一种新的选择，具有良好的工业应用前景。
[0111]显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0112]以下通过实施例形式的



[0113]图1 6个基因同时检测的ROC曲线。
[0114]图2测试集样本的18个基因标志物的检测结果。
[0115]图3 18个基因同时检测的ROC曲线。
【具体实施方式】
[0116]实施例1样本采集
[0117]经过知情同意，外周血样本来自于187例经过临床病理诊断确诊的大肠癌患者(CRC)和173例结肠镜检查阴性对照组患者(CNC)，采集于2006~2010年间。
[0118]CRC招募于中国复旦大学上海癌症中心结直肠外科，均按照国际抗癌联盟(UICC)建议的TNM分期系统进行分期。患者均未接受术前化疗或者放疗。患有遗传性结直肠癌或炎症性肠道疾病(Corhn病或溃疡性结肠炎)的患者被排除在本发明之外。CNCs招募于上海社区医院，通过结肠镜检查，没有任何大肠癌或者息肉的症状。检测样本的人口特征和临床特征如表1所示:
[0119]表1检测样本的特征